POP Bioquimica Biotecnica

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LABORATÓRIO: ______________________________________________________________ Pág. 1/117POP - 003/01- B
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO 
ALFA-AMILASE 
 
 
 
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica 
 
 
2 
Índice 
 Página Revisão 
ÁCIDO ÚRICO - Método Enzimático Colorimétrico - UOD-PAP............................................ 03 00 
ALBUMINA - Método Colorimétrico Verde de Bromocresol................................................... 07 00 
ALFA-AMILASE - Método Cinético Gal G2 – CNP................................................................ 11 00 
BILIRRUBINA DIRETA E TOTAL - Método Colorimétrico Malloy-Evelyn – DMSO………. 16 00 
CÁLCIO ASX -Método ARSENAZO III ................................................................................. 20 00 
CÁLCIO - Método Colorimétrico (o-CRESOLFTALEÍNA)...................................................... 24 00 
CLORO - Método Colorimétrico (Mercúrio – Tiocianato) ...................................................... 28 00 
COLESTEROL - Método Enzimático Colorimétrico .............................................................. 32 00 
HDL COLESTEROL DIRETO - Método Enzimático Colorimétrico Direto – Sem 
precipitação............................................................................................................................. 
 
36 
 
00 
HDL COLESTEROL - Método Precipitante – Ácido Fosfotúngstico...................................... 41 00 
CREATININA - Método Cinético Colorimétrico...................................................................... 45 00 
CREATINO QUINASE (CK-NAC) -Método Cinético – UV..................................................... 50 00 
CREATINO QUINASE – MB (CK-MB) - Método Cinético – UV............................................. 54 00 
FERRO Ferrozine - Método Colorimétrico............................................................................. 58 00 
FERRO CRX - Método Cromazurol B .................................................................................... 62 00 
FOSFATASE ALCALINA - Método Cinético Colorimétrico (DGKC – DEA).......................... 66 00 
FÓSFORO – UV - Método Molibdato .................................................................................... 70 00 
FRUTOSAMINA – Método Cinético Colorimétrico................................................................. 74 00 
γ - GLUTAMILTRANSFERASE (GAMA - GT) - Método Cinético Colorimétrico.................... 77 00 
GLICOSE - Método Enzimático Colorimétrico ....................................................................... 81 00 
MAGNÉSIO MONO - Método colorimétrico - MAGON SULFONADO................................... 85 00 
PROTEÍNA TOTAL - Método Colorimétrico .......................................................................... 90 00 
PROTEÍNA URINÁRIA - Método Vermelho de Pirgalol......................................................... 94 00 
TGO / AST - Método Cinético – UV........................................................................................ 98 00 
TGP / ALT - Método Cinético – UV........................................................................................ 102 00 
TRIGLICÉRIDES - Método Enzimático Colorimétrico............................................................ 106 00 
URÉIA ENZIMÁTICA - Método Enzimático Colorimétrico ..................................................... 110 00 
URÉIA UV - Método Cinético Enzimático – UV ..................................................................... 114 00 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica 
 
 
3 
 
ÁCIDO ÚRICO 
 
Método Enzimático Colorimétrico 
UOD-PAP 
 
1. INDICAÇÃO MÉDICA 
 
Esta dosagem é utilizada principalmente na avaliação de enfermidades renais, doenças metabólicas genéticas e patologias 
como leucemias, linfomas, etc. 
 
2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO 
 
Sangue: o ácido úrico é o produto final do metabolismo das purinas, estando elevado em várias situações clínicas além da 
gota. Somente 10% dos pacientes com hiperuricemia têm gota. Níveis elevados também são encontrados na insuficiência 
renal, etilismo, cetoacidose diabética, psoríase, pré-eclâmpsia, dieta rica em purinas, neoplasias, pós-quimioterapia e 
radioterapia, uso de paracetamol, ampicilina, aspirina (doses baixas), didanosina, diuréticos, beta-bloqueadores, dentre 
outras drogas. Diminuição dos níveis é encontrada na dieta pobre em purinas, defeitos dos túbulos renais, porfiria, uso de 
tetraciclina, alopurinol, aspirina, corticóides, indometacina, metotrexato, metildopa, verapamil, intoxicação por metais 
pesados e no aumento do “clearance” renal. 
Urina: cerca de 70% do ácido úrico é eliminado pelos rins. Esta dosagem é útil em pacientes com cálculos urinários para 
identificação daqueles com excreção urinária de urato aumentada. Álcool causa diminuição do urato urinário. Anti-
inflamatórios, vitamina C, diuréticos e warfarim podem interferir no resultado. 
Líquido sinovial: pode ser útil no diagnóstico diferencial de artropatias. 
 
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO 
 
No presente método, o ácido úrico da amostra sofre a ação da uricase, na presença de oxigênio, produzindo alantoína e 
peróxido de hidrogênio, este em presença de um reagente fenólico (TOOS) e da 4-aminoantipirina, sofre a ação da 
peroxidase produzindo um complexo violáceo (quinonimina), com máximo de absorção em 500 nm. 
 
Ácido Úrico + O2 + 2H2O uricase Alantoína + CO2 + H2O2 
 
2H2O2 + 4-aminoantipirina + TOOS peroxidase Quinonimina + 3H2O 
 
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA 
 
Preparo do paciente 
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas. 
 
Amostras 
Soro, urina e líquido sinovial. Não usar plasma, pois obtem-se resultados falsamente diminuídos. 
Soro: obtido da maneira usual. Separar dentro das próximas 2 horas da coleta. Soros ictéricos ou com hemólise 
produzem valores falsamente elevados. O fluoreto inibe a Uricase. 
Urina: de 24 horas, separar 10 mL, acertar o pH entre 7,0 e 9,0 com hidróxido de sódio a 5% e aquecer 10 minutos a 56°C 
para dissolver os cristais de urato e ácido úrico, evitando resultados falsamente diminuídos. Diluir a urina 1:20 com água 
destilada ou deionizada e fazer a determinação. Multiplicar o resultado por 20. 
Líquido sinovial: a coleta não deve ser feita antes de decorridos 07 dias da última punção, ou antes de 30 dias após a 
administração de medicamento intra-articular. 
 
Armazenamento e estabilidade das amostras: 
Soro: O analito é estável 03 dias entre 2-8oC ou 06 meses a –10oC (10oC negativos). Não utilizar plasma, pois apresenta 
resultados falsamente diminuídos. 
Urina: Manter refrigerado. 
Líquido sinovial: Até 15 dias entre 2-8oC. 
 
Volumes mínimos e ideal 
y A serem definidos pelo próprio laboratório. 
 
Critérios para a rejeição de amostras 
Urina: presença de ácido ascórbico. 
y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material. 
 
5. COMPONENTES DO KIT 
 
ÁCIDO ÚRICO - UOD-PAP Registro M.S.: 80027310038 
Códigos: BT 10.001 – 1 fr com 250mL + 1 fr Padrão – 2,0 mL. 
 
BioTécnica Indústria e Comércio Ltda 
Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil. 
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica 
 
 
4 
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646 
Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br 
 
Reagente: Tampão Fosfato pH, 7.0 – 50 mmol, Uricase 450 U/L, Peroxidase 2500 U/L, 4-aminoantipirina 0,3 mmol/L; 
TOOS 0,34 mmol/L e conservantes. 
Padrão: Solução de Ácido Úrico (valor da concentração do padrão vide etiqueta do frasco) 
 
y Reagente pronto para uso. 
y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit. 
y Conservar entre 2 – 8 º C 
 
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO 
 
Manter todos os componentes entre 2 e 8 °C. NÃO CONGELAR.Evitar deixar em Temperatura Ambiente por períodos prolongados, evitando assim a deterioração das enzimas. 
Se o reagente for mantido de 15 – 25°C, protegido da luz, sua estabilidade será de 2 semanas 
O reativo é estável até a data de validade do Kit. A data de validade aparece no rótulo da embalagem. 
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas. 
 
7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO 
 
Procedimento técnico manual 
y Espectrofotômetro ou fotômetro para leitura de 500 nm (490-510), com cubetas. 
y Banho de água a 37 °C. 
y Pipetas automáticas.e ponteiras 
y Cronômetro 
y Tubos de ensaio. 
 
Procedimento automatizado 
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para 
utilização do mesmo. 
 
Procedimento alternativo 
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas 
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados. 
 
8. CONTROLE DE QUALIDADE 
 
Materiais 
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência 
da utilização dos mesmos. 
 
Limites de tolerância 
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings 
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer 
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle. 
 
