Aulas Expressão e Purificação de Proteínas

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Expressão e Purificação de Proteínas
Aula 3 – Expressão de Proteínas
Passo a passo - Amplificacao, sequenciamento, clonagem e expressao, purificacao, analise da estrutura e atividade da proteina.
Utiliza-se E.coli pois ela cresce rapido, o meio eh barato, por ser um meio mais simples ha menor chance de contaminacao.
Na E.coli e na Levedura ha possibilidade de fazer secrecao de proteina, porem ha alguns problemas na E.coli. A proteina nao pode ter modificacoes pos-traducionais.
Similaridade=troca no codon porem nao alteram a estrutura final, Identidade=nada eh alterado.
Aula 4 – Amplificacao e Clonagem de Sequencias Codificadoras (CDSs)
Busca por sequencia no NCBI ou outro banco de dados.
Obtem a sequencia.
PCR=Reacao em cadeia da polimerase. DNA polimerase + dNTPs + primers + molde + tampao + ciclos de temperatura. Passos = denaturacao, anelamento e extensao.
O que mais interessa na amplificacao=menos background, mais produto final, reprodutibilidade. As condicoes citadas anteriormente pode ser obtidas por desenho de primers, condicoes do ciclo e condicoes da reacao.
Desenho dos primers (oligonucleotideos) = tamanho de 15-24 baes, 50% de G e C, temperatura de melting entre 55C a 62C, minima alteracao na insercao de sitios de restricao, evitar estruturas secundarias, evitar primer-dimer, Tm proxima (2-3C).
Inibidores da Taq = fenol, EDTA, Sal, proteinase K.
Solucoes para: Banda arrastada ( primers, Mg++, maior temperatura de anelamento, touchdown PCR); mais no controle positivo (limpar DNA com fenol/cloroformio), banda inespecifica (checar primer-dimer, menor molde, touchdown PCR e hot start PCR), amplificacao fraca (ver todas as dicas), banda no negativo (trocar todos os reagentes).
Oligonucleotideo: complementar a fita mostrada e outro para a fita complementar (cópia da mostrada).
Aula 6 – Purificação usando TAGs de afinidade
Purificação Clássica de Proteínas: Lise (detergente, inibidores de protease), precipitação (sulfato de amônio, clorofórmio/metanol, etc), diálise (ex: membrana cut-off 3000Da), cromatografias (filtração em gel, hidrofóbica, troca iônica, afinidade), SDS-PAGE, detecção (atividade, interação com células, moléculas), Western-Blotting (anticorpo específico, localização, etc).
TAG em expressão de proteína: peptídeo ou proteína exógeno que se liga especificamente em ligantes ou moléculas biológicas.
Uso das TAGs: redução de tempo e custo, independente das características da proteína, protocolo de purificação simples, desenvolvimento simples de protocolo, um passo de cromatografia, protocolo de purificação uniforme no lab, 60% de estruturas originadas de proteínas com TAGs de His.
Efeitos positivos: aumenta rendimento da purificação, previne proteólise e perdas, facilita enovelamento e solubilidade, pouco imunogenicidade da fusão.
Efeitos a serem considerados: mudar bioquímica da proteína, diferença na estrutura, perda de atividade, remoção da cauda!
ProtA and Z domain: baseado na primeira fusão proteína A de E.coli, liga para porção Fc de IgG, Z é peptídeo da protA (1/5 massa) 7kDa
CBP: 26 aminoácidos da miosina de coelho, liga para calmodulina, em células de mamíferos pode ligar a outras proteínas, vetor pCal.
MBP: 40kDa, fusão com MPB de E.coli, esconde sítios de protease, altos níveis de expressão e solubilidade, vetor pMAL.
Tiorredoxina: fusão com tiorredoxina de E.coli, muito solúvel, coluna de oxido de fenilarsina, eluição cim b-mercaptoetanol, suporta 80ºC por 5 minutos.
FLAG: reconhecido pelo anticorpo M1 na coluna, eluição com EDTA (liga Ca2+), sítio DDK para entrokinase, mais usada para detecção em anticorpos.
Aula 7 – Caracterização Proteica
Dicroísmo Circular
A fluorescência do triptofano depende do ambiente
Maior polaridade: red shift (mudança para vermelho do espectro)
Menor polaridade: blue shift
Sondas Extrínsecas:
ANS: liga para regiões hidrofóbicas 
Supressão de Fluorescência
Iodeto de Sódio (polar)
Acrilamida (menos polar)
Anisotropia de Fluorescência: permite observar mudanças na capacidade de movimento.
Espectrometria de Massas:
Digestão da proteína com Tripisina: Cliva no grupo carboxi de Lisina (K) e Arginina (R)
MALDI-TOF
Aula 8 – Renovelamento de Proteínas
Sem engenharia do alvo:
Teste de temperatura
Temperatura reduz hidrofóbicas, <HSP proteases>exoressão (alvo)
Chaperones, trabalho com promotores.
Teste de linhagens
Modificação da cultura
Co-expressão de chaperoninas
Co-expressão com proteínas parceiras da recombinante
Com engenharia do alvo:
Proteina em fusão
Seleção de multantes solúveis
Mutação sítio-dirigida, evolução in vitro de proteínas
Deleção e adição de fragmentos, mutações aleatórias
Métodos Alternativos
Fusão com oleosina e ressolubilização com corpos oleosos
Expressão com proteínas ribossomais