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Centrifugação A centrífuga é um aparelho para separar as partículas de sistemas que demorariam muito a se separarem só com a força da gravidade Há dois tipos principais de centrifugação: Preparatório: isolamento de partículas específicas Analítico: medida das propriedades físicas de uma partícula em sedimentação A centrifugação usa a força centrífuga para a separação, mas depende também do rotor e do tubo utilizado. Operações unitárias em Engenharia Química Centrifugação diferencial Teoria: as amostras são centrifugadas a uma dada velocidade, resultando em um sobrenadante e em uma fração do pélete. Pélete = mistura de todos os componentes sedimentados e não de todos aqueles que são desejados As amostras são isoladas proporcional a velocidade de sedimentação (tamanho de partículas) Centrifugação por gradiente de densidade Teoria: separação de partículas que têm a mesma densidade de flutuação, mas diferem em forma ou tamanho. A amostra é colocada sobre um gradiente de sacarose (15 a 40%) ou outro meio viscoso. A centrifugação deve ser interrompida quando as partículas forem separadas, mas antes que todas as partículas atinjam o fundo do tubo. Equipamentos As centrifugas costumam ser divididas de acordo com algumas de suas características Centrífuga de bancada: centrífuga para múltiplos fins. Não precisa estar necessariamente em cima de uma bancada, poderá aparecer sobre a mesa. Rpm em ângulo fixo: 14.000; em ângulo oscilante: 4800 Volume dos tubos: 2 – 180 mL Centrífuga clínica: sedimentação de soro, urina, células e sangue Rpm: 6000 Tubos: vários tipos de tubos de vidro são normalmente usados, desde capilares de hematócrito até tubos de 75 mL Microcentrífuga: precipitações em etanol. Células a baixa velocidade Rpm: ângulo fixo: 13.000 Tubos: eppendorf 0,5 – 2 mL Ultracentrífuga: concentração de vírus, isolamento de membrana e de fração subcelular, isolamento de DNA e RNA Rpm: 100.000 Tubos: nitrocelulose, polialômero As centrífugas de alta velocidade e as ultracentrífugas são constituídas com unidades de refrigeração, necessárias devido ao calor gerado pela alta velocidade. Outras são encontradas tanto em modelos refrigerados como não-refrigerados Equipamentos Modelo Fixo Bancada Clínica Multi-uso Alta velocidade Microcentrífuga Rotores Há quatro tipos principais de rotores: •Ângulo fixo; •Suporte oscilante; •Fluxo contínuo; •Zonal. Somente os rotores de ângulo fixo e de suporte oscilante (rotor horizontal) são equipamentos laboratoriais. Os outros dois são para uso muito especializado. Usos: concentração de amostras. É o braço forte do laboratório. Descrição: a amostra é colocada a um dado ângulo fixo ao plano de rotação. Vantagens: trabalha mais rápido. As substâncias têm uma força centrífuga relativa aumentada e são sedimentadas mais rapidamente do que o rotor com suporte oscilante. Por apresentarem poucas partes móveis, apresentam poucas falhas mecânicas. Desvantagens: como os materiais são forçados contra as paredes do tubo da centrífuga, eles escorrem pelas mesmas, causando a abrasão das partículas contra as paredes do tubo. Ângulo fixo Usos: separação de materiais. Frequentemente usada em trabalho clínico para separar suavemente as células. Descrição: permite que a amostra gire no eixo do plano de rotação. Vantagens: os materiais se movimentam por todo o comprimento do tubo da centrífuga e pelo meio dentro do tubo. Isso é suave para a amostra e permite a formação de gradientes e de camadas. Desvantagens: a força centrífuga aparentemente longa leva mais tempo para precipitar que a de ângulo fixo. Há muitas partes móveis, que podem se desgastar com o uso prolongado. Suporte oscilante (rotor horizontal) TUBOS UTILIZADOS