Verificação de novo lote de controle e/ou reagente 
Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes. 
 
Gerenciamento dos dados 
Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou 
POP da garantia da qualidade. 
 
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES 
 
y O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro. 
y Seguir com rigor a metodologia proposta, para a obtenção de resultados exatos. 
y Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos e biológicos devem ser observados. 
y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material 
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar 
apropriado para material potencialmente infectante. 
y O reagente e o padrão não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas. 
y O nível de água no banho-maria deve ser superior ao dos tubos de ensaio que contém as reações. 
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente. 
y Não é necessário nenhum tipo de proteção respiratória, mas recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas 
descartáveis durante o manuseio das substâncias. 
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente. 
y Em caso de ingestão procurar atendimento médico. 
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica 
 
 
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y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança. 
y Não misturar ou trocar diferentes lotes de reativos. 
y Não utilizar o reativo quando este mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação. 
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria 
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou 
deionizada. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente 
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção 
de resultados corretos.Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos 
materiais. 
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não 
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados 
errôneos. 
 
10. PROCEDIMENTO TÉCNICO 
 
Preparação do reativo: 
Reativo pronto pra uso 
 
Procedimento manual 
1. Os reagentes devem estar à temperatura ambiente. 
2. Pipetar em tubos de ensaio: 
 
 Branco Padrão Amostra 
Água destilada 
Padrão 
Amostra 
Reagente 
20μL 
- 
- 
1,0mL 
- 
20μL 
- 
1,0mL 
- 
- 
20μL 
1,0mL 
 
3. Agitar bem e incubar os tubos durante 15 minutos à temperatura ambiente (16-25 °C) ou durante 10 minutos a 37°C. 
4. Ler a absorbância (A) do Padrão e da Amostra frente ao Branco a 500 nm (490-510nm). A cor é estável durante 30 
minutos. 
5. Para espectrofotômetros que requeiram volumes de leitura superiores aos indicados, usar 50 μl de amostra ou padrão e 
2,0 mL de reagente. 
y Os volumes de amostra e de reagentes podem ser modificados proporcionalmente, sem prejuízos para o desempenho 
do teste. Os cálculos permanecem inalterados. Em caso de redução dos volumes é fundamental que se observe o 
volume mínimo necessário para a leitura fotométrica. Volume de amostra menores que 10 μL (10 microlitros = 0,01 mL) 
são críticos em aplicações manuais e devem ser usados com cautela, pois aumentam a imprecisão da medição. 
 
Dosagem na urina: 
• Homogeneizar a urina, medir o volume e separar uma amostra de cerca de 20 mL. Ajustar o pH para a faixa entre 7 e 9 
com NaOH 5% e aquecer a amostra durante 10 minutos a 56ºC. Este procedimento dissolve cristais de ácido úrico 
presentes, evitando resultados falsamente diminuídos. 
• Diluir a urina assim tratada 1:10 (0,1 mL de urina + 0,9 mL de água destilada ou deionizada), procedendo à dosagem 
como descrito acima para o soro. 
• Multiplicar o resultado obtido por 10. 
 
Procedimento automatizado 
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes 
para o sistema automático (Programação ou Protocolo). 
 
Cuidados especiais 
y Como ocorre com toda reação enzimática, a rigorosa observação do tempo e da temperatura de incubação é de 
grande importância para a qualidade dos resultados obtidos. 
y Para soro lipêmico e/ou com bilirrubina superior a 10 mg/dL, misturar 1,0 mL de NaCl 0,9% e 0,02 mL de soro. Ler em 
520 nm ou filtro verde, acertando o zero com água. Diminuir a absorbância assim obtida, da absorbância do teste e 
calcular a concentração. 
y Se houver suspeita da presença de ácido ascórbico, deixar o soro em repouso durante 90 minutos antes de iniciar a 
dosagem, para que resultados falsamente diminuídos não sejam obtidos. 
 
11. CÁLCULOS 
 
Abs. Teste x Valor padrão mg/dL = mg/dL ácido úrico 
Abs. Padrão 
 
Onde: Abs. Teste → Absorbância do teste 
Abs. Padrão → Absorbância do Padrão 
Valor padrão mg/dL → valor da concentração do Padrão (vide etiqueta do frasco) 
 
Devido à ótima reprodutibilidade, que pode ser obtida com a metodologia, pode-se utilizar o método do fator: 
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica 
 
 
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Fator de calibração = Conc. do Padrão . Concentração do Padrão – Vide etiqueta do frasco. 
Absorbância do Padrão 
 
Ácido Úrico (mg/dL) = Absorbância do Teste x Fator 
 
Cálculo p/ Urina: Urina (mg/24 h) = mg/dL x volume urinário (em mL) 
100 
 
12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS 
 
Unidade utilizada: mg/dL 
UNIDADES: Sistema Internacional (SI): mg/dL ácido úrico x 59,5 = mmol/L ácido úrico 
 
Valores de referência 
Para amostras de Soro e Plasma: 
y Homens: 2,5 a 7,0 mg/dL = 148 a 416 mmol/L 
y Mulheres: 1,5 a 6,0 mg/dL = 89 a 356 mmol/L 
Para amostras de Urina: 
y 250 a 750 mg/24horas. 
Para amostras de Líquido sinovial: 
y Valores próximos ao do soro colhido na mesma ocasião. 
Esses valores são unicamente orientativos. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de 
referência. 
 
13. CARACTERÍSTICASDO MÉTODO 
 
y Linearidade 
Reação linear até 20 mg/dL (1190 mmol/L) 
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos 
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório. 
 
y Interferências 
O ácido ascórbico > 0,3 mmol/L, a hemoglobina > 1g/L e bilirrubina > 15 mg/dL interferem. 
A lipemia pode afetar os resultados. 
Falsos Valores elevados: acetozolamida, clorotiazida, furosemida, metildopa, fenotiazida, salicilatos, etc. 
Falsos Valores baixos: vitamina C (ácido ascórbico), acetohexamida, alopurinol, azatiopina, probemicida, mercaptopurina, 
coumarim, estrógenos, sulfinpirazona, etc. 
 
14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS 
 
y Barham D, Trinder P. Analyst 1972; 27:142-145. 
y Fossati P, Prencipe L, Bert G. Clin Chem 1980; 26:227-231. 
y Pagana K.D. : Mosby’s diagnostic and laboratory test reference 1992, 754-758. 
y Guyton, Fisiologia humana e Mecanismos das doenças 1993, 5ªedição. 
y Ácido Úrico – Bula do Kit – Biotécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005. 
y Inmetro – Boas Práticas de Laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro, 
1997. 
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 11-12. 
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 58-59 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica 
 
 
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ALBUMINA 
 
Método Colorimétrico 
Verde de Bromocresol 
 
1. INDICAÇÃO MÉDICA 
 
Esta dosagem é utilizada na avaliação do estado nutricional, de enfermidades hepáticas avançadas, enfermidades renais e 
casos de desidratação grave. 
 
2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO 
 
A albumina é uma proteína globular produzida pelo fígado que é o principal componente protéico de um soro humano 
normal. Tem diversas funções importantes: 
y Transporte de moléculas hidrofóbicas como a bilirrubina e os ácidos graxos. Isto é possível devido a zona 
hidrofóbica que existe em sua estrutura. Esta característica é utilizada para dosar a albumina. 
y Nutrição; 
y Manutenção da pressão osmótica sangüínea; 
y Variações nos níveis séricos de albumina não são específicos já que podem ser devido a um grande número de 
alterações, no entanto é útil para monitorar o estado do paciente. 
Havendo lesão hepática ou renal teremos distúrbios que podem ser resumidos em: 
y Hipoalbuminemia: que ocorre nas doenças hepáticas crônicas, na síndrome nefrótica e casos de desnutrição grave. 
Essa redução está relacionada a diminuição da síntese hepática ou perda excessiva renal, levando a uma diminuição 
da pressão coloidosmótica do plasma provocando um aumento de reabsorção de sódio e água e conseqüentemente 
causando edema, icterícia e anemia dilucional. 
y Hiperalbuminemia: é observada em casos de desidratação grave e queimaduras externas, onde teremos a perda 
excessiva de água causando uma hemoconcentração. 
Em algumas situações clínicas, o conhecimento dos níveis de albumina é suficiente e até pode oferecer algumas vantagens 
em relação à proteína. 
 
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO 
 
A albumina presente na amostra reage com o verde de bromocresol em meio ácido, formando um complexo colorido que é 
quantificado espectrofotometricamente. 
 
