conceitos hplc 2010

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CONSELHO REGIONAL DE
QUÍMICA - IV REGIÃO (SP)
Ministrante: Ayrton Argenton
CEP Curso
Contatos: ayrtonargenton@hotmail.com
São José do Rio Preto, 29 de maio de 2010
Conceitos fundamentais de
Cromatografia a líquido de
Alto Desempenho (HPLC)
Apoio
Observação: A versão original desta apresentação, com slides coloridos, no formato
PDF, está disponível na seção downloads do site do CRQ-IV (www.crq4.org.br)
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Conceitos fundamentais de HPLC
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
CONCEITOS DE CROMATOGRAFIA A LÍQUIDO
DE ALTO DESEMPENHO(HPLC)
AYRTON ARGENTON
Prof. Ayrton Argenton: Químico formado pela USP. Pesquisador Sênior pela
REPUSA – Petrobrás, Chefe do Centro de Pesquisa da Oxiteno, Chefe de
Pesquisas e Laboratório da CGS Instrumentação Ltda. Ministrou
treinamentos técnicos para centenas de empresas brasileiras. Mais de 20
anos de experiência e especialização em treinamento de Cromatografia a
Líquido e a Gás em Inds. Químicas, Farmacêuticas, Alimentícias,
Destilarias e Usinas de Açúcar e Álcool e Empresas relacionadas.
Atualmente aplica Treinamentos e Consultoria pelo CEP CURSOS – Centro
de Educação Profissional – www.cepcursos.com
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Conceitos fundamentais de HPLC
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Nas indústrias químicas, farmacêuticas,
alimentícias, refinarias, petroquímicas,
laboratórios de análises clínicas,
ambiental e forense entre outras,
frequentemente é necessário separar,
isolar, purificar, identificar e quantificar
os componentes de misturas muitas
vezes bastante complexas.
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Conceitos fundamentais de HPLC
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SEPARAÇÃO
•Operação pela qual uma mistura é dividida em pelo menos duas frações com 
diferentes composições.
•É obtida por meios físicos embora reações químicas podem ser envolvidas no 
processo.
•Os métodos físico-quimicos de separação são baseados na utilização de alguma 
propriedade física das substâncias a serem separadas.
Exemplos:
TIPO DE SEPARAÇÃO PROPRIEDADE FÍSICA
Destilação fracionada Diferença de ponto de ebulição
Extração com solvente
Diferença na constante de distribuição 
(partição) dos componentes em dois 
solventes
Cromatografia Diferença de afinidade das substâncias por um material ativo ou adsorvente
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Conceitos fundamentais de HPLC
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IMPORTÂNCIA DA CROMATOGRAFIA
• Velocidade
• Poder de resolução
• Manuseio de pequenas quantidades de amostra (10-9 – 10-15g)
• Simplicidade da técnica
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EXEMPLOS DE CROMATOGRAMAS
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EXEMPLOS DE CROMATOGRAMAS
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Conceitos fundamentais de HPLC
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VISÃO GERAL DE CROMATOGRAFIA
O objetivo da cromatografia é separar individualmente os diversos
constituintes de uma mistura de substâncias seja para identificação,
quantificação ou obtenção da substância pura para os mais diversos fins.
Tal separação dá-se através da migração da amostra através de uma fase
estacionária por intermédio de um fluido (fase móvel).
Após a introdução da amostra no sistema cromatográfico, os
componentes da amostra se distribuem entre as duas fases e viajam mais
lentamente que a fase móvel devido ao efeito retardante da fase
estacionária.
O equilíbrio de distribuição determina a velocidade com a qual cada
componente migra através do sistema.
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COLUNA CROMATOGRÁFICA
CROMATOGRAMA
FLUXO
TEMPO
S
IN
A
L
DETECTOR
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DETECTOR
COLUNA CROMATOGRÁFICA
CROMATOGRAMA
FLUXO
TEMPO
S
IN
A
L
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DETECTOR
COLUNA CROMATOGRÁFICA
CROMATOGRAMA
FLUXO
TEMPO
S
IN
A
L
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DETECTOR
COLUNA CROMATOGRÁFICA
CROMATOGRAMA
FLUXO
TEMPO
S
IN
A
L
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DETECTOR
COLUNA CROMATOGRÁFICA
CROMATOGRAMA
FLUXO
TEMPO
S
IN
A
L
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CLASSIFICAÇÃO DOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
CROMATOGRAFIA
PLANAR EM COLUNA
LÍQUIDO
LÍQUIDO SÓLIDO FASE LIGADA
GÁS FLUIDOSUPERCRÍTICO LÍQUIDO
LÍQUIDO SÓLIDO FASE LIGADA SÓLIDO FASE LIGADA LÍQUIDO SÓLIDO FASE LIGADA
FASE
MÓVEL
FASE
ESTACIONÁRIA
TÉCNICA
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High Performance Liquid Chromatography
CLAD = Cromatografia a Líquido de Alto Desempenho
CLAE = Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência
DESCRIÇÃO GERAL DE HPLC
•A amostra é dissolvida em um solvente e introduzida na coluna cromatográfica 
preenchida com a fase estacionária (FE)
•Um solvente (FM) é bombeado com vazão constante e desloca os componentes 
da mistura através da coluna. Esses se distribuem entre as duas fases de acordo 
com suas afinidades
•As substâncias com maior afinidade com a FE movem-se mais lentamente. Já as 
substâncias com pouca afinidade com a FE movem-se mais rapidamente.
•Ao sair da coluna, os componentes passam por um detector que emite um sinal 
elétrico o qual é registrado, constituindo um cromatograma.
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EXEMPLOS DE CROMATOGRAMA HPLC
Mistura de aminoácidos
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High Performance Liquid Chromatography
APLICAÇÃO
HPLC é utilizada em análises de compostos não voláteis ou instáveis termicamente onde a
cromatografia a gás não pode ser utilizada.
Como cerca de 80% dos compostos apresentam essas características, o campo de aplicação de HPLC
é extremamente vasto.
Indústria Analitos
Alimentos
Açúcares, ácido ascórbico, ácido benzóico, 
parabenos, vitaminas, proteínas, peptídeos, 
aminoácidos
Tintas Resinas, Tensoativos, biocidas
Química Polímeros 
Clínicas Metabólitos, proteínas, peptídeos, aminoácidos
Farmacêutica Princípios ativos
ALGUNS EXEMPLOS DE APLICAÇÕES E ANALITOS
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COMPARATIVO HPLC / CG
Fator CG HPLC
Requisitos da amostra
Amostra ou derivado volátil
estável termicamente na 
temperatura de trabalho
Amostra solúvel na fase móvel
Tipo de Amostra
Gases, líquidos e sólidos
baixo peso molecular
Líquidos e sólidos
Iônicos ou covalentes
Baixo e alto peso molecular
Tempo de análise relativo Em geral mais rápidas que HPLC Em geralmais lentas que CG
Pratos teóricos por coluna Até 300000 Até 30000
Capacidade preparativa Pobre Boa
Sensibilidade 10-12 g (DIC / DCE)
10-9 g (UV)
10-15 g (coulométrico)
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RESERVATÓRIO
FASE MÓVEL
BOMBA
INJETOR COLUNA DETECTOR
AQUISIÇÃO
DE DADOS
INSTRUMENTAÇÃO EM HPLC
DIAGRAMA DE UM CROMATÓGRAFO A LÍQUIDO
O cromatógrafo a líquido é constituído dos seguintes componentes:
1. Reservatório e sistema de bombeamento da fase móvel
2. Sistema de introdução de amostra
3. Sistema analítico: coluna cromatográfica e termostato
4. Sistema de detecção (um ou mais detectores)
5. Sistema de registro e tratamento de dados.
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DIAGRAMA DETALHADO DE UM HPLC
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FOTO ILUSTRATIVA DE UM HPLC
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RESERVATÓRIO DA FASE MÓVEL
A figura abaixo ilustra o reservatório da fase móvel e seus componentes:
tampa de teflon
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CONSIDERAÇÃO IMPORTANTE 1:
A fase móvel não pode conter partículas para evitar danos à bomba, injetor e
coluna, logo é necessário filtração antes de armazenar a fase móvel no
reservatório.
A figura abaixo ilustra um filtro para HPLC:
A escolha do filtro é função da natureza da fase móvel. Usualmente utiliza-se
membranas de nylon (0,20 e 0,45 m), celulose (0,22 m) ou TEFLON (1 e 1,5
m)
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CONSIDERAÇÃO IMPORTANTE 2:
A fase móvel deve ser degaseificada para evitar a formação de bolhas no processo
de separação o que pode interferir no desempenho da análise.
