Aula 18 Aula Processos de Separação e Purificação do Produto

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Processos de Separação e 
Purificação do Produto
Bioengenharia
Processos de 
Separação e 
Purificação do 
Produto
Processos de Separação e Purificação do Produto
 Recuperação de produto 
(downstream processing). 
 Se o produto for secretado, as etapas de recuperação seguem um roteiro diferente da
recuperação do produto intracelular.
 No caso de produto intracelular será necessário romper estruturas celulares cuja composição
será importante na escolha das técnicas adequadas para a liberação do produto.
Processos de Separação e Purificação do Produto
 O projeto dos equipamentos que irão compor esta seção será função da:
 localização do produto (intracelular ou extracelular),
 do seu tamanho molecular,
 concentração,
 solubilidade,
 polaridade,
 volatilidade
 e de outras propriedades físico-químicas do meio de fermentação:
 viscosidade
 Densidade
 impurezas
 partículas indesejáveis.
Influência do processo de upstream sobre o 
processo de downstream
Seleção MO
Adaptação 
MO
Preparação 
de inóculo
Estágios de 
pré-
fermentação
Processo 
fermentativo
Característica 
dos 
microrganismos 
Localização 
do produto
Estabilidade 
do produto 
dentro das 
células 
Produção de 
metabólitos 
secundários 
ou impurezas
• Os produtos da indústria biotecnológica são altamente diversificados:
• Ácidos orgânicos
• Antibióticos
• Polissacarídeos
• Hormônios
• Aminoácidos
• Peptídeos
• Proteínas
• Como resultado dessa diversidade, não há processos de purificação
de aplicação geral. 
Processos de Separação e Purificação do Produto
• Clarificação: é a separação de células e seus fragmentos do meio de cultivo.
• Concentração e/ou purificação de baixa resolução: compreende a separação da molécula alvo, por
exemplo uma proteína, em relação a moléculas com características físico-químicas
significativamente diferentes (água, íons, pigmentos, polissacarídeos, lipídios);
• Purificação de alta resolução: compreende a separação de classes de moléculas com algumas
características físico-químicas semelhantes, como por exemplo proteínas.
• Operações para acondicionamento final do produto.
Além disso, para produtos associados às células, é necessário efetuar o rompimento celular (após
clarificação).
Processos de Separação e Purificação do Produto
O processo pode ser dividido em quarto etapas:
Processos de 
Separação e 
Purificação 
do Produto
Etapa do processo Operações unitárias Princípio 
Clarificação 
Filtração convencional Tamanho de partículas 
Centrifugação Tamanho e densidade de partículas 
Filtração tangencial (membranas) Tamanho de partículas 
Floculação Hidrofobicidade de partículas 
Rompimento de células 
Homogeneização Cisalhamento 
Ultra-som Cisalhamento 
Moagem em moinho de bolas Cisalhamento 
Rompimento químico ou enzimático 
Hidrólise, solubilização ou desidratação de 
moléculas que compõem a parede ou a membrana 
celular
Purificação de baixa resolução 
Precipitação Solubilidade 
U Itrafiltração (membranas) Massa molar e raio hidrodinâmico de moléculas 
Extração em sistemas de duas fases líquidas Solubilidade, massa molar 
Purificação de alta resolução 
Cromatografia de troca-iônica 
Tipo e densidade de carga na superfície da 
biomolécula 
Cromatografia de afinidade (biológica ou química) 
Sítios específicos da superfície de uma proteína 
(adsorção) 
Cromatografia de imunoafinidade 
Sítios específicos da superfície de uma proteína 
(adsorção antígeno/anticorpo)
Cromatografia de interação hidrofóbica 
Hidrofobicidade 
Cromatografia de exclusão molecular Massa molar 
Membranas adsortivas
Massa molar e características para adsorção ou 
sítios específicos da superfície de uma proteína 
Tratamentos finais 
Cristalização 
Solubilidade e características de equilíbrio líquido-
sólido 
LiofiIização Características de equilíbrio líquido-sólido
Secagem Características de equilíbrio líquido-sólido 
Operações envolvidas no processo de purificação de bioprodutos
Clarificação
Filtração convencional Tamanho das partículas
Centrifugação Tamanho e densidade das partículas
Filtração tangencial (Membranas) Tamanho das partículas
Floculação Hidrofobicidade de partículas
Rompimento 
celular
Homogeneização Cisalhamento
Ultrassom Cisalhamento
Moagem em moinho de bolas Cisalhamento
Rompimento químico ou enzimático Hidrólise, solubilização ou desidratação de 