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA 
 
Preparo do paciente: 
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas. Realizar a coleta pela manhã 
 
Amostras: 
Soro, líquido pleural ou líquido ascítico. 
Soro: obtido da maneira usual. 
Líquido pleural ou líquido ascítico: O material não é colhido no laboratório. O exame é feito somente com material 
enviado até 06 horas depois da coleta. 
 
Armazenamento e estabilidade das amostras: 
Soro: O analito é estável 3 dias entre 2 – 8°C e 7 dias a – 10oC (10°C negativos.) 
 
Volumes mínimos e ideal 
y A serem definidos pelo próprio laboratório. 
 
Critérios para a rejeição de amostras 
Presença de lipemia intensa. 
y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material. 
 
5. COMPONENTES DO KIT 
 
ALBUMINA Registro M.S.: 80027310032 
Códigos: BT 10.002 - 1 fr de 250 mL + 1 fr de Padrão - 2,0 mL 
 
BioTécnica Indústria e Comércio Ltda 
Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil. 
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646 
Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br 
 
Reagente: Tampão Succinato 0,88 mmol – pH 4,2 , verde de bromocresol 0,17 mmol/L, azida sódica 9mmol. 
Padrão: Solução de Albumina (valor da concentração do padrão vide etiqueta do frasco) 
 
y Reagente pronto para uso. 
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica 
 
 
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y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit. 
y Conservar a temperatura ambiente 
 
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO 
 
Manter todos os componentes a temperatura ambiente. 
Manter ao abrigo da luz. 
O reativo é estável até a data de validade do Kit. A data de validade aparece no rótulo da embalagem. 
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas. 
 
7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO 
 
Procedimento técnico manual 
y Espectrofotômetro ou fotômetro para leituras a 630 nm (620-640), com cubetas 
y Banho de água a 37 °C. 
y Pipetas automáticas.e ponteiras 
y Cronômetro 
y Tubos de ensaio. 
 
Procedimento automatizado 
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para 
utilização do mesmo 
 
Procedimento alternativo 
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas 
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados. 
 
8. CONTROLE DE QUALIDADE 
 
Materiais 
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência 
da utilização dos mesmos. 
 
Limites de tolerância 
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings 
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer 
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle. 
 
Verificação de novo lote de controle e/ou reagente 
Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes. 
 
Gerenciamento dos dados 
Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou 
POP da garantia da qualidade. 
 
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES 
 
y O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro. 
y Seguir com rigor a metodologia proposta, para a obtenção de resultados exatos. 
y Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos e biológicos devem ser observados. 
y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material 
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar 
apropriado para material potencialmente infectante. 
y O reagente e o padrão não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas. 
y O nível de água no banho-maria deve ser superior ao dos tubos de ensaio que contém as reações. 
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente. 
y Não é necessário nenhum tipo de proteção respiratória, mas recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas 
descartáveis durante o manuseio das substâncias. 
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente. 
y Em caso de ingestão procurar atendimento médico. 
y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança. 
y Não misturar ou trocar diferentes lotes de reativos. 
y Não utilizar o reativo quandoeste mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação. 
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria 
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou 
deionizada. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente 
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção 
de resultados corretos. Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos 
materiais. 
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica 
 
 
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y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não 
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados 
errôneos. 
y O reagente contém azida sódica que é tóxica, portanto, tomar cuidado para evitar a ingestão e no caso de contato com 
os olhos, lavar imediatamente com grande quantidade de água e procurar auxílio médico. No descarte do reagente, 
usar bastante água, pois a azida pode formar compostos explosivos com tubulações de cobre e chumbo. 
 
10. PROCEDIMENTO TÉCNICO 
 
Preparação do reativo: 
Reativo pronto pra uso 
 
Procedimento manual 
1. Pipetar em tubos de ensaio: 
 
 Branco Padrão Amostra 
Padrão Albumina 
Amostra 
Reagente 
- 
- 
1,0 mL 
5 μL 
- 
1,0 mL 
- 
5 μL 
1,0 mL 
 
2. Agitar bem e deixar nos tubos durante 10 minutos à temperatura ambiente. 
3. Ler a absorbância (A) do Padrão e da Amostra frente ao Branco a 630 nm. A cor é estável durante 30 minutos. 
4. Para espectrofotômetros que requeiram volumes de leitura superiores aos indicados, usar 0,05 ml de amostra ou padrão 
e 2 mL de reagente. 
y Os volumes de amostra e de reagentes podem ser modificados proporcionalmente, sem prejuízos para o desempenho 
do teste. Os cálculos permanecem inalterados. Em caso de redução dos volumes é fundamental que se observe o 
volume mínimo necessário para a leitura fotométrica. Volume de amostra menores que 10 μL (10 microlitros = 0,01 mL) 
são críticos em aplicações manuais e devem ser usados com cautela, pois aumentam a imprecisão da medição. 
 
 
Procedimento automatizado 
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes 
para o sistema automático (Programação ou Protocolo). 
Cuidados especiais 
y Para manusear e descartar reagentes e material biológico, aplicar as normas de segurança estabelecidas. Fazer 
referência ao Manual ou POP de Segurança. 
 
11. CÁLCULOS 
 
Abs. Amostra x conc. Padrão = g/dL Albumina 
Abs. Padrão 
 
Onde Abs. Amostra → Absorbância da Amostra 
 Abs. Padrão → Absorbância do Padrão 
 Conc. Padrão → valor da concentração do Padrão (vide etiqueta do frasco) 
 
Devido a grande reprodutibilidade, que pode ser obtida com a metodologia, pode-se utilizar o método do fator: 
 
Fator de calibração = Conc. do Padrão . Concentração do Padrão – Vide etiqueta do frasco. 
Absorbância do Padrão 
 
Albumina (g/dL) = Absorbância do Teste x Fator 
 
Globulina = Proteína Total – Albumina 
Relação A/G = Albumina / Globulina 
 
12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS 
 
Unidade utilizada : g/dL 
UNIDADES: Sistema Internacional (SI): µmol/L = g/dL x 144,9 
g/L = g/dL x 10 
 
Valores de referência 
Os valores são normais entre 3,5 e 4,8 g/dL. 
Estes valores são unicamente orientativos. Recomendamos que cada laboratório estabeleça seus próprios intervalos de 
referência. 
 
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica 
 
 
10 
13. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO 
 
y Linearidade 
Reação linear até 6 g/dL 
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos 
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório. 
 
y Interferências 
A bilirrubina > 25 mg/dL e a hemoglobina > 1 g/L interferem no método. 
Falsos Valores elevados: o uso de torniquete por mais de 3 minutos provoca um aumento no valor. 
Falsos Valores baixos: plasmas obtidos com heparina, lítio e oxalato de potássio combinando com fluoreto de sódio, 
fornecem resultados falsamente diminuídos. 
 
14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS 
 
y Doumas B. T: Watson, WA & Biggs H.G. – Clin. Chim. Acta. 1971;31:1:87. 
y Henry, R; Sobel, C. & Berkman, S. – Anal. Chem. 29/10:1491 (1957). 
y Jacobs DS, Kasten Jr. BL. – Laboratory Test Handbook, Hudson. Lexi-Comp Inc., 1996, 66. 
y Albumina – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005. 
y Inmetro – Boas Práticas de laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro, 
1997. 
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 11-12. 
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 58-59 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica 
 
 
11 
ALFA-AMILASE 
 
Método Cinético 
Gal G2 - CNP 
 
1. INDICAÇÃO MÉDICA 
 
Esta dosagem é utilizada na avaliação de enfermidades pancreáticas agudas ou crônicas e no diagnóstico da parotidite 
(caxumba). 
 