As técnicas de degaseificação são:
Ultrasom
Refluxo com resistência de aquecimento
Vácuo (trompa d’água)
Purga com Hélio
Uso de membrana semipermeável e vácuo online.
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CONSIDERAÇÕES IMPORTANTES
Vazão constante é essencial para qualquer separação por HPLC. Alta pressão é necessária para
impulsionar o solvente através da coluna cromatográfica vencendo a enorme resistência imposta pela fase
estacionária.
•Normalmente se utiliza bombas recíprocas com um ou preferencialmente dois pistões o que minimiza
pulsação.
•Preferencialmente devem operar com programação de vazão e deve ser possível a interrupção do
processo em pressões fora dos limites máximos e mínimos pré-estabelecidos.
•É importante introduzir fatores de correção de compressibilidade para a fase móvel utilizada ainda que os
líquidos tenham baixa compressibilidade. Caso contrário, a vazão real pode diferir da selecionada.
BOMBA
CARACTERÍSTICAS PRINCIPAIS
• Leva a fase móvel desde o reservatório até a coluna
• Alta reprodutibilidade e exatidão
• Vazão contínua sem pulso de 0,01ml /min - 10ml /min
• Vazão constante independentemente da pressão
• Alta resistência à corrosão – inércia química a solventes comuns
• Opera a altas pressões (6000 psi)
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BOMBEAMENTO ISOCRÁTICO OU POR GRADIENTE
BOMBEAMENTO ISOCRÁTICO
A composição da fase móvel é mantida constante durante toda análise cromatográfica.
Nesse caso utiliza-se apenas uma bomba. A figura abaixo ilustra o equipamento
necessário para uma análise isocrática.
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BOMBEAMENTO POR GRADIENTE
Alguma análises necessitam alteração da composição da fase móvel, sem alteração da
vazão total, com a finalidade de diminuir tempo de análise e/ou melhorar a separação dos
componentes da amostra.
O bombeamento por gradiente pode ocorrer à baixa pressão ou a alta pressão.
No caso de baixa pressão utiliza-se uma única bomba e a seleção do solvente a ser
utilizado dá-se através de válvula de multiplas vias controladas pelo software do sistema.
Já no caso do bombeamento de alta pressão, cada solvente tem uma bomba específica.
A figura abaixo ilustra o equipamento necessário para o a análise por gradiente a baixa e
alta pressão.
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BOMBEAMENTO POR GRADIENTE BAIXA PRESSÃO
BOMBEAMENTO POR GRADIENTE ALTA PRESSÃO
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BOMBEAMENTO ISOCRÁTICO OU POR GRADIENTE
A figura abaixo ilustra dois cromatogramas obtidos por análises isocrática e por gradiente.
ISOCRÁTICA GRADIENTE 
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INJETOR
SISTEMA DE INTRODUÇÃO DE AMOSTRA
Em HPLC, a injeção de amostra é realizada com auxílio de válvulas especiais que
permitem introdução com grande precisão e exatidão de volumes que variam, em geral, de
5 a 20l. A figura abaixo, mostra um esquema de uma válvula típica nas posições de carga
e de injeção.
A amostra é introduzida na válvula com auxílio de uma microseringa com agulha sem ponta
e a injeção é efetuada pela rotação da válvula da posição de carga para a posição de
injeção.
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COLUNAS CROMATOGRÁFICAS
COLUNAS ANALÍTICAS E PRE-COLUNAS
A separação é efetuada nas colunas cromatográficas, feitas em aço e resistentes a altas 
pressões(até 500 atm)
Os tubos das colunas são preenchidos com a fase estacionária conveniente, geralmente
sílica ou seus derivados, com granulometria de 3, 5, 7 ou 10 m (em alguns casos, até de
1 m) de diâmetro médio.
Devido a queda de pressão elevada nos tubos, as colunas são relativamente curtas e de
paredes espessas.
COMPRIMENTO: 3 – 60 cm
DIÂMETRO INTERNO: 0,2 – 8 mm
As colunas normais apresentam diâmetro interno variando de 4 – 6 mm e comprimento
que depende da granulometria da fase estacionária como mostra a tabela abaixo.
Granulometria (m) Comprimento (cm)
3 - 5 10 – 15
7 – 10 Até 25 cm (em casos 
especiais, até 60 cm)
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COLUNAS CROMATOGRÁFICAS
COLUNAS ANALÍTICAS – CONSIDERAÇÕES IMPORTANTES:
•Como o tempo de retenção depende da temperatura, as colunas devem ser mantidas
termostatizadas em um forno onde pode-se selecionar a temperatura apropriada para a
separação.
•Para reduzir os custo dos solventes e aumentar sua eficiência, estão sendo introduzidas
colunas de diâmetro interno de 1 – 3 mm, de forma que possa operar-se com fluxos
menores o que resulta em diminuição substancial do custo de operação e aumento de
sensibilidade como ilustrado na figura abaixo.
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COLUNAS CROMATOGRÁFICAS
PRÉ-COLUNAS (GUARD COLUMNS)
SEMPRE USE PRÉ-COLUNAS PARA PROTEGER E AUMENTAR A VIDA DA COLUNA 
ANALÍTICA
CARACTERÍSTICAS PRINCIPAIS:
•Protege a coluna analítica contra contaminações químicas
•Mesmo material de empacotamento da coluna
•Comprimento Típico: 25 mm
•Descartáveis
O uso de pré-colunas é de importância vital para a vida útil da coluna analítica. A filtração da
fase móvel e da amostra nem sempre são suficientes para a eliminação de impurezas
prejudiciais à coluna. Dependendo das características da fase estacionária e da natureza da
amostra, pode acontecer o que se chama de “retenção irreversível”, ou seja, a afinidade do
contaminante pela coluna é tão grande que ele não elui, ficando retido nos primeiros
centímetros do empacotamento. Retido na cabeça da coluna, o contaminate pode provocar
perda da eficiência, aumento de pressão e cauda nos picos. Com o uso da pré-coluna, o
contaminante não atingirá a coluna analítica. Ao perceber os sintomas de contaminação (os
mais comuns são aumento de pressão e elevação no nível de ruído), o analista substitui a
pré-coluna, que em média custa 10 vezes menos que a coluna analítica.
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DETECTORES
O detector é um dispositivo conectado na saída da coluna que percebe a presença de componentes e emite um sinal 
elétrico a ser registrado na forma de um pico cuja área é proporcional a quantidade do componente analisado.
Um detector ideal deve possuir as seguintes características:
•Alta Sensibilidade
•Estabilidade
Mudanças de temperatura e vazão de fase móvel não devem alterar o sinal
•Reprodutibilidade
•Resposta Linear
A resposta do detector deve variar linearmente com a concentração do analito numa extensa faixa 
de concentração
•Resposta rápida aos analitos
•Não contribuir para o alargamento do pico
O volume da cela do detector deve ser o menor possível para evitar a perda de eficiência do sistema. 
Celas de baixo volume, contribuem positivamente com a sensibilidade.
•Confiabilidade
•Facilidade de manuseio
•Não destrutivo
Condição necessária para cromatografia preparativa
•Seletividade
Habilidade relativa de um detector medir um composto e não outro.
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DETECTORES
TIPOS DE DETECTORES
Os principais detectores utilizados em HPLC são:
•Índice de refração
•Espectrofotometira UV-Visível
•Fluorescência
•Eletroquímico
•Espectrometria de massa LC/MS
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DETECTORES
ÍNDICE DE REFRAÇÃO
No momento da passagem do analito pelo detector, pode ocorrer uma alteração do índice
de refração. Essa alteração em relação ao valor da fase móvel livre de analito é detectada.
A detecção só é possível quando o índice de refração do analito é diferente do IR da fase
móvel.
Esse detector é normalmente utilizado quando os analitos não absorvem na região de
comprimento de onda do UV-VIS.
Apresenta as seguintes desvantagens:
•baixa sensibilidade
•não permite a utilização em análises por gradiente (pois o IR varia com a composição da
fase móvel)
•temperatura deve ser constante (pois o IR varia com a temperatura)
APLICAÇÃO
Análises de carbohidratos e açúcares em geral.
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DETECTORES
ESPECTROFOTÔMETRO UV-Visível (UV-VIS)
Baseia-se na absorbância da luz pelo analito ao passar pelo detector.
É um detector seletivo pois só detecta os compostos que absorvem no comprimento de onda
em que o detector for ajustado.
É o detector mais utilizado em HPLC pois grande maioria das substâncias absorvem radiação
UV. Exemplos de substâncias são: olefinas, aromáticos, compostos contendo ligações C=O,
C=S, N=O.
