AULA 6 Reações precipitação, IFA, citometria, RIA

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IMUNODIAGNÓSTICO
Precipitação
IFA
Citometria de fluxo
RIA
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MÉTODOS
Reagentes não marcados
Reação de precipitação
Reação de aglutinação
2) Reagentes marcados
RIA
ELISA 
Imunofluorescência
Western Blotting
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MÉTODOS
PRECIPITAÇÃO
- Imunodifusão simples
- Imunodifusão dupla 
- Imunodifusão radial simples e dupla
- Imunoeletroforese
AGLUTINAÇÃO
- Aglutinação direta e indireta
- Inibição da aglutinação
- Teste de Coombs
IMUNOENSAIOS
- RIA
- ELISA 
- Imunofluorescência (IFA) e Citometria de Fluxo
Western Blotting
APLICAÇÕES
- Pesquisa 
- Diagnóstico
- Soroepidemiologia
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PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO
 Precipitação:
Formação de complexos Ag/Ac.
 Aglutinação:
É o agrupamento de partículas, usualmente por moléculas de Ac que se ligam a Ag na superfície de partículas adjacentes. 
 As reações de precipitação e de aglutinação decorrem, respectivamente da ligação entre o Ac e Ag solúvel e particulado. 
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REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO
Interação entre Ac e Ag solúvel 
Ac precisa ser bivalente
Ag precisa ser bi ou polivalente
A reação pode ser afetada pelo n° de sítios de ligação que cada Ac possui para seu Ag 	VALÊNCIA
 
PRECIPITADO
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É importante levar-se em conta como ocorre a ligação Ag-Ac em diferentes concentrações dos mesmos. Observe abaixo: 
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TÉCNICAS DE PRECIPITAÇÃO EM GEL
IMUNODIFUSÃO
(baseia-se na difusão de substâncias solúveis por movimentos ao acaso em meio gelificado)
 Imunodifusão simples linear:
- SIMPLES: Migração só de um produto enquanto o outro fica preso no gel
- LINEAR: Migração em só uma direção
 
 - O anti-soro é incorporado ao ágar > o antígeno é colocado no topo do tubo > tubos são selados > colocados a temperaturas constantes por ± uma semana > ocorre a difusão do ag. No gel > visualização do precipitado
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TÉCNICAS DE PRECIPITAÇÃO EM GEL
IMUNODIFUSÃO
 Coloca-se agarose sobre uma lâmina:
Imunodifusão Dupla linear: Migração dos dois produtos um em direção ao outro
 Faz-se em seguida, pequenos orifícios no gel e são adicionadas as soluções testes de Ag e Ac, como por exemplo, é mostrado abaixo: 
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IMUNODIFUSÃO DUPLA
As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela formação de uma linha de precipitação: 
Pode ser visualizada após a lavagem do gel , para remoção das proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com corante
Migração dos dois produtos simultaneamente
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RADIAL: Migração em todas as direções
 - Simples: migração de um só produto
 -Dupla: Migração dos dois produtos
O processo continua até ser atingida a zona de equivalência, com os complexos precipitando-se em um anel (halo) em torno do orifício.
IMUNODIFUSÃO RADIAL SIMPLES E DUPLA
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Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica. 
As moléculas migram para o pólo positivo ou negativo, distribuindo-se no gel de acordo com o seu PM e cargas elétricas. 
Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se difunde. 
Ag e Ac formam arcos de precipitação.
IMUNOELETROFORESE
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Reagentes marcados (enzimas, fluorocromos, isótopos)
Tipos:
RIA
ELISA
IFA / CITOMETRIA DE FLUXO
WESTERN BLOTTING
IMUNOENSAIOS
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Princípio da técnica: 
 
Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente) a uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por radiações UV, emite luz no espectro visível. 
Assim, como a ligação Ag-Ac é específica, um anticorpo conjugado pode ser usado para detectar um determinado antígeno e vice-versa. 
A reação é feita em lâminas de microscopia (um pouco mais finas que as comuns) e a observação tem lugar num microscópio com luz UV (microscópio de fluorescência). 
 Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT). Tipos: direta, indireta ou saduíche.
IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA) 
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IFA direta:
Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais.
IFA indireta:
Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a Doença de Chagas, SIDA/AIDS, hepatites e complexos em doenças auto-imunes.
 
É uma técnica onde se consegue alta sensibilidade (fluorescência é mais intensa) e especificidade. 
 
APLICAÇÃO DA TÉCNICA
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TIPOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA
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Microscópio de fluorescência
 luz UV atinge o material examinado
fluorescência emitida 
chega ao observador
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IMAGENS
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Ferramenta que detecta e quantifica células individuais passando em uma corrente através de um feixe de Laser.
Separa as células por fluorescência ativada.
Cada anticorpo pode ser marcado com um fluorocromo diferente.
É um teste qualitativo e quantitativo.
APLICAÇÕES
Tipo de linfócitos;
Quantidade, tamanho, granulosidade;
Isolamento de populações celulares;
CITOMETRIA DE FLUXO 
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RADIOIMUNOENSAIO - RIA 
Marcações:
I125: emite raios gama
H3: raios beta 
Reprodutibilidade, especificidade e sensibilidade (em torno de 10-12g)
Desvantagem a manipulação de isótopo radioativo.
Aplicações:
Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue, Hormônios,
 proteínas séricas, drogas, vitaminas e Ac. Pesquisa