2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO 
 
A α – amilase é uma hidrolase que degrada complexos de carboidratos, sendo, predominantemente, de origem pancreática 
e da glândula salivar. São conhecidas duas isoenzimas: a pancreática e a salivar, na proporção de 40:60 em soro de 
indivíduos sadios. As dosagens da amilase sérica e urinária são amplamente utilizadas no diagnóstico de doenças do 
pâncreas, bem como na investigação da função pancreática. Na maioria dos pacientes com pancreatite aguda, seus níveis 
séricos elevam-se duas a 12 horas após o início do episódio, atingindo pico em 24 horas e retornando ao normal entre 48 a 
72 horas. A magnitude da elevação sérica não é diretamente relacionada com a gravidade do envolvimento pancreático, 
mas indica, com grande probabilidade, um diagnóstico de pancreatite aguda. Aumentos da amilase sérica não são 
necessariamente devidos à pancreatite. Tumores de pulmão e de ovário podem produzir hiperamilasemia em torno de 50 
vezes do intervalo de referência. Em torno de 25% da amilase sérica é normalmente eliminada na urina. Na insuficiência 
renal está aumentada em proporção à extensão do comprometimento renal. Amilase sérica normal pode ser encontrada 
(em torno de 20%) em pacientes com pacreatite aguda. Em episódios agudos de pancreatite crônica, níveis de amilase 
podem estar ligeiramente aumentados, porém, freqüentemente, permanecem em níveis normais. 
A amilase pode ligar-se a proteínas (ex.: imunoglobulinas), formando complexos de alto peso molecular denominados 
macroamilases. Isso é caracterizado por amilase sérica elevada e urinária normal e pode ocorrer em indivíduos sadios. 
Níveis aumentados 
Parotidite 
Pancreatite aguda 
Macroamilasemia 
Gravidez ectópica 
Oclusão mesentérica 
Queimaduras graves 
Lesão de glândula salivar 
Doença intra-abdominal (peritonite, apendicite aguda etc.) 
Intoxicação alcoólica 
Insuficiência renal grave 
Obstrução das vias biliares 
Obstrução intestinal 
Obstrução do canal pancreático 
Câncer de pâncreas 
Cetoacidose diabética 
Neoplasias (pulmão ou ovário) 
Níveis diminuídos 
Insuficiência pancreática 
Fibrose cística avançada 
Hepatopatias graves 
 
AMILASE URINÁRIA 
 
Uma quantidade significativa de amilase sérica é excretada na urina e, portanto, elevações séricas serão refletidas na 
mesma. A amilase urinária parece atingir níveis mais elevados, persistindo por períodos mais longos, quando comparada 
com a sérica. A macroamilasemia se caracteriza por elevaçãodos níveis séricos de amilase com valores urinários normais. 
A relação entre o clearance de amilase/creatinina auxilia no diagnóstico diferencial da macroamilasemia (clearance muito 
baixo). A relação normal é de 1% a 4%. Encontra-se aumentada na pancreatite aguda, diminuída na macroamilasemia e 
normal ou pouco diminuída na hiperamilasemia salivar. 
 
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO 
 
A α-amilase catalisa a hidrólise do 2-cloro-4-nitrofenil-α-galactosilmatóside (Gal-G2-α-CNP) liberando 2-cloro-4-nitrofenol. A 
quantidade de 2-cloro-4-nitrofenol liberada é medida a 405 nm, sendo proporcional à atividade da enzima no soro. 
 
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA 
 
Preparo do paciente 
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas. Realizar a coleta pela manhã. 
 
Amostras 
Pode ser usado soro, urina, líquido pleural ou líquido ascítico. 
Soro: obtido da maneira usual. 
Urina: de 2 a 24 horas, sem conservantes. Colhido de maneira usual. Quando se determina a amilase na amostra de urina, 
deve-se também determinar a creatinina na mesma amostra. O resultado deverá ser reportado com Relação 
amilase/Creatinina (U/g), com o objetivo de compensar as variações de atividade da amilase em amostras obtidas de cada 
micção. 
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica 
 
 
12 
Líquido pleural ou líquido ascítico: O material não é colhido no laboratório. O exame é feito somente com material 
enviado até 06 horas depois da coleta. 
 
Armazenamento e estabilidade das amostras: 
A α-amilase em soro e plasma é estável pelo menos por 5 dias a 2-8ºC. A heparina não interfere como anticoagulante. 
A dosagem da amilase urinária deve ser feita em urina de 2 a 24 horas, mantida entre 2 e 8oC, sem conservantes. 
Outros líquidos biológicos também devem ser colhidos sem conservantes, 
 
Volumes mínimos e ideal 
y A serem definidos pelo próprio laboratório. 
 
Critérios para a rejeição de amostras 
Presença de hemólise ou sinais de contaminação bacteriana. 
y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material 
 
5. COMPONENTES DO KIT 
 
 α - AMILASE - Gal G2 - CNP Registro M.S.: 80027310013 
Códigos: BT 11.001.00 – 2 fr com 15mL 
 BT 11.001.00 – 2 fr com 30mL 
 
BioTécnica Indústria e Comércio Ltda 
Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil. 
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646 
Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br 
 
Reagente Substrato: Tampão biológico pH 6,00 – 50 mmol/L; Cloreto de sódio – 70 mmol/L; Cloreto de cálcio – 6 mmol/L; 
Gal G2 – CNP 2,22 mmol/L 
 
y Reagente pronto para uso. 
y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit. 
y Conservar entre 2 – 8 º C 
 
Cuidados especiais: 
- Pipetar o substrato com a boca, soprar no substrato, usar material contaminado com saliva e suor e conversar 
junto ao frasco destampado são ações que podem contaminar o reagente com quantidades microscópicas de 
saliva ou suor, capazes de deteriorar irreversivelmente o substrato. 
- Segundo estudos de estabilidade a absorbância do substrato, medida contra a água, apresenta um acréscimo de 
0,003 por mês. Elevações repentinas da absorbância do substrato indicam contaminação com saliva ou suor, 
capazes de deteriorar irremediavelmente o substrato. 
- Não utilizar o reagente quando sua absorbância, medida contra a água em 405 nm, for igual ou maior que 0,005 
ou quando mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação. 
 
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO 
 
Manter todos os componentes entre 2 e 8 °C. NÃO CONGELAR. 
Evitar deixar em Temperatura Ambiente por períodos prolongados, evitando assim a deterioração das enzimas. 
O reativo é estável até a data de validade do Kit. A data de validade aparece no rótulo da embalagem. 
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas. 
 
7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO 
 
Procedimento técnico manual 
y Espectrofotômetro ou fotômetro para leituras a 405 nm, com cubetas termostatizadas 
y Pipetas automáticas e ponteiras. 
y Centrífuga. 
y Cronômetro. 
y Tubos de ensaio 
 
Procedimento automatizado 
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para 
utilização do mesmo. 
 
Procedimento alternativo 
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas 
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados. 
 
 
 
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica 
 
 
13 
 
8. CONTROLE DE QUALIDADE 
 
Materiais 
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência 
da utilização dos mesmos. 
 
Limites de tolerância 
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings 
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer 
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle. 
 
Verificação de novo lote de controle e/ou reagente 
Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes. 
 
Gerenciamento dos dados 
Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou 
POP da garantia da qualidade. 
 
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES 
 
y O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro. 
y Seguir com rigor a metodologia proposta, para a obtenção de resultados exatos. 
y Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos e biológicos devem ser observados. 
y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material 
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar 
apropriado para material potencialmente infectante. 
y Os reagentes não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas. 
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente. 
y É necessário o uso de proteção respiratória, para evitar a contaminação do reativo. 
y Não contaminar a vidraria ou o reagente com saliva ou suor, devido aos seus altos conteúdos de α-amilase. Não soprar 
a pipeta utilizada. Não conversar nas proximidades do frasco destampado, pois o reagente pode se contaminar 
irreversivelmente. O aparecimento de cor amarelada no reagente é sinal de contaminação por α-amilase. 
y Recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas descartáveis durante o manuseio das substâncias. 
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente. 
y Em caso de ingestão procurar atendimento médico. 
y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança. 
y Evitar contaminações com íons metálicos. 
y Não misturar diferentes lotes de reagentes. Evitar contaminação microbiana do reagente e não utilizar reagentes que 
tenham sinais de contaminação ou precipitação. 
y Não dispensar o reagente em tubulação contendo ferro galvanizado. 
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria 
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou 
deionizada. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente 
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção 
de resultados corretos.Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos 
materiais. 
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não 
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causarresultados 
errôneos. 
 
10. PROCEDIMENTO TÉCNICO 
 
Preparação do reativo: 
Reativo pronto pra uso 
 
OBS: Leituras de absorbância do reativo superiores a 0,600 A com o aparelho zerado em 405 nm com água deionizada 
indicam deterioração do reativo. 
 
Procedimento manual 
1. Pré-aquecer o Reagente durante alguns minutos, a temperatura desejada. 
2. Pipetar em uma cubeta: 
 
 Soro / Plasma Urina Líquidos Pleural / 
Ascítico 
Reativo 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL 
Amostra 10μl 10μl 10μl 
 
3. Misturar e inserir no porta-cubetas termostatizado. 
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica 
 
 
14 
4. Anotar a absorbância após 1 minuto e efetuar novas leituras após mais 1, 2 e 3 minutos (A1, A2 e A3 respectivamente). 
 