CONSIDERAÇÕES IMPORTANTES:
•A fase móvel utilizada não pode absorver no comprimento de onda selecionado
•A pureza da fase móvel é extremamente importante (traços de impurezas podem absorver
intensamente no comprimento de onda utilizado): UTILIZAR SOLVENTES GRAU HPLC
TIPOS DE DETECTORES UV-VIS:
•Fotométricos – comprimento de onda fixo: 254nm e 280nm
•Espectrofotométricos – comprimento de onda variável: 00nm a190nm
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DETECTORES
ESPECTROFOTÔMETRO UV-Visível (UV-VIS)
TIPOS DE DETECTORES UV-VIS:
•Espectrofotométricos
•O comprimento de onda é variável entre 190nm e 800nm selecionado através do
monocromador (UV = lâmpada de deutério e VIS = lâmpada de tungstênio).
•Possui maior aplicação pois permite selecionar o comprimento de onda mais
adequado para os componentes a serem analisados.
•Maior sensibilidade: escolha do comprimento de onda de maior absorbância.
•Maior seletividade: escolha do comprimento de onda onde o soluto de interesse
absorve e outros não.
•Permite a utilização de análise por gradiente: escolha do comprimento de onda onde
os constituintes da fase móvel não apresentam variação de absorbância.
•Permite obter o espectro de absorbância de cada componente separado
interrompendo o fluxo da fase móvel e assim selecionar o melhor comprimento de
onda.
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DETECTORES
ESPECTROFOTÔMETRO UV-Visível (UV-VIS)
Como mostra o esquema do 
detector, o comprimento de onda é 
selecionado através do 
monocromador do feixe de luz 
emitido pela lâmpada de deutério 
ou tungstênio e incide na cela por 
onde passam os componentes da 
amostra que absorve parte da luz 
dependendo de sua absortividade 
molar e concentração. A quantidade 
de luz não absorvida é detectada 
pela fotomultiplicadora.
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40
DETECTORES
TIPOS DE DETECTORES UV-VIS:
•Espectrofotométricos (REDE DE DIODOS – DIODE ARRAY)
Nesse tipo de detector, toda luz passa pela cela. A luz emergente é dispersada em uma grade
holográfica e os comprimentos de onda resultantes são focalizados em uma rede de fotodiodos (256 a
1024). Assim, todo o espectro do componente pode ser armazenado. Com o auxílio de um computador,
pode-se reproduzir um cromatograma para um determinado comprimento de onda ou produzir uma
série de espectros em intervalos de tempo fixos.
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DETECTORES
REDE DE DIODOS: VANTAGENS EM 
RELAÇÃO AO DETECTOR UV-VIS
No detector UV-VIS, seleciona-se o
comprimento de onda que pode não ser o
mais adequado para todos os
componentes da amostra. Isso resulta na
perda de sensibilidade de alguns
componentes da amostra.
A figura ao lado ilustra a diferença de
intensidade do pico para um composto
em função do comprimento de onda.
Com o DAD, pode-se selecionar o melhor
comprimento de onda para cada um dos
componentes, otimizando dessa forma a
sensibilidade. Isso é extremamente
importante na determinação de
impurezas nas sínteses e controle de
qualidade de princípios ativos de
produtos farmacêuticos.
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DETECTORES
ELETROQUÍMICOS
Baseia-se na possibilidade de muitoscompostos serem oxidados ou reduzidos quando se
aplica um potencial elétrico.
Em um processo eletroquímico, um par de eletrodos é colocado na cela e um potencial
suficientemente elevado é aplicado provocando uma reação de oxidação ou redução
gerando uma corrente que é medida em um detector eletroquímico. A corrente gerada é
proporcional a concentração do composto.
TIPOS DE DETECTORES
•Amperométrico
O elemento flui pela superfície do eletrodo onde uma fração das espécies
eletroativas é oxidada ou reduzida (15-20%).
•Coulométrico
O elemento flui através de um eletrodo de grafite poroso onde praticamente
100% das espécies eletroativas são oxidadas ou reduzidas e portanto a sensibilidade é
muito maior (10-15 mol = fentomol) .
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DETECTORES
ELETROQUÍMICOS – COULOMÉTRICO
A figura abaixo representa um esquema de uma cela coulométrica:
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DETECTORES
ELETROQUÍMICOS – COULOMÉTRICO – COULARRAY
É possível montar um conjuntos de detectores coulométricos em série o que permite aplicar um
potencial crescente em cada cela de forma a oxidar ou reduzir seletivamente cada componente
em cada uma das celas. Assim, compostos que eluem juntos podem ser quantificados apesar de
não terem sidos separados.
É possível o arranjo de 4 a 16 celas eletroquimicas obtendo-se cromatogramas tridimensionais.
Tais detectores tem grande aplicação na análise de produtos farmacêuticos, bebidas e
alimentos, análises ambientais e em neurociência (neurotransmissores, drogas).
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DETECTORES
ELETROQUÍMICOS – COULOMÉTRICO – COULARRAY
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COMPARAÇÃO DE DETECTORES HPLC
Índice de Refração
Espectrofotometria UV-
VIS Fluorescência Eletroquímico
Princípio de operação Mudança do IR da fase móvel
Absorbância de luz UV-
VIS
Excitação com luz produz 
emissão fluorescente
Oxidação ou redução em 
um potencial fixo
Tipo Universal Seletivo Seletivo Seletivo
Quantidade mínima 
detectável Micrograma Nanograma < picograma Fentograma
Faixa de linearidade 103 – 104 104 – 105 103 – 105 105
Volume da cela 
(microlitro) 3-15 1-20 8-25 5-10
Sensibilidade a 
temperatura Alta Baixa Baixa Média
Aplicações Geral
Compostos que 
absorvem na região UV-
VIS
Compostos ou derivados 
que fluorescem
Espécies que oxidam ou 
reduzem
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ELSD – EVAPORATIVE LIGHT SCATTERING DETECTOR
• Detector universal para compostos não voláteis.
• Baseado na habilidade das partículas causarem espalhamento(scattering) de 
fótons, quando elas atravessam um feixe de luz policromática.
• O líquido efluente do HPLC é primeiro nebulizado e a mistura aerosol 
resultante contendo as partículas dos analitos é dirigida a um feixe de luz. As 
partículas causam espalhamento da luz. É gerado um sinal, que é proporcional 
à massa presente, e independe da presença ou ausência de grupos 
cromóforos, fluoróforos ou eletroativos.
• Qualquer analito não volátil pode ser detectado.
• Pode ser usado acoplado a um espectrômetro de massa, para fornecer uma 
análise completa da amostra.
• Aplicações para o elsd:
• Lípidios, acidos graxos, carbohidratos, polímeros, esteroides, aminoácidos, 
aditivos de plásticos, produtos farmacêuticos, etc.
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Conceitos fundamentais de HPLC
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
ELSD – EVAPORATIVE LIGHT SCATTERING DETECTOR
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Conceitos fundamentais de HPLC
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal
CHARGED AEROSOL DETECTOR
CORONA
• Este detector oferece os benefícios de desempenho que cada um dos detectores: 
índice de refração, UV de baixo comprimento de onda, ELS de quimiluminescência 
de nitrogênio num único detector.
• O eluente é primeiro nebulizado com nitrogênio, e as gotas são secas para remover 
a fase móvel, produzindo as partículas dos analitos.
• Uma corrente secundária de nitrogênio passa por um sistema de alta voltagem e é 
carregado positivamente.
• Esta carga é transferida para as partículas do analíto, que flue em sentido oposto.
• A carga é transferida para um coletor onde é medida por um eletrômetro altamente 
sensível, gerando um sinal que é diretamente proporcional à quantidade de analito 
presente.
• O fator de resposta do analito é independente da estrutura química.
• Aplicações do CAD:
• Ideal para uma larga faixa de aplicações de compostos não voláteis e semi-voláteis: 
drogas, carbohidratos, lipídios, esteróides, peptídios, proteínas, polímeros.
• Indústrias farmacêuticas, alimentícias, químicas, pesquisa life science,etc.
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Conceitos fundamentais de HPLC
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Conceitos fundamentais de HPLC
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QUADRO COMPARATIVO DE DETECTORES
Sensibilidade Faixa Dinâmica Consistência de 
Resposta
Aplicabilidade Reprodutibilidade Compatibilidade 
Cromatográfica
Facilidade 
de Uso
Charged Aerosol ☻☻☻ ☻☻☻ ☻☻☻ ☻☻☻ ☻☻☻ ☻☻☻ ☻☻☻
UV ☻☻☻ ☻☻☻ ☻ ☻☻ ☻☻☻ ☻☻ ☻☻☻
Evaporative Light 
Scattering ☻☻ ☻ ☻☻ ☻☻☻ ☻☻☻ ☻☻☻ ☻☻
Chemiluminescence 
Nitrogen ☻☻☻ ☻☻ ☻☻ ☻☻ ☻☻ ☻ ☻
Refractive Index ☻ ☻☻ ☻ ☻☻ ☻☻ ☻ ☻☻☻
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Conceitos fundamentais de HPLC
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AQUISIÇÃO DE DADOS
Atualmente utilizam-se softwares que permitem:
•Processar os dados de cromatograma
•Armazenar e registrar
•Controlar a composição da fase móvel (isocrática e por gradiente), vazão da bomba, 
amostrador automático, temperatura da coluna
•Realizar cálculos para “System Suitability Test” (SST)
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Conceitos fundamentais de HPLC
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SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA
Em função da fase estacionária utilizada tem-se os seguintes 
mecanismos de separação:
•Adsorção
•Partição
•Troca iônica
•Exclusão
•Bioafinidade
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Conceitos fundamentais de HPLC
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SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA
ADSORÇÃO
A fase estacionária é um sólido contendo grupos (sítios ativos) que podem adsorver certas
substâncias.
Na adsorção tem-se o seguinte equilíbrio:
Compostos com diferentes constantes de adsorção são separados.
Kads = 
[adsorvido na FE]
[desorvido na FM]
FM FE
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Conceitos fundamentais de HPLC
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SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA
PARTIÇÃO
A fase estacionária é um líquido depositado ou quimicamente ligado a um suporte sólido.
As moléculas dos componentes a serem separados se distribuem entre a fase estacionária
ligada e a fase móvel líquida de acordo com sua afinidade relativa:
Compostos com diferentes constantes de partição são separados.
Kpart = 
[dissolvido na FE]
[dissolvido na FM]
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Conceitos fundamentais de HPLC
Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica FederalSEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA
PARTIÇÃO
FM FE
A FM carrega as moléculas nela dissolvidas. Para reestabelecer o equilíbrio,
moléculas na FE passam para a FM e são arrastadas. Tem-se um equilíbrio
dinâmico em cada segmento da coluna. Como a FM está em contínuo movimento,
esta acaba retirando todas as moléculas da coluna.
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Conceitos fundamentais de HPLC
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SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA
TROCA IÔNICA
A fase estacionária é uma resina catiônica ou aniônica.
O esquema abaixo ilustra o processo:
-
+
+
-
+
+
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Conceitos fundamentais de HPLC
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SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA
POR EXCLUSÃO
O esquema abaixo ilustra o processo:
•A separação é efetuada de acordo com o tamanho das moléculas.
•A fase estacionária tem poros de tamanho controlado
•Moléculas pequenas podem penetrar na maioria dos poros e apresentam um maior tempo de 
retenção
•Moléculas grandes movem-se rapidamente através da coluna pois não entram nos poros
•A técnica é utilizada na análise de compostos de alta massa molecular
•O mecanismo da exclusão forma a base da cromatografia gel (permeação de gel e filtração 
de gel) utilizada na determinação de distribuição de peso molecular de polímeros e proteínas
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Conceitos fundamentais de HPLC
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SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA
BIOAFINIDADE
O esquema abaixo ilustra o processo:
Nessa técnica somente componentes que possuem 
bioafinidade com a fase estacionária são retidos.
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Conceitos fundamentais de HPLC
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PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS
Uma série de parâmetros cromatográficos são importantes para serem utilizados na
identificação dos compostos separados, avaliar o desempenho cromatográfico e auxiliar na
otimização do processo de separação.
Os parâmetros cromatográficos a serem discutidos são:
• TEMPO DE RETENÇÃO
• FATOR DE RETENÇÃO
• FATOR DE SEPARAÇÃO
• NÚMERO DE PRATOS
• RESOLUÇÃO
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PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS
TEMPO DE RETENÇÃO
Por definição chamamos de TEMPO DE RETENÇÃO, tr, de uma substância ao tempo
decorrido do instante em que a amostra foi introduzida até o instante do máximo do pico.
Na análise cromatográfica, mantido constantes a vazão da fase móvel e a temperatura da
coluna, o tempo de retenção é constante.
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PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS
A partir da figura acima, definimos os seguintes parâmetros cromatográficos de acordo com 
as equações abaixo:
Parâmetro Cromatográfico Definição
Fator de retenção k = t’r / to
Fator de separação  = t’r2 / t’r1 
Número de pratos N = 16 ( tr / Wb )2
Resolução Rs = 2 ( tr2 - tr1 )/(Wb1 + Wb2)
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PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS
NÚMERO DE PRATOS
N = 16 ( tr / Wb )2
Número indicativo da performance da coluna. É a medida da largura do pico em relação ao seu tempo 
de retenção. É o parâmetro que mais precisamente define a qualidade de um sistema cromatográfico.
Outra medida da eficiência da coluna é dada pela altura do prato, H (altura equivalente a um 
prato teórico.
onde L = comprimento da coluna
N = número de pratosH = 
L
N
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PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS
RESOLUÇÃO
Rs = 2 ( tr2 - tr1 )/(Wb1 + Wb2)
Fornece uma medida 
quantitativa da 
habilidade da coluna 
em separar duas 
substâncias.
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Conceitos fundamentais de HPLC
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EFICIÊNCIA DA COLUNA
• A introdução da amostra na coluna leva menos de 1 segundo. Como o equilíbrio
entre FE e FM é muito rápido, a largura dos picos também deveria ser
aproximadamente 1 segundo. Entretanto, isso não ocorre devido a processos de
transporte de massa que altera a velocidade das moléculas de um mesmo composto
dentro da coluna. Estatisticamente algumas moléculas viajam mais rapidamente e
outras mais lentamente que a média das moléculas, atingindo o detector em tempos
diferentes. Consequentemente, o pico registrado é alargado.
• Além dos processos de transporte de massa, causas externas à coluna, também
contribuem para o alargamento dos picos.
• Quanto maior o valor de N maior a eficiência da coluna.
• A altura equivalente a um prato teórico é outra maneira de considerar a eficiência da
coluna. Quanto menor H, maior a eficiência da coluna.
• H é o resultado da somatória das contribuições de cada um dos processos de
alargamento intra-coluna(Hi) e extra-coluna(He).
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EFICIÊNCIA DA COLUNA
Os seguintes processos intra-coluna contribuem para o alargamento dos picos:
1-Difusão caótica(Eddy diffusion) – caminhos preferenciais diferentes H=Ce.dp, onde Ce 
é uma constante do processo e dp o diâmetro da particula.
2- Transferência de massa na fase móvel – ao passar no interstício das partículas, as 
moléculas que viajam perto das paredes da FE terão velocidades menores das que 
viajam no centro – H= Cm.dp2.u/Dm, onde u é a velocidade da fase móvel, Dm é o 
coeficiente de difusão da substância na fase móvel.
3- Contribuição da FM estagnada.Dentro dos poros das partículas, algumas moléculas 
são mais retidas do que outras. H = Csm.dp2.u/Dm
4- Influência de transferência de massa com a FE – após a difusão das moléculas dentro 
dos poros, elas penetram na FE. As que penetram mais profundamente dentro da 
FE, também demorarão mais para sair e se atrasarão em relação a outras, 
consequentemente, o pico se alargará. H = s.u.df2/Ds, onde df é a espessura do 
filme e Ds o coeficiente de difusão da substância da fase estacionária.
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EFICIÊNCIA DA COLUNA
Os seguintes processos intra-coluna contribuem para o alargamento dos picos (cont.):
5- Difusão longitudinal na fase móvel – H = Cd.Dm/u
A somatória desses fatores contribuem para aumentar o valor de H e portanto 
diminuição da eficiência da coluna.
De modo geral as seguintes variáveis contribuem para o alargamento do pico: 
Substância i, FM, FE, u, Dm. Ds, 1/u, dp, dp2, df2, diâmetro do poro, área superficial, 
Tcoluna).
A velocidade da fase móvel tem efeito prejudicial para alguns fatores e benéficos para 
outros. Portanto, a avaliação de H em função da velocidade da FM passa por um 
mínimo.
Entre as causas externas, podemos citar: comprimento e diâmetro interno dos tubos 
que ligam a válvula de introdução da amostra à coluna, volume das conexões 
envolvidas, volume da cela do detector, etc.
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EFICIÊNCIA DA COLUNA
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EFICIÊNCIA DA COLUNA
OTIMIZANDO EFICIÊNCIA DA COLUNA
Os seguintes fatores devem serconsiderados na otimização da eficiência da coluna:
•Tamanho de partícula
•Viscosidade da fase móvel
•Temperatura
•Empacotamento
A equação de Van Deemter mostra que quanto menor a partícula, menor H e menor a
influência da vazão na eficiência da coluna:
3
5
10
Vazão
H
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FASES ESTACIONÁRIAS
As FE são constituídas de material sólido, granulado, finamente dividido e densamente
empacotado dentro de um tubo feito de material inerte, normalmente aço. O material sólido
pode estar revestido ou ligado quimicamente a um líquido.
TIPOS DE FASES ESTACIONÁRIA
FE SÓLIDA
FE POR EXCLUSÃO
FE POR TROCA IÔNICA
FE POR BIOAFINIDADE
FE QUIMICAMENTE LIGADA
NORMAL
REVERSA
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FASE ESTACIONÁRIA SÓLIDA
Separação realizada por mecanismo de adsorção
•Utiliza partículas porosas em geral de 5 micra ou 10 micra
•Indicada para compostos com peso molecular menor que 2000 Daltons
•Solventes mais utilizados são de média e baixa polaridade
•Adsorventes mais utilizados: alumina e principalmente sílica
SÍLICA
A sílica possui grupos siloxano, Si-O-Si e grupos silanol, Si-
OH vicinal e germinal. Os grupos silanol são os mais 
importantes devido a sua polaridade. Quanto mais polar o 
composto, maior a retenção.
A ordem de eluição em sílica é: hidrocarbonetos saturados < 
olefinas < aromáticos < éteres< ésteres < aldeídos ≈ cetonas 
< álcoois < aminas < amidas < ácidos carboxílicos.
Dependendo do procedimento de produção da sílica, suas 
características, como volume de poro, diâmetro de poro, área 
superficial, número de grupos silanol, variam resultando em 
retenção variável.
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FASE ESTACIONÁRIA POR EXCLUSÃO
A separação baseia-se no tamanho das moléculas dos componentes da amostra em relação
ao diâmetro dos poros da fase estacionária.
As fases estacionárias podem ser sílica ou polímeros de poliestireno-divinilbenzeno,
poliacrilamidas e outros, com distribuição de diâmetro dos poros controlada.
Moléculas pequenas entram nos poros pequenos enquanto as moléculas grandes não
conseguem entrar nos poros. Desta forma elas são permeadas seletivamente.
A técnica é denominada cromatografia de exclusão por tamanho.
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FASES ESTACIONÁRIAS
FASE ESTACIONÁRIA POR EXCLUSÃO
A figura abaixo ilustra o processo de separação:
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FASES ESTACIONÁRIAS
FASE ESTACIONÁRIA POR EXCLUSÃO
APLICAÇÕES:
PERMEAÇÃO EM GEL
(FM orgânica)
FILTRAÇÃO EM GEL
(FM aquosa)
Resinas alquídicas Peptídeos
Epóxidos Proteinas
Poliestirenos Enzimas
Borracha natural Ácidos Nucleicos
Silicones Lipídios
Colunas de permeação de gel fabricadas com sais de cálcio ou chumbo de resinas sulfônicas
com diâmetro de poro controlado, são usadas nas análises de dextrana, oligossacarídeos e
açúcares.
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FASES ESTACIONÁRIAS
FASE ESTACIONÁRIA POR TROCA IÔNICA
A separação baseia-se na interação eletrostática dos componentes da amostras com
grupos iônicos da FE.
A FE é normalmente uma resina de poliestireno-divinilbenzeno a qual estão ligados
grupos iônicos, ou a FE é sílica recoberta com uma fina camada de poliestireno-
divinilbenzeno onde grupos iônicos estão ligados.
Os grupos quimicamente ligados presentes em todo tipo de material de troca iônica são:
SO3- : trocadores fortes de cátions
CO2- : trocadores fracos de cátions
NR3+ : trocadores fortes de ânions
NH2R+ : trocadores fracos de ânions
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FASES ESTACIONÁRIAS
FASE ESTACIONÁRIA POR TROCA IÔNICA
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Conceitos fundamentais de HPLC
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FASES ESTACIONÁRIAS
FASE ESTACIONÁRIA QUIMICAMENTE LIGADA
São as fases mais importantes da cromatografia líquida Obtidas pela reação dos
grupos silanois da sílica com compostos contendo grupos polares(Fase Normal)
ou nao polares(Fase Reversa).
Na Fase Quimicamente Ligada, a sílica gel, através dos grupamentos Si - OH, se
liga quimicamente a um grupo funcional que lhe confere grande estabilidade
química.
A “Cromatografia de Fase Ligada” é subdividida em Fase Normal e Fase Reversa
de acordo com a polaridade dos grupos funcionais ligados à sílica gel.
As notáveis propriedades deste tipo de material fazem da Cromatografia de Fase
Ligada a mais utilizada em todo o mundo.
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FASES ESTACIONÁRIAS
FASE ESTACIONÁRIA QUIMICAMENTE LIGADA
-Si-O-Si- (R)
-Si-O-Si- (R)
-Si-O-Si- (R)
-Si-O-Si- (R)
-Si-OH
-Si-OH
-Si-OH
Grupos silanóis são responsáveis por retenções não específicas que 
provocam alargamento dos picos. 
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FASES ESTACIONÁRIAS
FASE ESTACIONÁRIA QUIMICAMENTE LIGADA
Para a produção das Fases Quimicamente Ligadas, a sílica gel é submetida a um
processo de hidrólise formando grupos silanóis SiOH, grupo quimicamente ativo
no qual se ligará o grupo funcional através de reações de silanização, utilizando
organosilanos(ex. dimetilcloroocatadecilsilano), mono, di ou trifuncionais,
dependendo do numero de grupos no silano que pode reagir. Obtem-se fase
monomérica ou polimérica.
Infelizmente, devido a efeitos estéricos, muitos grupos SiOH não reagem
permanecendo ativos e provocando encaudamento dos picos.
Ligação química tradicional usando silano monofuncional alcança um máximo de
50% ou uma densidade de ligante de ~4µmol/m2.
Para atenuar este problema, emprega-se um processo conhecido como
“Endcapping”.
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FASES ESTACIONARIAS
ENDCAPPING 
• Para minimizar o efeito dos grupos silanol residuais é necessário um passo
secundário de ligação para cobrir esses grupos ainda presentes na sílica.
• O processo denominado endcapping efetua-se em geral com
trimetilclorosilano(TMS). Ainda assim restam grupos silanol livres
• As sílicas usuais só podem ser utilizadas na faixa de pH 2 – 8, pois os
grupos TMS sofrem hidrolise a pH menor que 2 e a sílica se dissolve em
fase móvel contendo água em pH maior que 8.
• Muitos desses problemas: cauda nos picos de analitos básicos, limitação
de pH, baixo tempo de vida da coluna, tem sido resolvidos ou minimizados
através de desenvolvimentos mais recentes, tais como: sílica de alta
pureza, partículas hibridas, sílica tipo C(sílica hidreto) e novas “quimicas
ligantes”.
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ENDCAPPING
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FASES ESTACIONÁRIAS - NOVOS DESENVOLVIMENTOS
• SÍLICA DE ALTA PUREZA(sílicatipo B) – maior que 99.995%, com menos de 50ppm de 
metais, (metais causam caudas pois tornam os silanols extremamente ácidos).
• PARTÍCULAS HÍBRIDAS – desenvolvido pela Waters, essas partículas são um híbrido
orgânico/inorgânico.Contém ambos sílica e organosiloxane.ë produzida pela mistura de 
dois monomeros de alta pureza: (RO)4Si + (RO)3SiR. O produto da reação contém
unidades de SiO2 e unidades RSiO1.5 combinados a nível molecular. O teor de carbono é 
cerca de 7%, antes de modificações da superfície. Colunas Xterra são produzidas com 
essas partículas. 
Permitem uso na faixa de pH 1 a 12, sem perda de eficiência ou capacidade e devido ao
teor reduzido de grupos silanol, fornecem excepcional forma de picos para analitos
básicos.
sílica TIPO C – sílica HIDRETO – desenvolvida pela Microsolv. Produzida a partir de sílica
ultra pura(baixo teor de metais), através de uma tecnologia própria, a sílica tipo B é 
convertida em sílica tipo C, hidreto de silicio, livre de carbono, contém menos de 3% de 
grupos SiOH. Por isso não forma ligações fortes com água o que permite utiliza-la como
fase Normal com solventes Hexano/Acetato de etila e até Agua/Acetonitrila com excelente
precisão.
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FASES ESTACIONARIAS – NOVOS DESENVOLVIMENTOS
SÍLICA MONOLÍTICA – MONOLITHIC sílica
GRUPOS ESTERICAMENTE IMPEDIDOS – Grupos di-isopropil e di-isobutil 
incorporados aos reagentes ligantes para proteger as ligações Si-O contra hidrólise 
ácida.
• QUÍMICA SILANO POLIFUNCIONAL – O uso de silanos di-funcional ou tri-funcional 
para criar grupos ligados com dois ou tres pontos conduzindo a fases com maior 
estabilidade em baixo e alto pH e menor sangramento para LC/MS. Porém os silanos 
polifuncionais são de controle mais difícil.
• GRUPOS POLARES EMBEBIDOS – A incorporação de um grupo polar( ex. 
Carbamato, amida, urea, eter, sulfonamida) na cadeia hidrofílica de reagentes 
ligantes tem conduzido a uma nova classe de fases populares com diferente 
seletividade e melhor forma de pico para analitos básicos devido a “blindagem” dos 
silanois pelo grupo polar embebido. Essas colunas são geralmente menos retentivas 
do que as C18 e C8 comuns, para analitos neutros e básicos. Estão se tornando 
muito populares para o desenvolvimento de métodos de difíceis separações. 
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SÍLICA DE ALTA PUREZA
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PARTICULAS HIBRIDAS
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SÍLICA MONOLITICA – MONOLITHIC SÍLICA
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SÍLICA FUSED CORE PARTICLE 
• Tecnologia de partícula fused core, desenvolvida para cromatografia hiper rápida. 
• Uma camada de sílica porosa é fundida na superfície de sílica sólida.
• A particula tem diametro total de 2.7µm e a camada porosa 0.5µm, área superficial 
de 150m2/g, diametro de poro: 90a e pode ser usada na faixa de pH: 2 – 9.
• As ligações da fase estacionária são monoméricas e endcapped maximinizado.
• Como o passo de difusão é de apenas 0.5µm, reduz a dispersão axial e minimiza o 
alargamento de pico.
• Possui eficiência de particulas sub-2µm sem a queda de pressão que estas 
particulas apresentam e portanto não necessita de equipamento uhplc.
• www.sigmaaldrich.com/supelco/the_reporter/207002-ascentis-express.Pdf
• www.mac-mod.com/pb/halo -pb.Hmtl
• Site da sigmaaldrich – supelco – the report volume 25.2
• Colunas ascentis express particle e colunas halo
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GRUPOS ESTERICAMENTE IMPEDIDOS
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ADSORVENTES DE 
HPLC E 
CARACTERÍSTICAS
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FASES ESTACIONÁRIAS
FASE ESTACIONÁRIA NORMAL
Grupos Funcionais Polares são ligados à matriz de sílica. A técnica, em
geral, substitui com vantagens a Cromatografia por Adsorção.
GRUPOS FUNCIONAIS MAIS COMUNS:
DIOL
CIANO
AMINO
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FASE ESTACIONÁRIA REVERSA
Em Cromatografia de Fase Reversa, os grupos funcionais ligados à base de sílica são apolares. Os
analitos são atraidos para a superficie pelos seus grupos funcionais não polares. O analito mais polar elui
primeiro, seguidos pelos outros em ordem decrescente de polaridade. Os grupos butil, octil, octadecil e
fenila são os mais utilizados. O grupo octadecil é responsável pela maioria das separações em
fase reversa.
Si- O - Si -
Si- O - Si -
Si- O - Si -
Si- O - Si -
O
O
O
O
O
O
C18
C18
C18
C18
Si- O - Si -
Si- O - Si -
Si- O - Si -
Si- O - Si -
O
O
O
O
O
O
C8
C8
C8
C8
Si- O - Si -
Si- O - Si -
Si- O - Si -
Si- O - Si -
O
O
O
O
O
O
CH2-
CH2-
CH2-
CH2-
OCTADECIL OCTIL FENIL
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FASE MÓVEL
ESCOLHA DO SOLVENTE EM HPLC
O sucesso da separação cromatográfica só é possível se for aplicada uma FM
correta a uma FE conveniente.
A escolha da composição da FM leva em conta vários fatores, tais como:
• Propriedades físico-químicas que afetam a solubilidade, partição e adsorção e,
portanto, a separação
• Propriedades físicas que afetam a possibilidade de detecção dos componentes
• Propriedades físicas que dificultam o manuseio das bombas, detectores ecoluna
• Propriedades que afetam a segurança (toxidez e inflamabilidade)
• Custo
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FASE MÓVEL
SELEÇÃO DA FASE MÓVEL EM FUNÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICAS
Os seguintes parâmetros devem ser considerados para uma escolha adequada da
FM:
• Viscosidade
• Compressibilidade
• Pressão de vapor
• Toxidez
• Índice de Refração
• Corte de UV (cut off) – espectro de absorção UV-VIS
• Miscibilidade de solventes e outras características importantes
• Força dos Solventes
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Conceitos fundamentais de HPLC
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FASE MÓVEL
SELEÇÃO DA FASE MÓVEL EM FUNÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICAS
VISCOSIDADE
A viscosidade do solvente ou misturas de solventes tem importância fundamental
durante o bombeamento isocrático ou por gradiente. A figura abaixo apresenta a
viscosidade de alguns solventes.
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FASE MÓVEL
SELEÇÃO DA FASE MÓVEL EM FUNÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICAS
VISCOSIDADE
•P da coluna depende da vazão, temperatura, viscosidade da FM e empacotamento da
coluna.
•Viscosidade elevada acarreta em dificuldades no bombeamento e elevam o P.
•Exemplo da influência da viscosidade em coluna fase reversa C8- 5 m– 25cm –
4.6mm:
Solvente Viscosidade (cP) Vazão (ml/min) P (atm)
Metanol 1.1 1.00 102
Isopropanol 2.2 1.00 460
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FASE MÓVEL
SELEÇÃO DA FASE MÓVEL EM FUNÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICAS
VISCOSIDADE
Água, metanol, hidrocarbonetos e outros
compostos com viscosidade menor que 1cP
são ótimos solventes no parâmetro
viscosidade.
A viscosidade influência na eficiência pois
afeta o coeficiente de difusão acarretando
em perda de número de pratos teóricos da
coluna.
A viscosidade de misturas de solventes não
varia linearmente com a composição.
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FASE MÓVEL
SELEÇÃO DA FASE MÓVEL EM FUNÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICAS
CORTE UV (CUT OFF)
•O UV cut off é o comprimento de onda abaixo do qual o solvente absorve mais que uma
unidade de absorbância em uma cela de 1cm de caminho óptico.
•É uma referência para a seleção do solvente da FM quando se usa detector UV.
•É importante determinar o espectro de absorção do solvente antes de usá-lo como FM, pois
eventuais impurezas podem alterar muito o valor do cut off.
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SELEÇÃO DA FASE MÓVEL EM FUNÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICAS
MISCIBILIDADE DE SOLVENTES E OUTRAS CARACTERÍSTICAS
Além das propriedades discutidas, outros cuidados especiais devem ser tomados na escolha
dos solventes:
• Os componentes devem se dissolver na FM para que sejam transportados
através da coluna
• Imiscibilidade com a FE
• Inércia química com a FE e os componentes da amostra
• Pureza condizente com o detector utilizado.
• Mistura de solventes devem produzir soluções homogêneas – fator importante
nas análises por gradiente (o mesmo cuidado deve ser tomado na troca de
solventes; em caso de troca de dois solventes imiscíveis, deve-se usar um
solvente intermediário solúvel em ambos).
• Sistemas não miscíveis prejudicam o desempenho da bomba, da coluna e
induzem ruídos no detector além de alterar os tempos de retenção e prejudicar
análises quantitativas.
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SELEÇÃO DA FASE MÓVEL EM FUNÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICAS
FORÇA DOS SOLVENTES
• A interação das moléculas dos compostos analisados (analitos) com o solvente (FM) e
consequentemente suas solubilidades depende basicamente das seguintes forças de
interação:
• Dispersão
• Interação dielétrica
• Dipolos
• Pontes de hidrogênio
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SELEÇÃO DA FASE MÓVEL EM FUNÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICAS
Miscibilidade 
em água UV cut off  IR 20°C
Força do 
Solvente
Viscosidade 
a 20°C, cP
Hexano não 200 1.3750 0.00 0.33
Isooctano não 200 1.3910 0.01 0.50
Tetracloreto de carbono não 263 1.4595 0.14 0.97
Clorofórmio não 245 1.4460 0.31 0.57
Cloreto de metileno não 235 1.4240 0.32 0.44
Tetrahidrofurano sim 215 1.4070 0.35 0.55
Éter dietílico não 215 1.3530 0.29 0.23
Acetona sim 330 1.3590 0.43 0.32
Acetato de etila pobre 260 1.3720 0.45 0.45
Dioxano sim 215 1.4220 0.49 1.54
Acetonitrila sim 190 1.3440 0.50 0.37
2-Propanol sim 210 1.3770 0.63 2.30
Metanol sim 205 1.3290 0.73 0.60
Água sim - 1.3328 >0.73 1.00
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FASE MÓVEL
RELAÇÃO ENTRE SELETIVIDADE COM POLARIDADE DA FM
Ao variar a polaridade da 
fase móvel, varia o fator 
capacidade(k=t’r/to) e 
consequentemente a 
seletividade na separação.
Variação de tr e resolução 
com a composição do 
solvente em análise de 
metil, etil, propil e butil 
parabenos. coluna ODS 
(10cm x 0.6 cm), UV 
254nm, 40°C, água/metanol
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SELEÇÃO DA FASE MÓVEL EM FUNÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICAS
RELAÇÃO ENTRE SELETIVIDADE COM POLARIDADE DA FM
Variação do fator capacidade com a composição da fase móvel
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FASE MÓVEL
SELEÇÃO DA FM NO DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO ANALÍTICO
Abaixo descreve-se um procedimento típico para seleção de FM em separações isocráticas
com fase reversa:
•Escolher a coluna conveniente (C8 – C18)
•Fixar a temperatura da coluna (40°C)
•Para compostos ácidos ou básicos ajustar a FM água com ácido fosfórico 0.05M ajustando
o pH a 3.5 com hidróxido de sódio
•Equilibrar a coluna com solvente orgânico puro (acetonitrila ou metanol, vazão = 1.5ml/min)
•Injetar 10-20 l da amostra
•Se os componentes eluírem perto de to, repetir as análises alterando a concentração de
água crescentemente até o obter separação satisfatória.
•A figura abaixo ilustra esse teste utilizando acetonitrila:
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SELEÇÃO DA FM NO DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO ANALÍTICO
Constata-se a força do solvente na separação.
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FASE ESTACIONÁRIA REVERSA
ORIENTAÇÃO PARA OTIMIZAÇÃO DA SEPARAÇÃO
Fase móvel 
100% Orgânica
Adicione água 
(incrementos de 
20%) até k’ = 5
Ajuste a  > 1.2
Diminua vazão
Aumente a coluna
Diminua as partículas
Tente outra Fase 
estacionária
picos muito rápidos
injete amostra
picos muito próximos
ainda não separa
Utilizar Fase Normal
picos muito lentos
Adicione pequenas quantidades 
de modificadores orgânicos 
fortes
Ajuste pH para os compostos 
parcialmente iônicos; força 
iônica
Ajuste Temperatura
Altere o modificador
fator retenção : k = t’R / tM
fator separação:  = k2 / k1 = t’R2 / t’R1 
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REAÇÕES PÓS-COLUNAS
Para a detecção de alguns componentes, principalmente a baixas concentrações, é preciso
transformá-los em derivados que apresentem maior sensibilidade para um determinado
detector.
Isso é necessário quando o componente:
• Não é bom cromóforo
• Não é bom fluoróforo
• Não é eletroquimicamente ativo
Nestes casos efetua-se reações específicas, formando derivados que possam apresentar
algumas das seguintes propriedades:
• Alta constante de equilíbrio de formação
• Rápida velocidade de formação
• Espectro UV-VIS de alta sensibilidade
• Fluorescência
• Eletroquimicamente ativos
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REAÇÕES PÓS-COLUNAS
EXEMPLO: HERBICIDA GLIFOSATO
• Característica original: É um mau cromóforo e um mau fluoróforo
• Reação pós coluna: reação com hipoclorito e o-ftalaldeído (OPA) e mercaptoetanol
(MERC)
Glifosato Glicina Isoindol
• Detecção: fluorimetricamente do isoindol (excitação a 230-240 nm, emissão a 420-450nm)
OCl- OCl-
MERC
bomba
injetor 50°C
coluna
bomba
OCl-
bomba
OPA / MERC
reactor reactor
fluorímetro
registrador
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REAÇÕES PÓS-COLUNAS
EXEMPLO: BARBITÚRICOS
característica original: baixa absorbância no UV
•reação pós coluna: elevação de pH a um sistema alcalino (em sistemas alcalinos, a
absorbância máxima de barbitúricos se desloca para comprimentos de onda mais altos,
porém, nessa condição, a FM dissolve a sílica da FE, assim, o problema é resolvido
elevando-se pH somente após a coluna.)
detecção: UV a 240 nm
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PICOS COM CAUDA EM HPLC COM FASE REVERSA
Picos com cauda em fase reversa continua sendo um problema em cromatografia.
Particularmente na separação de compostos básicos e portanto um problema constante na 
análise de produtos farmacêuticos.
Picos com cauda causam inúmeros problemas, incluindo baixa resolução, sensibilidade 
reduzida , precisão e quantificação inadequada.
A figura 1 ilustra como a resolução e sensibilidade da amostra é afetada por picos com 
cauda.
A figura 2 ilustra como a exatidão e precisão de uma análise pode sofrer devido a inabilidade 
dos sistemas de dados identificar exatamente onde uma cauda do pico inicia e termina.
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CAUSAS DE CAUDA NO PICO AÇÃO CORRETIVA
SOLVENTE DA AMOSTRA MAIS FORTE QUE A FASE 
MÓVEL
DISSOLVA A AMOSTRA NA FASE MÓVEL OU 
REDUZA A FORÇA DO SOLVENTE 
EXCESSO DE MASSA DE AMOSTRA
REDUZA A MASSA DE AMOSTRA INJETADA
TABELA 2 INDICA A QUANTIDADE RECOMENDADA 
DE AMOSTRA A SER INJETADA PARA DIFERENTES 
COLUNAS.
INTERAÇÃO DE SILANOL COM AMINAS
REDUZA O pH da FASE MÓVEL PARA <3 
AUMENTE A FORÇA IÔNICA DA FASE MÓVEL, 
25mM A 50mM É RECOMENDADO ADICIONE UMA 
AMINA COMPETITIVA NA FASE MÓVEL – 10mM DE 
TEA É SUFICIENTE.
SELECIONE FASE ESTACIONÁRIA COM MENOR 
ATIVIDADE DE SILANOL.- FIG.6
ADSORÇÃO DE ÁCIDOS NA sílica
AUMENTE A CONC. DE SAL NA FASE MÓVEL.
25mM A 50mM E USUALMENTE SUFICIENTE.
REDUZA O pH da FASE MÓVEL PARA <3.
ADICIONE UM ÁCIDO ORGÂNICO COMPETITIVO. 
1% DE ACIDO ACÉTICO OU 0.1% DE TFA É 
USUALMENTE SUFICIENTE.
VAZIOS NA COLUNA
SUBSTITUA A COLUNA.
TENTATIVA DE PREENCHER OS VAZIOS 
RARAMENTE VALE A PENA.
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ANÁLISE DE COMPOSTOS BÁSICOS
Problemas com a forma do pico de compostos básicos são normalmente comuns. 
Mas há vários passos simples que podem melhorar significativamente a forma do 
pico de bases:
1- Selecione uma coluna base-sílica desativada.
2- Usar fase móvel com baixo ph. 
3 – Aumento da concentração de sais na fase móvel.
4 – Selecione uma coluna “heavily endcapped”.
5 – Adicione uma base competitiva.
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ANÁLISE DE COMPOSTOS ÁCIDOS
1– Adicione um ácido orgânico competitivo.
Adicionou-se 1% de ácido acético à fase móvel para minimizar as interações 
soluto-silanol, pela ação de um ácido competidor.
Os resultados foram notáveis, com o pico de ibuprofen eluindo perfeitamente 
gaussiano – fator cauda 1.0.
2- Substituindo o ácido acético por 0.1% de ácido trifluoracético – tfa.
A concentração relativamente alta de ácido acético resulta em ruído da linha de 
base. Usando tfa 0.1% como modificador aquoso resulta numa fase móvel mais 
transparente, menos ruído, e o pico de ibuprofen ainda elui com uma banda 
simétrica, fator cauda 1.09.
Em pH 3, a fase móvel está tamponada, porém a capacidade tamponante é 
baixa. aumento da concentração para 10 – 20mm melhorará a reprodutibilidade 
cromatográfica por mais tempo, além de melhorar ainda mais a forma do pico.
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HPLC FASE REVERSA COM FASE MÓVEL AQUOSA
• Tempo de retenção não reprodutível é 
um problema comum quando se usa fase 
móvel altamente aquosa.
• Na separação de compostos muito 
polares, solúveis em água não é 
incomum usar fm com menos de 10% de 
modificador orgânico(metanol, 
acetonitrila, etc.) Para conseguir 
retenção suficiente.
• Entretanto, nestas condições a 
reprodutibilidade é ruim.
• Com o tempo, os picos eluirão com 
tempo de retenção cada vez menores e a 
resolução piora.
• A figura mostra cromatogramas de 
análise de vitaminas em coluna ymc ods-
fm:5meoh – 95% 0.1M KH2PO4 –
f:1ml/min
• Vitamina C – vitamina B1 – vitamina B6 -
nicotinamida
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HPLC FASE REVERSA COM FASE MÓVEL AQUOSA
COLAPSO DE FASE ESTACIONÁRIA 
• A mudança do tempo de retenção é causada pelo fenômeno denominado colapso de fase 
de fases alquílicas hidrofóbicas c18 ou c8 em condições de fase móvel altamente aquosas. 
• A medida que o colapso de fase progride, a viabilidade da fase alquilica interagir com 
solutos diminui e o tempo de retenção decresce.
• Há também evidência que este colapso de fase pode deslocar a FM aquosa dos poros da 
FE, reduzindo a área superficial acessível para os solutos e portanto reduzindo os tempos 
de retenção. 
• Em condições normais a fase alquílica está extendida na FM e solvente e moléculas da 
amostra tem total acesso a fe.
• Quando se usa Fm altamente aquosa a FE tende a colapsar e o tempo de retenção é 
afetado.
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HPLC FASE REVERSA COM FASE MÓVEL AQUOSA
COLAPSO DE FASE ESTACIONÁRIA
• A figura mostra cromatogramas em coluna c8 base 
desativada;
• Após deixar por 10 min. em FM 100% aquosa o tempo 
de retenção de amoxicilina diminuiu de 5 min. 
Indicando colapso da fase; 
• Purgando a coluna com solvente orgânico a fase 
alquilica é novamente extendida e o tempo de 
retenção é restaurado.
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HPLC REVERSA COM FASE MÓVEL AQUOSA
COLUNAS QUE NÃO EXIBEM PROBLEMAS COM COLAPSO DE FASE
Alguns fabricantes resolveram o problema 
usando silanos polares com fase ligada ou 
usando “endcapping” hidrofilico.
Ambos tem o mesmo efeito de manter a fase 
alquilica(C18 ou C8) extendida, mesmo MBOS 
quando se usa fase móvel 100% aquosa.Colunas: AquaSep, HydroBond AQ, 
HydroBond PS, ProntoSIl AQ, Zorbax SB AQ
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CROMATOGRAFIA POR INTERAÇÃO IÔNICA
ION PAIR CHROMATOGRAPHY 
• A análise de compostos com carga tem sido obtida por supressão de ion (ajuste 
cuidadoso do pH da fase móvel para resultar em analito não ionizável.
• Determinação do pH ótimo da fase móvel em supressão de ion frequentemente 
requer trabalho extensivo no desenvolvimento do método.
• Para amostras contendo mais de um componente ionizável, o método 
frequentemente nao é adequado.
• As limitações da supressão de ion, conduziu ao desenvolvimento de uma 
metodologia mais adequada para a separação de componentes ionizados: 
cromatografia por interação iônica – ion pair chromatography.
• A técnica envolve a adição de composto iônico na fase móvel para promover a 
formação de pares de ions (ion pairs) com analitos carregados. Estes reagentes são 
constituidos de uma cadeia alquílica com terminal ionizável.
• Quando usado com colunas hidrofóbicas Fase Reversa , os reagentes ion par podem 
ser usados para aumentar seletivamente a retenção de analitos carregados.
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QUANDO UMA FASE MÓVEL DEVE SER TAMPONADA?
Em HPLC com fase reversa, a retenção dos analitos está relacionada com sua 
hidrofobicidade. Quanto mais hidrofóbico o analito, mais ele será retido.
Quando um analito é ionizado, ele torna -se menos hidrofóbico e portanto sua retenção 
diminui.
Ácidos perdem um proton e tornam-se ionizados quando o ph aumenta.
Bases ganham um proton e tornam-se ionizados quando o ph decresce.
Portanto, nas separações contendo ácidos e/ou bases utilizando fase reversa, é necessário 
controlar o ph da faxe móvel, usando um tampão apropriado para se obter resultados 
reprodutíveis.
FASES MÓVEIS TAMPONADAS PARA HPLC COM FASE REVERSA
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A figura 2 mostra que metilamfetamina é totalmente protonada em pH menor que 3 e sua retenção 
não é afetada por pequena mudança no pH da fase móvel. Já a pH 7, próximo de seu pKa, uma 
mudança de apenas 0.2 unidades de pH desloca a retenção de quase 9% .
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ANÁLISE QUALITATIVA
A análise qualitativa em HPLC tem por objetivo a identificação dos analitos de
interesse.
Existem dois casos a serem considerados para análise qualitativa com HPLC:
•Análise Qualitativa em Controle de qualidade
•Análise Qualitativa em identificações não rotineiras
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ANÁLISE QUALITATIVA
Análise Qualitativa em Controle de qualidade
É normalmente efetuada através da comparação do tempo de retenção ou
retenção relativa dos analitos de interesse com esses parâmetros de padrões. Tais
análises são realizadas com metodologias já estabelecidas.
É fundamental o controle e monitoramento das condições analíticas para evitar
conclusões errôneas.
Análise qualitativa em identificações não rotineiras
Neste caso é importante conhecer o máximo da história da amostra e utilizar
detectores que auxiliam a identificação da estrutura do composto, como detector
de espectrometria de massa.
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ANÁLISE QUANTITATIVA
MÉTODOS POR NORMALIZAÇÃO
Assume-se que todos os componentes da amostra eluem da coluna e são
detectáveis
Existem dois procedimentos:
• Normalização de área (% em área)
• Normalização utilizando-se a área corrigida
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ANÁLISE QUANTITATIVA
MÉTODOS POR NORMALIZAÇÃO
Normalização de área (% em área)
Ai = área do composto i
Ai = somatória das áreas de todos componentes
Considera-se que todos os componente apresentam resposta proporcional a sua
concentração e que mesma concentração de diferentes compostos resulte em
áreas iguais (o que dificilmente ocorre).
100% x
A
A
i
i
i 

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ANÁLISE QUANTITATIVA
MÉTODOS POR NORMALIZAÇÃO
Normalização com área corrigida
Ai = área do composto i
Fi = fator de resposta do componente i
AiFi = somatória das áreas de todos componentes multiplicadas pelos respectivos
fatores de resposta
É necessário conhecer todos os componentes da amostra para determinação dos
fatores de resposta de cada componente
100% x
xFA
xFA
ii
ii
i 

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ANÁLISE QUANTITATIVA
MÉTODOS ABSOLUTOS
Utiliza-se métodos absolutos quando:
• O objetivo da análise é quantificar um ou alguns dos componentes da
amostra.
• Ao utilizar detectores específicos ou seletivos que detectam somente os
componentes de interesse
• Existência de compostos na amostra que não são eluídos nas condições de
análise ou não são detectados e que não haja interesse de quantificá-los.
• Quantificação de componentes em baixa concentração.
• Existem dois procedimentos:
•Padronização externa
•Padronização interna
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ANÁLISE QUANTITATIVA
MÉTODOS ABSOLUTOS - Padronização externa
1. Determina-se a curva de calibração de cada componente através da análise de misturas padrões
injetando-se um determinado volume.
2. Posteriormente, injeta-se o mesmo volume da amostra e obtem-se a concentração do analito através da
urva dec calibração.
Nesta técnica, se o volume injetado não for exatamente o mesmo ou se houver alteração de algum
parâmetro que afete a resposta do componente no detector, como por exemplo, variação da intensidade
de luz do UV-VIS ou alteração na FM, as áreas dos picos poderão ser maiores ou menores daquelas
obtidas na calibração e consequentemente os resultados serão incorretos.
Ai
Ci
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ANÁLISE QUANTITATIVA
MÉTODOS ABSOLUTOS - Padronização interna
Para minimizar os problemas da padronização externa, a amostra e a mistura padrão são
modificadas pela adição de um composto considerado como padrão interno. O padrão
interno deve ter as seguintes características:
1. Não estar presente na amostra original, ser estável e não reativa.
2. Pico separado dos componentes da amostra
3. Eluir próximo dos componentes de interesse
4. Detecção semelhante dos picos de interesse
5. Concentração que produza área similar aos picos analisados
6. Pureza elevada ou conhecida (possíveis impurezas não devem eluir com os
picos de interesse).
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