COM ROTORES DIFERENTES Vedação rápida por calor para contenção de material de risco oak ridge- grandes volumes Tubos cônicos – excelentes péletes de células Microplacas Minicentrifuga Regras de trabalho Centrifugar materiais radioativos, com risco biológico ou infecciosos: usar a centrifuga apropriada e indicada para esses materiais. Cuidado, pois o rotor e a parte interna da centrífuga podem estar contaminados. Equilibre todos os tubos com os seus suportes, tampas, proteção e pinos. Não equilibre somente os tubos e sim todo o sistema de partes removíveis. Conheça as limitações de velocidade de cada centrífuga e rotor e não ultrapasse esses limites. Lembre-se de que os rotores de suporte oscilante não podem girar tão rápido quanto os rotores de ângulos fixo, por isso não faça suposições. Se o barulho da centrífuga parecer forçado, é provável que tenha ultrapassado a velocidade recomendada. Regras de trabalho Não use tubos com rachadura Como Centrifugar ? Escolha os tubos apropriados ao volume e a natureza do que você vai centrifugar. Use o menor número de tubos possível. Exemplo: centrifugar 1 L de material, usar 4 de 250 mL e não 20 de 50 mL. Lembrar que muitos tubos são adequados para baixas velocidades. Preencha os tubos até 2 cm da borda Saiba a que velocidade a amostra deve ser centrifugada. Saber também se é necessário que ela seja refrigerada. •Equilibre os tubos. Cada tubo deve ser centrifugado com um tubo do mesmo peso colocado do lado oposto. •Somente os tubos colocados frente a frente precisam ser do mesmo peso. •Tubos de microcentrifugas são ajustados pelo volume e não pelo peso. Os tubos desequilibrados e sem um contrapeso causam a maioria dos transtornos no uso da centrífuga. Como Centrifugar ? •Programe a centrífuga •Velocidade •Temperatura •Cronômetro Não pare o rotor manualmente! Poderá machucar você e também será prejudicial ao eixo do motor e às travas. Espere que o rotor pare completamente por si mesmo. Como Centrifugar ? Tubos de centrifuga Os volumes podem variar de microlitros a litros. O objetivo é tentar usar o menor número de recipientes. Os tubos com material biológico devem sempre conter tampa de rosca ou pressão, nunca devem ser deixados abertos. Caso você esteja sem tampa no momento, utilize pelo menos filmes plásticos, mas não papel alumínio ou rolos algodão, pois estes podem contaminar ou desintegrar. Tubos de centrifuga Os tubos podem ter o fundo arrendondado ou cônico. Na maioria dos casos, isso não importa. Num tubo cônico, centrifugado num rotor de suporte oscilante, o pélete formará um botão no fundo do tubo e será facil remover o sobrenadante sem pertubar o pélete. Mas centrifugar num rotor de ângulo fixo e num tubo cônico fará com que o pélete fique espalhado ao longo de um lado do tubo. Tubos de centrifuga Remoção de sobrenadantes Despejar fora o sobrenadante (decantação) Vantagem: rapidez Desvantagens: produz aerossóis, pode desalojar o pélete Aspirar o sobrenadantes Vantagem: delicado, não pertuba o pélete. Desvantagem: lento para volumes grandes Não consegui a formação de pélete, o que foi que houve? •A centrifugação pode não ter sido rápida ou longa o suficiente •O fluido de suspensão é muito espesso. •Pode não haver material suficiente para sedimentar Tente centrifugar mais tempo e mais rápido! A centrifuga não esta funcionando e agora? •Certifique que a centrifuga está ligada a tomada •Veja a velocidade ajustada: muitas pessoas terminam os seus trabalhos e deixam a centrifuga em 0 rpm, portanto é so aumentar. •Muitas centrifugas só entram em atividadequando estão na temperatura correta. •Muitas centrífugas só funcionam com a tampa fechada, portanto observe se a tranca “estalou”.
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