Procedimento automatizado 
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes 
para o sistema automático (Programação ou Protocolo). 
 
11. CÁLCULOS 
 
Para linearidade: 
ΔA / min x 7537 a 37oC 
 
Amilase Urinária/Hora 
 Amilase (U/l) x volume urinário (ml) 
Amilase urinária (U/h) = 
1000 x tempo de coleta (h) 
 
Relação Amilase/Creatinina 
 
 Amilase (U/l) x 100 
Relação Amilase/Creatinina (U/g) = 
 Creatinina (mg/dl) 
 
Relação depuração da amilase / depuração da creatinina 
 
Determinar a atividade da amilase e a concentração da creatinina no soro e em uma amostra de urina e aplicar os 
resultados na seguinte fórmula: 
 
Amilase na urina (U/l) x Creatinina no soro (mg/dl) 
Relação (%): x 100 
 Amilase no soro (U/l) x Creatinina na urina (mg/dl) 
 
Método para cálculo do fator 
 
 VT x 1000 
Fator = 
 ε x VA x d 
 
 
VT = volume total do ensaio 
VA = volume da amostra 
1000 = conversão de U/ml para U/l 
d = espessura da solução 
ε = absortividade milimolar do 2-cloro-4-nitrofenol em 405 nm, pH 6,0 a 37 ºC (12,9) 
12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS 
 
Unidade utilizada: U/L 
UNIDADES: Sistema Internacional (SI): U/L 
 
Valores de referência: 
Para os Líquidos Pleural / Ascítico os valore são iguais aos do soro.Valores maiores que 3 vezes o limite superior de 
referência indicam aumento considerável da atividade da amilase sérica. Incluir o procedimento a ser adotado diante de 
um resultado crítico. 
 
 37ºC 
Soro/Plasma < 86 U/L 
Urina < 470 U/L 
 
Esses valores são unicamente orientativos. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de 
referência. 
 
13. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO 
 
y Linearidade 
A reação é linear entre 10 e 1038 (0,150 a 405nm)U/L. Para valores acima de 1038 U/L, diluir a amostra com solução 
salina 0,9% e repetir a dosagem. Multiplicar o valor obtido pelo fator de diluição.Caso sejam encontrados valores 
superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos valores de linearidade. Indicar 
o procedimento de diluição adotado pelo laboratório. 
 
y Interferências: 
Temperatura de incubação: A determinação deve efetuar-se a 37ºC. 
Os anticoagulantes fluoreto, oxalato, citrato e EDTA interferem. 
Amostras com hemólises produzem resultados falsamente diminuídos. 
Valores de bilirrubina até 20 mg/dL e hiperlipemia (triglicerides até 1500 mg/dL) não interferem. 
Falsos Valores elevados: Meperidina, codeína, morfina, álcool, diuréticos, salicilatos, tetraciclina, amostra contaminada. 
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica 
 
 
15 
Falsos Valores baixos: Citratos, oxalatos e fluoretos. 
14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS 
 
y Winn-Deen, E.S., DAVID, H.Sigler E., amd Chavez R., Clin Chem., 34,10,(1988), 2005. 
y Rauscher, E., et al, Clin Chem., 31,1:14 (1985) 
y I.D.P., Wootton and H. Freeman, Microanalysis Medical Biochemistry (1982). 
y CNPG3 Technology: Genzyme Manual, 1-35, Cambridge, 1996; 
y Henry JB. Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, Philadelphia: W.B. Saunders 
Company, 1996; 525-527. 
y Jacobs DS, Kasten Jr BL. Laboratory Test Handbook, Hudson: Lexi-Comp Inc., 1996; 79-80, 91. 
y Kaufman RA, Tietz NW. Clin Chem 1980; 26: 846-853. 
y Pesce AJ, Kaplan LA. Methods in Clinical Chemistry, St. Louis: The C.V. Mosby Co., 1987; 817-830. 
y Rosenblum JL. Clin Chem 1992; 38:920. 
y Westgard JO, Barry PL, Hunt MR. Clin Chem 1981; 27: 493-501. 
y Alfa-Amilase – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005. 
y Inmetro – Boas Práticas de laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro, 
1997. 
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 11-12. 
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 58-59 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica 
 
 
16 
BILIRRUBINA DIRETA E TOTAL 
 
Método Colorimétrico 
Malloy-Evelyn – DMSO 
 
1. INDICAÇÃO MÉDICA 
 
Esta dosagem é utilizada na avaliação hepática, biliar e nas doenças hemolíticas. 
 
2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO 
 
A bilirrubina é formada principalmente pela degradação da molécula heme e é transportada até o fígado, veiculada pela 
albumina. Nesta fase a bilirrubina é insolúvel em água e é conhecida como Bilirrubina Não Conjugada ou Bilirrubina 
Indireta. 
No fígado, a bilirrubina se liga ao ácido glicurônico para formar a Bilirrubina Conjugada, mediante a atuação da enzima uridil 
difosfato glucoroniltransferase, transformando-se assim em Bilirrubina Direta ou Bilirrubina Conjugada. A Bilirrubina 
Conjugada ou Bilirrubina Direta é excretada pelas vias biliares até o intestino, onde é metabolisada pela flora bacteriana 
residente, à um grupo de produtos complexo, conhecidos como estercobilinogenio. 
Esta eliminação se dá de maneira praticamente completa. 
A Bilirrubina Total é a soma das duas bilirrubinas (Direta + Indireta). Esta Bilirrubina apresenta níveis séricos elevados na 
presença de obstrução das vias biliares, doenças hemolíticas e na insuficiência hepática. 
O monitoramento da Bilirrubina do neonato, em particular do prematuro é de suma importância, pois uma elevação 
acentuada da Bilirrubina Indireta, superando a barreira hemato-encefálica podendo causar danos cerebrais irreversíveis. 
 
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO 
 
Quase todas as técnicas de quantificação da Bilirrubina se baseiam na reação de Malloy-Evelyn, que quantifica 
colorimetricamente a formação de azobilirrubina, de coloração vermelha, quando a bilirrubina reage sob determinadas 
condições com o ácido sulfanílico diazotado. 
A Bilirrubina conjugada, muito polar, reage em meio aquoso com o reativo de diazotação, Bilirrubina Direta, a coloração 
aparece após o contato do soro e o reativo. A Bilirrubina livre, pouco polar, não dá uma reação direta e é preciso adicionar 
um terceiro reativo para que seja produzida a reação de diazotação com o aparecimento da cor; por este motivo se chama 
Bilirrubina Indireta. 
 
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA 
 
Preparo do paciente 
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 04 horas. No caso de recém-nascidos, antes da próxima mamada. 
 
Amostras 
Soro: obtido da maneira usual. 
 
Armazenamento e estabilidade das amostras: 
Soro. Estável por 8 horas a temperatura ambiente, 12 horas entre 2-8 ºC ou 24 horas congelado. Proteger da luz. 
 
Volumes mínimos e ideal 
y A serem definidos pelo próprio laboratório. 
 
Critérios para a rejeição de amostras 
y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material 
 
5. COMPONENTES DO KIT 
 
BILIRRUBINA DIRETA E TOTAL – DMSO Registro M.S.: 80027310029 
Códigos: BT 10003 – 1 fr. - 50 mL R1 (Bilirrubina Direta )+ 1 fr. - 50 mL R2 (Bilirrubina Total) + 1 fr. - 5 mL R3 (Nitrito) 
 BT 10003 – 1 fr. -250 mL R1 (Bilirrubina Direta )+ 1 fr. -250 mL R2 (Bilirrubina Total) + 1 fr. -25 mL R3 (Nitrito)BioTécnica Indústria e Comércio Ltda 
Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil. 
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646 
Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br 
 
Reagente 1 – Bilirrubina Direta: Ácido sulfanílico 35 mmol/L, ácido clorídrico 180 mmol/L. 
Reagente 2– Bilirrubina Total: Ácido sulfanílico 40 mmol/L, ácido clorídrico 60 mmol/L, Dimetilsulfóxido 10 mmol/L 
Reagente 3 – Nitrito: Nitrito de sódio 33 mmol/L,azida sódica 16 mmol/L. 
 
 
y Reagente pronto para uso. 
y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit. 
y Conservar protegido da luz. 
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica 
 
 
17 
y Conservar entre 2 – 8 º C 
 
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO 
 
Manter todos os componentes entre 2 e 8 °C. NÃO CONGELAR. 
Evitar deixar em Temperatura Ambiente por períodos prolongados, evitando assim a deterioração das enzimas. 
Manter ao abrigo da luz. 
O reativo é estável até a data de validade do Kit. A data de validade aparece no rótulo da embalagem. 
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas. 
 
