TÉCNICAS DE INOCULAÇÃO

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UNINOVE
UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO
CENTRO DE CIÊNCIAS SOCIAIS E APLICADAS
CURSO DE FARMÁCIA
RELATÓRIO DE AULAS PRATICAS
Técnicas de inoculação
Teste de sensibilidade a antibacteriano
Coloração de gram
Prof. Simone Aquino
Campus Memorial- prédio A
 Turma-0 4/B - Matutino
Alunos:
São Paulo-SP
OUTUBRO/2015
Semeadura para Isolamento
Introdução
Identificar um dado organismo como espécie baseia-se no preenchimento das características atribuídas àquela espécie. O reconhecimento da fonte ou origem do espécime (ambiente, espécie animal, tipo de patologia e localização) do organismo é às vezes fundamental para identificação e a correta caracterização cultural do organismo em meios de isolamento primário, assim como a execução e interpretação da coloração e reação ao Gram são vitais para o sistema de identificação.
Para isolar o microrganismo efetua-se a inoculação ou semeadura, utilizando a técnica do esgotamento do inóculo por estrias, tendo-se o cuidado de usar inteiramente toda a área do meio para garantir a separação das bactérias, de modo que após a incubação cada célula separada origine uma colônia.
O processo de identificação propriamente dito começa com a observação das características das colônias isoladas (a olho nu, com lupa ou microscópio, usando a objetiva de menor aumento). Os seguintes critérios são utilizados para a caracterização colonial:
Forma;
Tamanho (mm);
Elevação - achatada (alta, baixa), espraiada, convexa, etc;
Bordos - inteiros, ondulados, lobados, denticulados, franjados, etc.;
Superfície - lisa, rugosa;
Estrutura - amorfa, granulosa, filamentosa;
Caracteres ópticos - opaca, translúcida e transparente;
Cromogenia ou Pigmentação - amarela, branca, preta, rósea, etc.;
Odor – ausente, presente, semelhante a...
 Após a observação dessas características devem ser feitos esfregaços para colorações especiais, para observação da morfologia microscópica (forma, arranjos, tamanho e reação ao Gram), presença ou ausência de esporos, flagelos, cápsulas, granulações e coloração bipolar (freqüente nas pasteurelas e yersinias). Os procedimentos seguintes envolvem a caracterização metabólica, tolerância a agentes químicos e físicos, a antimicrobianos e fagos (fagotipagem), bem como propriedades antigênicas ou sorológicas e patogenicidade através da inoculação em espécies animais susceptíveis (apropriadas).  
Objetivo
Isolar uma determinada bactéria que possa conter na amostra usando os meio de cultura solido Ágar MacConkey e Ágar Nutritivo.
Materiais
Solução salina;
Alça bacteriológica;
Bico de Bunsen;
Amostra de bactérias (colônias);
Ágar MacConkey e Ágar Nutritivo;
Métodos
Com a alça bacteriológica devidamente esterilizada, coletou-se amostras de bactérias;
Utilizando a técnica do esgotamento do inóculo por estrias (Figura 1), foi semeado a amostra de bactérias nos Ágares Nutritivo e MacConkey.
Incubou-se os meios de cultivo sólidos.
Posteriormente observou-se as características das colônias que cresceram nos dois ágares (Figura 2).
Resultados
Algumas colônias no Ágar MacConkey apresentaram coloração rosada, amarelada ou incolores, mucóides ou não, odor forte, colônias grandes, brilhantes, enquanto no Agar nutriente cresceram vários tipos bacterianos, com diferentes características.
Conclusão
Um isolamento bem feito é fundamental no processo de identificação das bactérias, visto que a área de isolamento é fundamental para o desenvolvimento dos passos seguintes de identificação.
Os Ágares Nutritivo e MacConkey são exemplos de meio de cultura que podem ser usados num primeiro passo de identificação das mesmas, visto que o Agar Nutritivo permite o crescimento de toda bactéria, desde que não seja fastidiosa, tendo o básico para o crescimento destes microorganismos, e o Agar Maconkey como um meio seletivo e diferencial na suspeita de uma bactéria.
Meios Seletivos e Diferenciais (Ágares SS, Manitol e MacConkey)
Coloração de Gram
Introdução
A coloração de Gram é um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853 - 1838), em 1884, e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com o reagente cristal violeta, lugol, álcool-acetona e fucsina básica. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. A coloração de Gram é um dos mais importantes métodos de coloração utilizados em laboratórios de microbiologia e de análises clínicas, sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterização de amostras de bactérias. A técnica tem importância clínica uma vez que muitas das bactérias associadas a infecções são prontamente observadas e caracterizadas como Gram-positivas ou Gram-negativas em esfregaços de pus ou de fluidos orgânicos. Essa informação permite ao clínico monitorar a infecção até que dados de cultura estejam disponíveis. É possível a análise de vários esfregaços por lâmina, o que facilita a comparação de espécimes clínicos. As lâminas podem ser montadas de forma permanente e preservadas como documentação.
Objetivo
Confeccionar uma lâmina e utilizar a técnica de gram para visualizar a morfologia das bactérias ao microscópio óptico.
Materiais
Lamina;
Solução salina;
Alça bacteriológica;
Bico de Bunsen;
Colônia de bactérias;
Cristal Violeta, Lugol, Álcool-acetona, Fucsina;
Papel filtro;
Microscópico.
Métodos
Sobre a lâmina de vidro, colocou-se uma gota de solução salina. Com a alça bacteriológica tocar levemente na superfície da colônia e emulsionar o material na gota de solução salina (caso o microrganismo seja fornecido em solução, colocar uma gota na lâmina). Deixar secar.
Passou-se o esfregaço na chama do bico de Bunsen três vezes a fim de fixar o material.
Posteriormente cobriu-se o esfregaço seco com violeta de genciana (cristal violeta) e deixar por um minuto.
Lavou-se com água corrente.
Esgotou-se a lâmina, e a cobriu com solução de lugol e deixar por um minuto.
Esgota-se a lâmina e, mantendo a mesma inclinada, pingou-se gotas de Álcool-acetona até que não se desprenda mais corante da preparação.
Lavou-se com água corrente.
Cobriu-se a lâmina com solução de fucsina e deixar por trinta segundos.
Lavou-se a lâmina e a cobriu com papel filtro para a secagem da lâmina.
Em seguida examinou-se ao microscópio com a objetiva de imersão.
Resultados:
Gram (+) coram de roxo, gram (-) coram de rosa.
100X
Conclusão
O método da coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes celulares de bactérias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um tratamento com álcool-acetona enquanto que as paredes celulares de bactérias Gram-negativas não o fazem.
Resumindo, as bactérias Gram positivas coram-se de roxo e as Gram negativas coram-se de vermelho ou rosa. Esta técnica de coloração permite então a distinção entre bactérias com parede celular mais ou menos rica em peptidoglicanos. De referir que embora uma bactéria Gram negativa nunca possa corar positivamente pelo Gram, uma bactéria estruturalmente Gram positiva pode corar negativamente se a sua parede de peptidoglicano for destruída.