moléculas que compõem a parede ou a 
Membrana Celular
Concentração 
(purificação de 
baixa resolução)
Precipitação Solubilidade
Ultrafiltração (membranas) Massa molar e raio hidrodinâmico de 
moléculas
Extração em sistemas de duas fases 
líquidas
Solubilidade, massa molecular
Purificação de 
alta resolução
Cromatografia de troca-iônica Tipo e densidade da biomolécula
Cromatografia de afinidade Sítios específicos (adsorção)
Cromatografia de imunoafinidade Sítios específicos (antígeno/anticorpo)
Cromatografia de interação hidrofóbica Hidrofobicidade
Cromatografia de exclusão molecular Massa molar
Membranas adsortivas Massa molar e sítios específicos
Tratamentos 
finais
Cristalização Solubilidade e Características de equilíbrio 
líquido-sólido
Liofilização Características de equilíbrio sólido-vapor
Secagem
Características de equilíbrio líquido-vapor
Etapas de um 
Processo de 
Purificação
Clarificação
Separação das células suspensas de um meio de cultivo
A operação unitária adequada depende da faixa de dimensão da partícula a ser removida:
Operações unitárias viáveis em escala industrial:
• Filtração convencional
• Filtração tangencial
• Centrifugação
Filtração convencional
 Aplica-se à clarificação de grandes volumes de suspensões diluídas de células
 De produtos extracelulares
 Situações que não necessitam de condições de assepsia
 Aplicado principalmente para fungos filamentosos
Princípio de separação: principalmente tamanho da partícula 
A suspensão, sob pressão, é perpendicularmente direcionada a um meio filtrante (filtração
convencional).
A fração volumétrica que atravessa o meio filtrante é denominada filtrado e o depósito de sólidos
(sobretudo células) sobre o meio filtrante chama-se torta.
Alguns tipos de filtro:
1. Rotatório (mais adequado para meios biológicos, pois não é afetado pela
compressibilidade da torta)
2. De pressão
3. Folha (disco) horizontal
Filtração convencional
Filtro Rotativo a Vácuo (FRV)
• O tambor fica parcialmente submerso em um recipiente que contém a suspensão.
• Ocorre leve agitação para evitar a sedimentação.
• A suspensão é alimentada pela parte externa do tambor.
• A redução de pressão (vácuo), ocorre no interior do tambor, promovendo a filtração (formação da torta).
• Tambor oco e rotativo (1 rpm), coberto com uma malha metálica filtrante, recoberta com terra 
diatomácea.
Filtração convencional
Filtração Tangencial: microfiltração
Fluidos de alimentação escoam tangencialmente à superfície filtrante.
A tensão de cisalhamento do fluído minimiza o acúmulo de células e seus fragmentos na superfície das 
membranas.
Membrana de fibra oca
• Possuem elevada área filtrante por 
unidade de filtro.
• Bastante susceptíveis à entupimentos.
Membrana tipo placa e quadro
• Possuem pequenas áreas filtrantes por unidade 
de volume.
• A limpeza é fácil.
Filtração Tangencial: Microfiltração
 tecnologia já bem consolidada
 Suas vantagens sobre o processo de filtração são:
 Alta capacidade para pequenos volumes;
 Curto tempo de residência;
 Equipamento esterilizável por vapor;
 Limpeza e operação completamente automatizadas;
 Processamento do produto em condições assépticas;
 Processamentode microrganismos perigosos em sistema fechado;
 Inexistência de custos com auxiliares de filtração, membranas e produtos
químicos
Centrifugação
Princípio de separação: diferença de densidade (também o tamanho de partícula e viscosidade)
Método que acelera o processo de sedimentação por ação de um campo gravitacional centrifugo
Baseia-se na diferença de densidade entre a célula e o meio líquido, na viscosidade do meio líquido, 
na força motriz e a distância radial desde o centro da centrifuga até a célula e no diâmetro da 
partícula.
Centrifugação
Aplica-se em suspensões de no máximo 30 g/L de 
células
• Podem operar sob refrigeração 
• (13.000 a 17.000 x g)
• Capacidade limitada de volume
Centrífuga tubular
• Atuam em valores menores de centrifugação (5.000 a 
15.000 x g)
• Permite processamento contínuo 
• Reduzem o tempo necessário para centrifugação
Aplica-se em suspensões de no 
máximo 250 g/L de células
Centrífuga de disco
Etapas de um 
Processo de 
Purificação
• Tipo de microrganismo
• Tamanho da célula;
• Tolerância a tensões de cisalhamento;
• Necessidade de controle de temperatura;
• Gasto de energia;
 Aplicados após a separação e lavagem das células;
 Produtos associados às células (intracelulares) requerem o rompimento ou a permeabilização.
 Deve-se considerar alguns fatores:
Rompimento de células microbianas
 O equipamento de rompimento é selecionado com base no tipo de microrganismo, pois cada um
apresenta uma resistência específica ao rompimento.
 A escolha da técnica de rompimento determina o tamanho dos fragmentos celulares, que por sua
vez irão influenciar nas operações utilizadas para sua separação.
 A separação dos fragmentos celulares em solução é iniciada assim que as células foram
rompidas.
 Como resultado desta etapa o produto estará em uma solução com proteínas e outros
componentes solúveis.
Rompimento de células microbianas
As etapas até o término da fermentação influenciam o rompimento, ou seja, a susceptibilidade
ao rompimento varia:
de um organismo para outro
Ex. C. utilis é mais difícil de romper que S. cereviseae (tanto em alta pressão como em moinho de bolas)
com o estado fisiológico do organismo
Ex. - células crescidas em meio complexo são mais resistentes que as crescidas em meio simples
Métodos de Rompimento Celular
Parede Celular
Mecânicos Homogeneização a alta pressão
Agitação em moinho de bolas
Ultrassom (?)
Não Mecânicos Choque osmótico
Congelamento/descongelamento
Aquecimento
Secagem
Químicos Álcalis Ácidos
Solventes Detergentes
Enzimáticos Lise enzimática
Métodos de Rompimento Celular
Mecânico - Homogeneizador a alta pressão
Este tipo de rompimento provoca aumento
da temperatura do meio, por isso necessita
de sistema de refrigeração
Constituído por pistões projetados para a aplicação de altas pressões, forçando a passagem da
suspensão celular por um orifício estreito seguida de colisão contra uma superfície em uma câmara
de baixa pressão.
A redução instantânea da pressão
associada ao impacto provoca rompimento
celular sem danificar as
biomoléculas.
A quantidade de células rompidas é
proporcional à pressão empregada
Mecânico - Homogeneizador a alta pressão
O desempenho pode ser afetado por:
• Pressão de operação;
• Velocidade de alimentação;
• Temperatura;
• Estado fisiológico do microrganismo;
• Condições de cultivo;
• Tipo de célula e sua concentração.
 tamanho das células (maior => rompimento mais fácil)
 pressão (maior => maior eficiência)
Leveduras rompidas em homogeneizador de alta pressão
Mecânico – Moinho de Bolas
• Consiste na passagem da suspensão celular por uma câmara de trituração (vertical
ou horizontal) provida de um eixo com discos de agitação e preenchida com esferas
de vidro.
• O rompimento ocorre devido à força de cisalhamento aplicada pelas esferas de
vidro contra a parede celular das células.
Mecânico – Ultrassom
• O rompimento ocorre quando ondas sonoras
de altíssima frequência, são convertidas em
vibrações em um meio líquido e causam o
fenômeno de cavitação (isto é, áreas de vácuo
e compressão que se revezam).
• Com o tempo e as vibrações, as bolhas entram
em colapso, gerando uma onda de choques
que circundam pelo meio líquido, produzindo
uma tensão de cisalhamento.
• Deve-se controlar a temperatura
• Escala de laboratório (inviável em grande
escala)
Rompimentos Mecânicos
• Desvantagens:
• As elevadas forças de cisalhamento provocadas pelos rompimentos mecânicos podem destruir
organelas celulares e desnaturar enzimas;
• Com o rompimento integral das células todo o conteúdo intracelular, incluindo ácidos nucléicos,
organelas e fragmentos celulares é liberado junto com a molécula-alvo, sendo que o
homogeneizado celular pode conter grande quantidade de contaminantes e elevada viscosidade.
As células recolhidas são ressuspensas em solução
tamponada contendo 20% (m/v) de sacarose.
Após equilíbrio (~30 minutos) centrifuga-se novamente e
ressuspende-se o pellet em água destilada a 4 oC.
Mesmo não rompendo integralmente a célula, propicia
permeabilização seletiva, permitindo a saída da molécula
alvo.
Não-mecânico – Choque osmótico
Consiste em ciclos de congelamento e descongelamento, em velocidade e temperaturas adequadas.
A ruptura total ou parcial da parede celular se dá pela ação dos cristais de água formados (cristais de
gelo que perfuram a célula ou a lesionam).
Os fatores de importância a se considerar são: tipo de célula, sua idade, temperatura final de
congelamento e velocidades de congelamento e aquecimento.
 Método demorado e de difícil implantação em grande escala
 Enzimas sensíveis ao congelamento podem ser inativadas
Não-mecânico – Congelamento/Descongelamento
Enzimático - Lise enzimática
 As enzimas são capazes de hidrolisar paredes celulares de células microbianas.
 Quando uma certa quantidade de parede é removida, a pressão osmótica interna rompe a
membrana citoplasmática, permitindo que o conteúdo intracelular seja liberado para o meio
externo.
 As paredes celulares de leveduras possuem duas camadas principias, sendo uma camada externa
do complexo proteina-manana e uma interna, de glucana. O sistema enzimático para o seu
rompimento é composto, portanto, de diferentes enzimas como glucanases, proteases e
mananases.
Bactérias gram negativas e gram positivas apresentam paredes celulares com composição
diferentes, o que implica a necessidade de enzimas diferenciadas no processo.
As principais enzimas bacteriolíticas são: glicosidases, acetilmuramilalanina amidases,
neuroaminidase, endopeptidades e proteases.
Métodos enzimáticos de rompimento de células são adequados para a recuperação de
biomoléculas sensíveis à tensão de cisalhamento ou pressão de trabalho, geradas pelos métodos
mecânicos.
Enzimático - Lise enzimática
 Vantagens:
Facilidade do controle de pH e temperatura, baixo investimento de capital, alta
especificidade e possibilidade de associação com métodos mecânicos ou não
mecânicos.
 Desvantagens: alto custo das enzimas e variação da eficiência da lise
enzimática em função do estado fisiológico do microrganismo.
Fatores que devem ser considerados:
- Presença de inibidores
- Possibilidade de reciclo da enzima
Enzimático - Lise enzimática
Fornecimento 
de oxigênio
Fornecimento de oxigênio
 Os bioprocessos podem ser desenvolvidos com e sem aeração.
 Aeração natural ou forçada.
 Aeração natural  o oxigênio necessário ao cultivo provém do ar ambiente
 Ex: grande parte dos processos em superfície e em fermentação no estado sólido.
 O oxigênio é pouco solúvel em água  torna-se impossível fornecerde uma só vez todo o
oxigênio necessário a uma cultura em desenvolvimento, devendo o mesmo ser continuamente
suprido ao biorreator.
 Aeração forçada  o ar atmosférico esterilizado é normalmente borbulhado no meio, onde se
dissolve parte do oxigênio que é utilizado pelo agente da transformação.
 O grande campo de aplicação da aeração forçada situa-se nos processos submersos, que por
permitir uma mais rápida solubilização do oxigênio no meio, torna-o mais facilmente utilizável.
 Algumas vezes emprega-se oxigênio puro ou misturado ao ar, o que resulta em melhorias na
transferência de massa da fase gasosa para a líquida, com a consequente melhoria no
desempenho do Bioprocesso.
Fornecimento de oxigênio
Fornecimento de oxigênio
 O fornecimento de oxigênio a uma cultura em desenvolvimento, muitas vezes se constitui no
“gargalo” da tecnologia de produção.
 É comum, que determinadas fermentações aeradas, estejam limitadas em suas possibilidades de
melhorar rendimento e produtividade, não por razões inerentes à capacidade das células, mas
sim por problemas no projeto e operação de biorreatores.
 Para se determinar a taxa ótima de transferência de massa ou taxa de absorção de oxigênio da
fase gasosa para a líquida, deve-se atentar para dois aspectos: o suprimento e a demanda de
oxigênio.
Fornecimento de oxigênio
 O suprimento está relacionado às variáveis de ordem física, tais como: vazão de ar, velocidade
de agitação, grau de mistura, temperatura, geometria do biorreator etc, sendo estudado pelas
teorias clássicas de transferência de massa gás-líquido.
 Já a demanda está ligada à fisiologia da célula e diz respeito à quantidade de oxigênio dissolvido
necessária ao cultivo sendo, portanto, proporcional à massa de células.
 Define-se, assim, como demanda a quantidade de oxigênio necessária por unidade de tempo e
por unidade de volume de meio de cultivo ou em fermentação.
Fornecimento de oxigênio
 Se a demanda supera as possibilidades de suprimento, o crescimento se realiza com limitação de
oxigênio.
 Na prática, o ideal e o econômico seria igualar o suprimento à demanda, mas isto se torna difícil e
não recomendável devido à baixa solubilidade do oxigênio em meios líquidos.
 As temperaturas para a produção de biomoléculas por fermentação estão na faixa de 30oC e nesta,
a solubilidade do oxigênio em água pura é cerca de, apenas, 7 mg/L, diminuindo notoriamente
com o aumento da temperatura.
Fornecimento de oxigênio
 Em um meio de cultivo líquido a solubilidade do oxigênio torna-se ainda menor devido à
presença de solutos (células e sais). Por conseguinte, o potencial de transferência encontra-se
limitado pelo baixo valor da concentração de saturação de oxigênio dissolvido.
 A alta resistência à dissolução do oxigênio, nestas condições, resulta em um baixo valor para a
capacidade de oxigenação do biorreator.
 OBS: O sistema de fornecimento de ar deverá incluir necessariamente tubulações, válvulas,
medidores e reguladores de pressão, rotâmetros, pré-filtros e filtros de ar para a remoção de
todas as partículas maiores que 0,22 µm.
Bioprocessos anaeróbicos
 Os microrganismos agentes desses processos, além de sua importância clínica, apresentam
considerável importância ecológica, como também grande interesse industrial.
 O cultivo desses agentes biológicos, anaeróbios estritos, requer técnicas que efetivamente
removam o oxigênio (ar) do meio líquido e da fase gasosa em contato com fase líquida.
 Os biorreatores industriais utilizados nesses cultivos devem possuir alta relação altura:diâmetro,
e o borbulhamento de gases inertes, como nitrogênio, muitas vezes é requerido para assegurar
condições plenas de anaerobiose.
Bioprocessos anaeróbicos
 A taxa de reação em biorreatores é diretamente proporcional à concentração de biomassa.
 Em bioprocessos anaeróbicos, o rendimento em biomassa é baixo e a quantidade de células que
pode ser produzida a partir do(s) substrato(s) é limitada.
 A economicidade desses processos e as taxas de biorreação podem ser aumentadas pela
retenção da biomassa no sistema reacional, empregando técnicas de imobilização ou mesmo
pela adoção de configurações de biorreatores que permitam a retenção da biomassa, como os
biorreatores a membrana, ou com dispositivos internos de retenção de biomassa.
Extrapolação de Escala 
• A extrapolação de escala é um problema comum a vários ramos da Engenharia
Química.
• No caso de Bioprocessos conduzidos com células (microbianas ou não), entretanto,
o assunto tem tratamento especial. Além de se utilizar de conceitos estabelecidos
no tratamento de outros processos da indústria química, deve-se levar em
consideração, a característica especial de um bioprocesso para a produção de
substâncias de interesse comercial: a presença de um ser vivo.
Extrapolação de Escala 
• A redução de escala diz respeito à reprodução em equipamento piloto das
condições ambientais que possam ser obtidas na planta industrial, a fim de
permitir a obtenção de resultados aplicáveis à melhoria do processo já instalado na
fase maior.
• A extrapolação de escala se constituiu em um dos grandes desafios da Engenharia
Bioquímica. Muitas vezes ao se ampliar a escala de produção, obtêm-se resultados
diferentes e insatisfatórios àqueles obtidos em escalas reduzidas (laboratorial e
piloto).
• Isto se deve seguramente ao fato das condições ambientais não terem sido
mantidas constantes, afetando, consequentemente, o comportamento das células
do agente biológico em questão.
• A escala industrial depende do tipo de substância que se esteja produzindo. Obviamente que o
tamanho da escala será uma função de fatores econômicos ligados, principalmente, à demanda
do produto pelo mercado consumidor, bem como o seu valor agregado.
• Quanto menor o valor agregado do produto, maior a escala de produção, a fim de se garantir o
êxito econômico (rentabilidade) da empresa em relação ao capital nela investido.
Extrapolação de Escala 
• Na ampliação de escala, utiliza-se dados obtidos na otimização do processo em
escala piloto, ou de laboratório, para estabelecimento das variáveis de operação
na escala industrial.
• A regra básica na ampliação de escala em Bioprocessos é procurar manter, nas
diferentes escalas, as condições ambientais ótimas.
• Estaremos, assim, fornecendo as condições necessárias para se ter a
reprodutibilidade da atividade fisiológica do microrganismo (o agente da
transformação química do substrato em produto).
Extrapolação de Escala 
Extrapolação de Escala 
Há vários critérios para ampliação de escala, baseados na similaridade necessária para se conseguir as
mesmas respostas obtidas em escalas reduzidas.
Os critérios de similaridade usualmente utilizados no trato deste problema são os seguintes:
• similaridade geométrica: relação constante entre as dimensões lineares correspondentes nas duas
escalas;
• similaridade cinemática: manutenção da velocidade do fluido em pontos equivalentes nas duas
escalas;
• similaridade dinâmica: manutenção das forças aplicadas nas duas escalas;
• similaridade térmica: manutenção da temperatura em pontos equivalentes nas duas escalas;
• similaridade química: manutenção da composição química do meio em pontos equivalentes nas
duas escalas.