7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO 
 
Procedimento técnico manual 
y Espectrofotômetro ou fotômetro para leituras a 550 nm.(530 - 570) com cubeta. 
y Pipetas automáticas e ponteiras 
y Banho Maria. 
y Centrífuga. 
y Cronômetro. 
 
Procedimento automatizado 
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para 
utilização do mesmo. 
 
Procedimento alternativo 
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas 
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados. 
 
8. CONTROLE DE QUALIDADE 
 
Materiais 
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência 
da utilização dos mesmos. 
 
Limites de tolerância 
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings 
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer 
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle. 
 
Verificação de novo lote de controle e/ou reagente 
Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes. 
 
Gerenciamento dos dados 
Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou 
POP da garantia da qualidade. 
 
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES 
 
y O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro. 
y Seguir com rigor a metodologia proposta, para a obtenção de resultados exatos. 
y Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos e biológicos devem ser observados. 
y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material 
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar 
apropriado para material potencialmente infectante. 
y O reagente e o padrão não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas. 
y O nível de água no banho-maria deve ser superior ao dos tubos de ensaio que contém as reações. 
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente. 
y Não é necessário nenhum tipo de proteção respiratória, mas recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas 
descartáveis durante o manuseio das substâncias. 
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente. 
y Em caso de ingestão procurar atendimento médico. 
y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança. 
y Não misturar ou trocar diferentes lotes de reativos. 
y Não utilizar o reativo quando este mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação. 
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria 
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou 
deionizada. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente 
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção 
de resultados corretos. Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos 
materiais. 
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica 
 
 
18 
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não 
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados 
errôneos. 
 
10. PROCEDIMENTO TÉCNICO 
 
Preparação dos reativos: 
Modo mono-reativo: Preparar alíquotas na proporção de 30 partes de Reativo 1 (Bilirrubina Direta) ou Reativo 2 
(Bilirrubina Total) + 1 parte de Reativo 3 (Nitrito). 
Estável por 48 horas, quando mantido em frasco fechado a 2-8°C e realizadas calibrações diárias. Os reativos de trabalho 
desenvolvem uma coloração alaranjada, porém isto não interfere no resultado final. 
 
Procedimento manual 
1. Pipetar em tubos de ensaio: (Nota 1) 
 
 Branco Total Total Branco Direta Direta 
R-1 – Bil Direta - -- 1,0 mL 1,0 mL 
R-2 – Bil. Total 1,0 mL 1,0 mL - - 
R-3 - Nitrito - 30 μL - 30 μL 
Amostra/Padrão 50 μL 50 μL 50 μL 50 μL 
 
2. Agitar bem e deixar reagir durante 5 minutos a temperatura ambiente. Ler as absorbâncias. 
 
Nota: 
1) Para pediatria pode-se variar os volumes proporcionalmente: 
R – 1 / R - 2 = 1000 μL 
R – 3 = 30 μL 
Amostra = 20 μL 
 
Procedimento automatizado 
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes 
para o sistema automático (Programação ou Protocolo). 
Cuidados especiais 
y Conservar a amostra e o reativo protegidos da luz. 
 
11. CÁLCULOS 
 
CÁLCULOS 
 
Cálculos: 
Bilirrubina Total = AT – ABT x Concentração da Padrão 
 AP – ABP 
Bilirrubina Direta = AD – ABD x Concentração da Padrão 
 AP – ABP 
Onde: AT = Absorbância amostra Bilirrubina Total 
 ABT = Absorbância branco da amostra de Bilirrubina Total 
 AD = Absorbância amostra Bilirrubina Direta 
 ABD = Absorbância branco da amostra de Bilirrubina Direta 
 AP = Absorbância do Padrão 
 ABD = Absorbância do Branco de Padrão 
 
Com fator: 
Bilirrubina Total (mg/dL) = AT – ABT x 25,0 
Bilirrubina Direta (mg/dL) = AD – ABD x 15,0 
 
UNIDADES SI: 
mg/dL bilirrubina x 17,1 = μmol/L bilirrubina 
 
Exemplo: AT = 0,092 AD = 0,033 
 ABT = 0,040 ABD =0,020 
AT - ABT =0,052 AB- ABD = 0,013 
 
Bilirrubina Direta = (mg/dL) = 0,013 x 15 = 0,19 mg/dL 
Bilirrubina Total = (mg/dL) = 0,052 x 25 = 1,30 mg/dL 
 
Para amostras pediátricas, com volume de amostra reduzido para 20 μL, os valores de fator se modificam para: 
BD = 36,5 e BT = 60,8. 
 
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica 
 
 
19 
12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS 
 
Unidade utilizada: mg/dL 
UNIDADES: Sistema Internacional (SI): mg/dL bilirrubina x 17,1 = μmol/L bilirrubina 
 
Valores de referência 
Bilirrubina Total: até 1,2 mg/dL (20,5 μmol/L) 
Bilirrubina Direta: até 0,4 mg/dL (6,8 μmol/L). 
Bilirrubina Total (Recém-nascidos) – mg/dL 
Idade Cordão < 24 horas < 48 horas 3 a 5 dias 7 dias 
Pré-maturo 2,9 8,0 12,0 15,0 15,0 
Termo 2,5 6,0 10,0 12,0 10,0 
Esses valores são unicamente orientativos. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de 
referência. 
 
13. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO 
 
y Linearidade: até 15 mg/dL = 256μmol/L 
Para valores superiores diluir a amostra 1:2 com solução salina e repetir a determinação multiplicando o resultado por 2. 
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos 
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório. 
 
y Interferências 
A leitura da amostra de branco evita a interferência da lipemia, hemólise ou turbidez dos soros liofilizados. 
Falsos Valores baixos: Soros fortemente hemolisados podem fornecer valores falsamente diminuídos 
 
14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS 
 
y Hijmans Van der Bergh AA, Muller P., Biochem. 77, 90 (1916). 
y Malloy, H.T. and Evelyn, KA, J.Biol.. Chem. 119, 481 (1937). 
y Westgard JO, Barry PL, Hunt MR. Clin Chem 1981; 27: 493-501 
y Sims FH, Horn C. Am J Clin Path 1958; 28: 412. 
y Matimek, RG Clin. Chim. Acta, 13, 161 (1966). 
y Walters MI, Gerarde RW, Microchem 15, 231 (1970). 
y Bilirrubina Direta e Total – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005. 
y Inmetro – Boas Práticas de laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro, 
1997. 
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 69. 
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 62 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica 
 
 
20 
CÁLCIO ASX 
 
Método ARSENAZO III 
 
1. INDICAÇÃO MÉDICA 
 
Para determinação dos níveis de Cálcio sérico. Este íon atua como mediador na contração muscular, transmissão nervosa 
e mediação da coagulação sanguínea. O hormônio paratireoideano e a Vitamina D aumentam a absorção do cálcio do trato 
gastrointestinal, liberando-o para os ossos em caso de déficit desse íon. 
 
2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO 
 
Sangue: o cálcio total encontra-se ligado às proteínas (47%) e livre (43%). Hipercalcemia é encontrada no 
hiperparatireoidismo, algumas neoplasias com ou sem metástases ósseas, mieloma, desidratação, hipervitaminose D, 
síndrome de imobilidade, hipertireoidismo, hepatopatias, insuficiência renal, sarcoidose, linfoma, uso de diuréticos e 
estrógenos. Níveis baixos de cálcio total são encontrados na osteomalácia, pancreatite, hipomagnesemia, hipervolemia, má 
absorção, deficiência da vitamina D, diminuições de albumina e em situações que cursam com fósforo elevado 
(insuficiência renal, hipoparatireoidismo). Níveis críticos de cálcio total são aqueles inferiores a 6 mg/dL e superiores a 14 
mg/dL. Na interpretação dos valores normais deve-se levar em conta níveis de albumina. A hemólise pode elevar os 
resultados. 
Urina: é útil na investigação dos efeitos da vitamina D e PTH sobre a reabsorção óssea. Também utilizado na avaliação de 
nefrolitíase. Exame deve ser realizado após 4 dias de dieta. Sua determinação é preferida na urina de 24 h; urina recente 
pode ser utilizada realizando a razão cálcio: creatinina. Hipercalciúria é encontrada nas hipercalcemias, hiperabsorção 
intestinal de cálcio, distúrbios da reabsorção tubular de cálcio, corticoterapia, osteoporose, acromegalia, hipertireoidismo, 
feocromocitoma, Cushing. Hipocalciúria pode ser secundária à hipocalcemia, insuficiência renal, osteomálacia, raquitismo, 
alcalose, uso de diuréticos e estrógenos. 
Cálcio Iônico: O cálcio iônico é a fração biologicamente ativa do cálcio sérico total, representando 43% desse. Sua 
concentração é mais baixa à noite e maior pela manhã. A dosagem do cálcio iônico independe da albumina, entretanto 
varia com o pH (aumenta na acidose; diminui na alcalose). 
 
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO 
 
A pH levemente ácido o cálcio forma com o arsenazo (III) um complexo azul, cuja intensidade é medida a 650 nm. A 
intensidade de cor é proporcional a quantidade de cálcio presente na amostra. Não é observada nenhuma interferência do 
magnésio no pH mencionado. 
 
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA 
 
Preparo do paciente 
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas. 
A determinação na urina requer uma dieta prévia de pelo menos 3 dias livres de cálcio (eliminar leite e derivados). 
 
Amostras 
Podem ser utilizados soro, plasma ou urina 
Soro não hemolisado, plasma (heparina). Evitar amostra de plasma contendo EDTA, citrato ou oxalato. A amostra deve 
ser obtida por via venosa, porém sem deixar o torniquete por muito tempo, para evitar que alterações no nível de albumina 
– ao redor do torniquete forme um gradiente de concentração de cálcio. O uso do torniquete pode aumentar o nível de 
cálcio em 0,5 mg/dL (0,10 mol/L) 
Não utilizar soro proveniente de pacientes em Terapia com EDTA – hiperparatireoidismo. Neste caso, é recomendável o 
uso da técnica espectrofotométrica de Absorção Atômica.O soro deve ser separado do coágulo o mais rápido possível, 
Urina: Coletar todo volume da micção de 24 horas, homogeneizar bem todo o volume de 24 horas, separar 5,0 mL e 
adicionar 1 gota de HCl concentrado. Esta é a amostra teste. 
 
Armazenamento e estabilidade das amostras: 
Cálcio na amostra de soro ou plasma é estável 7 dias entre 2-8oC ou 6 meses à –20 ºC. 
Urina: até 02 semanas em HCl 50% à temperatura ambiente. 
 
Volumes mínimo e ideal 
y A serem definidos pelo próprio laboratório. 
 
Critérios para a rejeição de amostras 
Não deve ser utilizado soro hemolisado. 
y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material 
 
 
 
5. COMPONENTES DO KIT 
 
CÁLCIO ASX (ARSENAZO III) Registro M.S.: 80027310052 
Códigos: BT 12002 – 2 fr. com 50,0 mL cada + 1 fr. Padrão – 2,0 mL 
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica 
 
 
21 
 
BioTécnica Indústria e Comércio Ltda 
Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil. 
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646 
Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br 
 
Reagente: Arsenazo III 0.18 mmol/L, Tampão MÊS 1.6 mmol/L, pH 6,8, conservantes 
Padrão: Solução de Cálcio (valor da concentração do padrão vide etiqueta do frasco) 
 
y Reagente pronto para uso. 
y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit. 
y Conservar entre 15 - 30 ºC. 
 
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO 
 
Manter todos os componentes entre 15 - 30º C 
Manter ao abrigo da luz. 
O reativo é estável até a data de validade do Kit. A data de validade aparece no rótulo da embalagem. 
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas. 
 
7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO 
 
Procedimento técnico manual 
y Espectrofotômetro ou fotômetro para leituras a 650 nm (600-660) com cubetas. 
y Banho de água a 37 ºC. 
y Pipetas automáticas e ponteiras. 
y Cronômetro 
y Tubos de ensaio. 
 
Procedimento automatizado 
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para 
utilização do mesmo. 
 
Procedimento alternativo 
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas 
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados. 
 
8. CONTROLE DE QUALIDADE 
 
Materiais 
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência 
da utilização dos mesmos. 
 
Limites de tolerância 
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings 
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer 
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle. 
 
Verificação de novo lote de controle e/ou reagente 
Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes. 
 
Gerenciamento dos dados 
Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manualou 
POP da garantia da qualidade. 
 
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES 
 
y O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro. 
y Seguir com rigor a metodologia proposta, para a obtenção de resultados exatos. 
y Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos e biológicos devem ser observados. 
y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material 
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar 
apropriado para material potencialmente infectante. 
y O reagente e o padrão não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas. 
y O nível de água no banho-maria deve ser superior ao dos tubos de ensaio que contém as reações. 
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente. 
y Não é necessário nenhum tipo de proteção respiratória, mas recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas 
descartáveis durante o manuseio das substâncias. 
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente. 
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica 
 
 
22 
y Em caso de ingestão procurar atendimento médico. 
y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança. 
y Não misturar ou trocar diferentes lotes de reativos. 
y Não utilizar o reativo quando este mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação. 
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria 
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou 
deionizada.. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente 
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção 
de resultados corretos..Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos 
materiais. 
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não 
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados 
errôneos. 
 
10. PROCEDIMENTO TÉCNICO 
 
Preparação do reativo: 
Reativo pronto pra uso 
 
Procedimento manual 
1. Pipetar em tubos de ensaio: 
 
 Branco Padrão Amostra 
Padrão - 10 μL - 
Amostra - - 10 μL 
Reagente 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL 
 
2. Agitar bem e deixar os tubos durante 2 minutos à temperatura ambiente.. 
3. Ler a absorbância (AP) do Padrão e (AA)da Amostra frente ao Branco á 650 nm (600 – 660 nm). A cor é estável durante 
20 minutos. 
Para análise bicromática utilizar filtro de referência: 700 nm. 
 
Procedimento automatizado 
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes 
para o sistema automático (Programação ou Protocolo). 
Cuidados especiais 
y O uso de detergente iônico para limpar o material é outra fonte de contaminação com cálcio. 
y O material utilizado na preparação do reativo deverá estar completamente isento de íons cálcio. Sugerimos a 
lavagem com ácido nítrico 6N ou com detergente não iônico. Depois lavar várias vezes com água deionizada.. 
 
11. CÁLCULOS 
 
Determinar a absorbância do padrão Ap e Calcular o Fator de calibração: 
 
FC = concentração do padrão 
 Absorbância padrão 
 
Cálcio Sérico: 
Cálculo da concentração de Cálcio: (Multiplicar a absorbância pelo fator de calibração) 
Concentração Cálcio (mg/dL) = Abs. Teste x FC 
 
Cálcio Urinário 
 Ca Urina (mg/dL) = Abs. Teste x FC 
 
Dosagem de Cálcio na urina de 24 horas: 
 
mg/24 = cálcio urina (mg/dL) x vol urinário 24 h (mL) 
 100 
 
Cálculo do Cálcio Ionizável: 
 
 6 x Ca – (0,19 x P) + A 
Cal ioniz.= 3 
 
 (0,19 x P) + A + 6 
12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS 
 
Unidade utilizada: mg/dL 
UNIDADES: Sistema Internacional (SI): mg/dL cálcio x 0,25 = mmol/L cálcio 
FC = Fator de Calibração 
Cal ioniz. = cálcio ionizável 
Ca = Cálcio sérico em mg/dL 
P = Proteína Total (g/dL) 
A = Albumina (g/dL) 
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica 
 
 
23 
 
Valores de referência 
Soro e plasma: 
Crianças: 10,0 –11,6 mg/dL = 2,5 - 2,9 mmol/L 
Adultos: 8,8 – 10,8 mg/dL = 2,2 – 2,7 mmol/L 
Urina: 100-300 mg/24 horas = 25 – 87,5 mmol/24 horas 
Esses valores são unicamente orientativos. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de 
referência. 
 
13. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO 
 
y Linearidade 
Reação linear até 20mg/dL = 5 mmol/L. 
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos 
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório. 
 
y Interferências 
A hemoglobina (1,5 g/L), a bilirrubina (20 mg/dL), o magnésio (10 mg/dL) e os fosfatos (20 mg/dL) não interferem. 
Triglicérides acima de 900 mg/dL produzem resultados falsamente diminuídos. 
Falsos Valores elevados: estrógenos, sais de cálcio, vitamina D, antiácidos, dieta rica em cálcio. 
Falsos Valores baixos: cortisona, gentamicina, meticilina, uso excessivo de laxante, heparina, dieta pobre em cálcio, 
cloreto de s´dio intravenoso. 
 
14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS 
 
y Zak B., Epstein E., Babinski E.S., Review of Calcium Methodologies - Annals of Clinical and laboratory Science 5, 
195 – 212 (1975). 
y Guyton, Fisiologia humana e Mecanismos das doenças 1993, 5 ª edição 
y Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem 1981; 27: 493-501. 
y Jacobs DS, Kasten Jr BL. Laboratory Test Handbook, Hudson: Lexi-Comp Inc., 1996; 96-98. 
y Cálcio – Arsenazo III – Bula do Kit – Biotecnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005. 
y Inmetro – Boas Práticas de laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro, 
1997. 
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 11-12. 
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 58-59 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica 
 
 
24 
CÁLCIO 
 
Método Colorimétrico 
(o-CRESOLFTALEÍNA) 
 
1. INDICAÇÃO MÉDICA 
 
Para determinação dos níveis de Cálcio sérico. Este íon atua como mediador na contração muscular, transmissão nervosa 
e mediação da coagulação sanguínea. O hormônio paratireoideano e a Vitamina D aumentam a absorção do cálcio do trato 
gastrointestinal, liberando-o para os ossos em caso de déficit desse íon. 
 
2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO 
 
Sangue: o cálcio total encontra-se ligado às proteínas (47%) e livre (43%). Hipercalcemia é encontrada no 
hiperparatireoidismo, algumas neoplasias com ou sem metástases ósseas, mieloma, desidratação, hipervitaminose D, 
síndrome de imobilidade, hipertireoidismo, hepatopatias, insuficiência renal, sarcoidose, linfoma, uso de diuréticos e 
estrógenos. Níveis baixos de cálcio total são encontrados na osteomalácia, pancreatite, hipomagnesemia, hipervolemia, 
má absorção, deficiência vitamina D, diminuições da albumina, e em situações que cursam com fósforo elevado 
(insuficiência renal, hipoparatireoidismo). Níveis críticos de cálcio total são aqueles inferiores a 6 mg/dL e superiores a 14 
mg/dL. Na interpretação dos valores normais deve-se levar em conta níveis de albumina. Hemólise pode elevar seus 
resultados. 
 
Urina: é útil na investigação dos efeitos da vitamina D e PTH sobre a reabsorção óssea. Também utilizado na avaliação 
de nefrolitíase. O exame deve ser realizado após 4 dias de dieta. Sua determinaçãoé preferida na urina de 24 h. Urina 
recente pode ser utilizada realizando a razão cálcio / creatinina. Hipercalciúria é encontrada nas hipercalcemias, 
hiperabsorção intestinal de cálcio, distúrbios da reabsorção tubular de cálcio, corticoterapia, osteoporose, acromegalia, 
hipertireoidismo, feocromocitoma, Cushing. Hipocalciúria pode ser secundária à hipocalcemia, insuficiência renal, 
osteomalácia, raquitismo, alcalose, uso de diuréticos e estrógenos. 
 
Cálcio iônico: O cálcio iônico é a fração biologicamente ativa do cálcio sérico total, representando 43% desse. Sua 
concentração é mais baixa à noite e maior pela manhã. A dosagem do cálcio iônico independe da albumina, entretanto 
varia com o pH (aumenta na acidose; diminui na alcalose). 
 
3. PRINCÍPIO DO MÉTODO 
 
O composto o-cresolftaleína (CFC) reage com Cálcio presente na amostra em meio alcalino originando um complexo 
colorido que se pode quantificar espectrofotometricamente. 
 
4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA 
 
Preparo do paciente 
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas. 
A determinação na urina requer uma dieta prévia de pelo menos 3 dias livres de cálcio (eliminar leite e derivados). 
 
Amostras 
Podem ser utilizados soro, plasma ou urina 
Soro não hemolisado, plasma (heparina). Evitar amostra de plasma contendo EDTA, citrato ou oxalato. A amostra deve 
ser obtida por via venosa, porém sem deixar o torniquete por muito tempo, para evitar que alterações no nível de albumina 
– ao redor do torniquete forme um gradiente de concentração de cálcio. O uso do torniquete pode aumentar o nível de 
cálcio em 0,5 mg/dL (0,10 mol/L) 
Não utilizar soro proveniente de pacientes em Terapia com EDTA – hiperparatireoidismo. Neste caso, é recomendável o 
uso da técnica espectrofotométrica de Absorção Atômica.O soro deve ser separado do coágulo o mais rápido possível, 
Urina: Coletar todo volume da micção de 24 horas, homogeneizar bem todo o volume de 24 horas, separar 5,0 mL e 
adicionar 1 gota de HCl concentrado. Esta é a amostra teste. 
 
Armazenamento e estabilidade das amostras: 
Cálcio na amostra de soro ou plasma é estável 7 dias entre 2-8oC ou 6 meses à –20 ºC. 
Urina: até 02 semanas em HCl 50% à temperatura ambiente. 
 
Volumes mínimo e ideal 
y A serem definidos pelo próprio laboratório. 
 
Critérios para a rejeição de amostras 
Não deve ser utilizado soro hemolisado. 
y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material 
 
5. COMPONENTES DO KIT 
 
CÁLCIO o-CRESOLFTALEÍNA-Complexona (CFC) Registro M.S.: 80027310027 
Códigos: BT 12001 – 1 fr. com 50,0 mL RA + 1 fr. com 50,0 mL RB + 1 fr. Padrão – 2,0 mL 
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica 
 
 
25 
 
BioTécnica Indústria e Comércio Ltda 
Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil. 
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646 
Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br 
 
Reativo A: Tampão Etanolamina 500 mmol/L. 
Reativo B: orto-cresolftaleína complexona 0,62 mmol/L; 8-hidroxiquinoleína 69 mmol/L. 
Padrão de Cálcio: Solução estabilizada de Cálcio (valor da concentração do padrão vide etiqueta do frasco) 
 
y Reagente pronto para uso. 
y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit. 
y Conservar entre 15 e 30º C 
 
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO 
 
Manter todos os componentes entre 15 - 30º C 
Manter ao abrigo da luz. 
O reativo é estável até a data de validade do Kit. A data de validade aparece no rótulo da embalagem. 
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas. 
 
7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO 
 
Procedimento técnico manual 
y Espectrofotômetro ou fotômetro para leituras a 570 nm (550-590) com cubetas. 
y Banho de água a 37 ºC. 
y Pipetas automáticas e ponteiras. 
y Cronômetro 
y Tubos de ensaio. 
 
Procedimento automatizado 
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para 
utilização do mesmo. 
 
Procedimento alternativo 
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas 
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados. 
 
8. CONTROLE DE QUALIDADE 
 
Materiais 
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência 
da utilização dos mesmos. 
 
Limites de tolerância 
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings 
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer 
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle. 
 
Verificação de novo lote de controle e/ou reagente 
Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes. 
 
Gerenciamento dos dados 
Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou 
POP da garantia da qualidade. 
 
9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES 
 
y O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro. 
y Seguir com rigor a metodologia proposta, para a obtenção de resultados exatos. 
y Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos e biológicos devem ser observados. 
y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material 
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar 
apropriado para material potencialmente infectante. 
y O reagente e o padrão não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas. 
y O nível de água no banho-maria deve ser superior ao dos tubos de ensaio que contém as reações. 
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente. 
y Não é necessário nenhum tipo de proteção respiratória, mas recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas 
descartáveis durante o manuseio das substâncias. 
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica 
 
 
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y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente. 
y Em caso de ingestão procurar atendimento médico. 
y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança. 
y Não misturar ou trocar diferentes lotes de reativos. 
y Não utilizar o reativo quando este mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação. 
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria 
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou 
deionizada.. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente 
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção 
de resultados corretos..Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos 
materiais. 
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não 
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados 
errôneos. 
 
10. PROCEDIMENTO TÉCNICO 
 
Preparação dos Reativos: 
Reativo de Trabalho: Mistura na proporção de 1 mL de Reativo A + 1 mL de Reativo B. 
Estável por 24 horas a temperatura ambiente. 
 
Procedimento manual 
1. Pipetar em tubos de ensaio: 
 
 Branco Padrão Amostra 
Padrão - 10 μL - 
Amostra - - 10 μL 
Reat. Trab. 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL 
 
2. Agitar bem e deixar os tubos durante 10 minutos à temperatura ambiente. 
3. Decorridos os 10 minutos, ler a absorbância do Padrão e da Amostra frente ao Branco do reativo à 570 nm. 
 
Procedimento automatizado 
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico.