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ROTEIRO DE ESTUDO BIOLOGIA MOLECULAR

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ROTEIRO DE ESTUDO BIOLOGIA MOLECULAR
NP1
Replicação: núcleo.
Tradução: citoplasma.
Primase (RNA polimerase): sintetiza primer de RNA, sintetiza fita de mRNA.
DNAG: reconhece o sítio de origem para replicação.
Helicase: abre fita de DNA. Elevado gasto de ATP.
Purina: Adenina e Guanina.
Pirimidina: Todas as demais.
SSB: estabiliza a fita aberta impedindo o pareamento das bases.
Topoisomerase (DNA girase): evita torções. Insere uma quebra transitória que permite o giro livre da fita de DNA.
Polimerase I: reparação do DNA; remove os primers de RNA nos fragmentos de Okasaki e os substitui por DNA.
Polimerase II: reparação de DNA.
Polimerase III: sintetiza cadeias de DNA. Região Alfa é mais importante. A Beta posiciona a polimerase no lugar certo.
Fotoliase: separa os dímeros de Timina causados pela luz U.
Telomerase: adiciona sequências específicas e repetitivas de DNA no telômero 3'. É uma transcriptase reversa, tendo na sua estrutura um modelo em RNA que utiliza para sintetizar o DNA telomérico, em eucariotas. Reverte o processo de senescência celular incrementando, de forma artificial, a quantidade de telomerase nas células.
mRNA: codifica a sequência de aa.
tRNA: lê a informação do mRNA e transfere o aa apropriado para a cadeia polipeptídica crescente.
rRNA: constitui os ribossomos.
Aula 1 – Procariotos vs Eucariotos
Fontes de Energia da Célula
DNA, RNA e proteína são compostos por hidrogênio, carbono, oxigênio, nitrogênio, enxofre e fosforo.
Vírus
São parasitas intracelulares obrigatórios. Divide-se em duas partes: Genoma (DNA ou RNA) – produção de novos vírus. Capsídeo (proteínas) – proteção e virulência (poder de parasitar a célula).
Vírus são específicos. Ex: os que parasitam plantas não parasitam animais.
Células Incompletas
Células procariontes incompletas, como as clamídias, são parasitas celulares. Diferem dos vírus quanto: material genético (DNA e RNA ao mesmo tempo), possuem parte de sua maquinaria de síntese, possuem membrana semipermeável (troca com o meio).
Células Procarióticas
Cromossomos não estão separados do citoplasma por membrana.
São pequenas e simples – vivem independentes ou em comunidades. Pobreza de membrana plasmática. Compreendem principalmente as bactérias.
Parede rígida: (externa a membrana) confere proteção mecânica – proteínas e glicoaminoglicanas.
Polirribossomos: ribossomos + RNA mensageiro.
Mesossomo: invaginações da membrana. Respiração.
Nucleóides: material genético (DNA circular).
Plasmídeos: DNA extra cromossômico (resistência). Contra antibióticos, por ex e, podem trocar entre si.
Ausência de citoesqueleto – forma da célula é dada pela parede extracelular.
Células Eucarióticas
O citoplasma é envolto pela membrana plasmática e o núcleo pela membrana nuclear.
No citosol contém íons, aminoácidos, precursores dos ácidos nucleicos, enzimas.
Possui microfibrilas (actina) e microtúbulos (tubulina) – citoesqueleto.
Núcleo: contém cromossomos, possui envoltório nuclear, nucléolo (grande quantidade de RNA e proteínas, e pequena quantidade de DNA).
Cromatina composta por Histonas.
Genes e Mutações
Mudanças positivas: tendem a ser perpetuadas;
Mudanças neutras: podem ou não ser perpetuadas;
Mudanças que causam danos (negativos) levam a lugar nenhum -> células morrem e não deixam progênie.
Um segmento de DNA que não codifica proteínas, tende a sofrer mais mutações que genes que codificam uma proteína essencial.
Genes altamente conservados: são examinados para traçar relações familiares entre os organismos distantes. O rRNA (envolvido no processo de tradução) tem sido conservado desde o início da história da vida.
Pesquisa na E. coli
Tem requisitos nutricionais simples, adapta-se a condições químicas variáveis e reproduz-se rapidamente.
Aula 2 – Ácidos Nucleicos e Replicação do DNA
Replicação
A informação genética é copiada pela polimerização a partir de um molde.
A ligação entre os pares de bases é denominada Ligação de Hidrogênio.
Nucleotídeos
DNA: ácido desoxirribonucleico;
RNA: ácido ribonucleico.
Os nucleotídeos possuem três componentes característicos: 1 base nitrogenada, 1 pentose e 1 fosfato. A molécula sem o grupo fosfato é chamada nucleosídeo. 
Os nucleotídeos são ligados covalentemente por “pontes” de grupo fosfato.
O grupo C5 de uma unidade liga-se ao grupo C3 de outra unidade nucleotídica.
Importância de se replicar o DNA: transmissão fiel da informação genética.
Presentes na Replicação: Helicase, SSB, Topoisomerase (DNA girasse), Polimerases I, II e III.
Etapas da replicação: Helicase se liga à molécula de DNA na região, chamada origem de replicação. Separa as duas fitas de DNA -> as SSB impedem que elas voltem a se unir -> Primase sintetiza o primer de RNA que é pareado ao DNA e com nucleotídeos cujas bases nitrogenadas são complementares às da cadeia de DNA que serviu de molde. -> DNA polimerase se liga ao primer -> DNA polimerase começa a fazer a leitura das bases nitrogenadas da cadeia de DNA que serve de molde, adicionando à nova cadeia que está sendo sintetizada, nucleotídeos com bases nitrogenadas complementares -> a cadeia descontínua (leitura 3’ – 5’) é chamado de fragmento de Okazaki -> há ação da Telomerase quando necessário.
Replicação semiconservativa: as novas moléculas de DNA possuem uma cadeia velha e uma nova.
Mecanismos de Danos ao DNA
Danos ao DNA
Radiações ionizantes: raios X, gama e partículas alfa produzem quebras simples e duplas na fita de DNA.
Luz UV: lesão nos dímeros de pirimidina.
Substâncias químicas: podem produzir alterações nas bases, tanto diretamente (reativas com DNA) quanto indiretamente (intercalação de uma substancia química entre os pares de base). Ex: Brometo de Etídeo.
Agentes endógenos: base incorreta pode ser adicional pela DNA polimerase (baixa ocorrência).
Reparo de DNA
Processos que permitem que a célula enfrente os danos ao seu DNA -> a célula pode entrar em apoptose (em caso de dano excessivo); a célula pode repará-lo (se o dano for menos severo).
Aula 3 – Transcrição do DNA
Converte a informação genética de um segmento de DNA em uma fita de RNA.
Estão envolvidos: mRNA, tRNA, rRNA, RNA polimerase
Transcrição X Replicação
Semelhanças: 
Orientação da síntese (5’->3’);
Molde;
Etapas de Iniciação, Alongamento e Terminação.
Diferenças: na Transcrição...
Não há requisição de um iniciador;
Apenas segmentos do DNA estão envolvidos;
Apenas uma fita de DNA é usada como molde.
A RNA polimerase alonga a fita de RNA adicionando unidades de ribonucleotídeos na extremidade C3. Não requer um iniciador. Liga-se a sequencias específicas do DNA (promotores).
Durante a fase de Alongamento, forma-se um hibrido temporário de DNA-RNA dupla hélice -> será desfeito e DNA volta a ser duplex.
A RNA polimerase não possui atividade revisora (como DNA polimerase) -> maior taxa de erros.
Iniciação
RNA polimerase liga-se ao promotor (DNA intacto) -> DNA parcialmente desenrolado;
A transcrição é iniciada -> movimentação do complexo de iniciação para fora do promotor (liberação do promotor).
Regulação
Grande parte da regulação é direcionada à etapa de Iniciação.
RNA polimerase I: responsável pela síntese de apenas um tipo de RNA (precursores dos rRNA);
RNA polimerase II: síntese do mRNA e alguns RNA especializados;
RNA polimerase III: síntese do tRNA, rRNA 5S e outros RNA especializados pequenos.
Processamento
O transcrito primário de um mRNA contém regiões de íntros (não-codificadoras) e éxons (codificadoras).
Em um processo chamado emenda (splicing), os íntrons são removidos dos transcritos primários e os éxons são unidos para formar uma sequência contígua, que codifica para um polipeptídio funcional.
A remoção dos íntrons é realizada por um grande complexo formado por proteínas snRNP e snRNA, chamado spliceossomo atuando no reconhecimento do sítio de clivagem e na catálise do processo.
Transcrição Reversa
Alguns vírus carregam uma DNA polimerase dependente de RNA, chamada transcriptase reversa.Durante a infecção viral, o genoma viral de RNA fita simples e a enzima entram na célula hospedeira.
A transcriptase reversa primeiro catalisa a síntese de uma fita de DNA complementar ao RNA viral -> depois ela degrada a fita de RNA no hibrido RNA-DNA viral e a substitui por DNA.
A fita dúplex formada se incorpora ao genoma da célula hospedeira.
Esses genes virais integrados podem ser ativados e transcritos, e as proteínas virais + o genoma viral de RNA são empacotados como novos vírus.
Aula 4 – Código Genético e Síntese de Proteínas
Código Genético
O códon é lido de maneira sucessiva e não sobreposto.
O código genético é degenerado. Um aa pode ser especificado por mais de um códon, porém, cada códon especifica apenas um aa.
Códon de iniciação: AUG (Met);
Códon de terminação: UAA, UAG e UGA.
O tRNA pareia suas bases com os códons no mRNA por meio de uma sequência de três bases chamada anticódon. 
Síntese Proteica
Como na síntese do DNA e do RNA, a síntese proteica também passa pelas etapas de iniciação, alongamento e terminação.
Ribossomo
Os ribossomos possuem duas subunidades desiguais: 50S e 30S. formados por rRNA e proteínas.
RNA de Transferência (tRNA)
Há pelo menos um tRNA para cada aminoácido;
Estrutura “folha de trevo” com 4 braços, podendo ter um 5º braço.
Ativação dos Aminoácidos
Ligação do aminoácido correto ao tRNA, reação que ocorre no citosol (e não no ribossomo).
A identidade do aminoácido ligado ao tRNA não é conferida no ribossomo.
Taxa de erro maior que na síntese de DNA.
Iniciação
O mRNA liga-se ao ribossomo e ao tRNA de iniciação;
O tRNA de iniciação pareia com o códon AUG do mRNA, que sinaliza para o início da cadeia polipeptídica.
Iniciação etapa I
A subunidade ribossômica 30S liga-se a dois fatores de iniciação e, na sequência o mRNA liga-se a subunidade 30S.
O códon AUG de iniciação é guiado para a sua posição correta (sequência de Shine-Dalgarno.
Iniciação etapa II
O tRNA de iniciação pareia seu anticódon com o códon de iniciação do mRNA.
Iniciação etapa III
Esse grande complexo formado agora se combina com a subunidade ribossômica 50S.
Os fatores de iniciação são liberados.
Alongamento
O polipeptídio é alongado pela ligação de sucessivas unidades de aa, que são transportados ao ribossomo e corretamente posicionados pelo seu tRNA.
Alongamento etapa I
O aminoacil-tRNA apropriado que chega liga-se ao sítio A do ribossomo.
Alongamento etapa II
Uma ligação peptídica é formada entre os dois aa que permanecem unidos no sítio A.
O tRNA “descarregado” permanece no sítio P.
Alongamento etapa III
O ribossomo move-se um códon no sentido 5’->3’.
Isso desloca o tRNA do sítio A para o sítio P, e o tRNA do sítio P para o sítio E.
O tRNA é então liberado do sítio E e o sítio A fica disponível para o próximo tRNA.
Terminação e Liberação
O alongamento continua até que o ribossomo adicione o ultimo aa codificado pelo mRNA.
A terminação é sinalizada pela presença de um dos três códons de terminação.
Os fatores de terminalão reconhecem e ligam-se ao códon de terminação. 
Hidrólise da ligação peptidil-tRNA e liberação do polipeptídio.
Dissociação das subunidades do ribossomo (prontas para nova síntese proteica).
NP2
Aula 5 – Biotecnologia Parte I
Isolamento de Células
O primeiro passo no isolamento de células é romper a matriz extracelular e as junções entre as células. O tecido é tratado com enzimas proteolíticas – digestão das proteínas da matriz extracelular. O tecido pode ser então dissociado em células individuais por agitação leve.
Separador de células ativado por fluorescência: ac ligado a um corante fluorescente liga-se especificamente à superfície de apenas um tipo celular.
Uma célula passando através do feixe de laser é monitorada pela sua fluorescência. Muito usado.
Microdissecação por captura a laser: um feixe de laser é utilizado para cortar uma região de interesse.
Permite o isolamento de até mesmo uma única célula a partir de uma amostra fina de tecido.
Cultura de Células
Utilizada devido desvantagem na purificação de moléculas por conta da complexidade de tecidos e órgãos intactos.
Células cultivadas em meio de cultura fornecem uma população mais homogênea de células das quais o material pode ser extraído e analisado.
In vitro: dentro do vidro ; in vivo: em organismos vivos.
Cultura de células pode ser enquadrada em In vivo.
As células de tecidos requerem uma superfície sólida para crescer e se dividir – não estão adaptadas para viver em suspensão.
Tipos de cultura de células
Cultura primária: cultura preparada diretamente à partir dos tecidos de um organismo.
Cultura secundária: células em cultura primária podem ser removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente.
Senescência celular replicativa:
A maioria das células de vertebrados para de se dividir após um número finito de divisões celulares em cultura – no final as células morrem.
Ocorre uma perda progressiva das extremidades dos telômeros.
A proliferação dos fibroblastos pode ser induzida indefinidamente quando o gene que codifica para telomerase é fornecido – linhagem celular imortalizada.
Há mecanismos de pontos de checagem que detém o ciclo celular – choque de cultura – células percebem que há algo de errado e param de replicar.
Células em cultura diferem de suas progenitoras normais nos tecidos de onde foram originadas.
Células-Tronco Embrionárias
As células-tronco embrionárias são coletadas do embrião jovem.
Podem proliferar indefinidamente em cultura.
Essas células cultivadas em culturas, quando recolocadas em um meio embrionário inicial, podem dar origem a todos os tipos celulares do corpo. 
Podem ser usadas para substituir e reparar tecidos humanos maduros lesionados.
Transplante Nuclear de Células Somáticas
Um clone é simplesmente um grupo de indivíduos idênticos geneticamente – único ancestral.
Clonagem de células: clone de células epidermais idênticas geneticamente – reconstrução de pele de pacientes com queimaduras.
Clonagem reprodutiva: transplante nuclear de células somáticas -> clonagem de animais multicelulares inteiros.
Clonagem terapêutica: transplante nuclear de células somáticas -> produção de células ES personalizadas, de forma a gerar vários tipos celulares para reparo de tecidos.
Produção de Anticorpos Monoclonais
Linhagens celulares de hibridomas produzem anticorpos monoclonais.
Anticorpos podem ser obtidos de um único animal inoculado com a proteína de interesse (antígeno) e subsequente isolamento a partir de uma mistura heterogênea de anticorpos.
Exemplo de Hibridoma: Fusão de células B produtor de anticorpo para o antígeno de interesse em células de mieloma. Isolamento de hibridoma com crescimento em cultura. Diferenciação de hibridomas.
Purificação de Proteínas
Para se purificar uma proteína, ela precisa ser primeiro extraída de dentro da célula.
Umas das formas de romper a célula é por choque osmótico.
A suspensão de células é desse modo reduzida a um homogenato ou extrato, cujos componentes devem ser separados. 
Fracionamento celular por ultracentrifugação: realiza diversas centrifugações e em diversas centrífugas para se isolar organelas. 
Proteínas são também fracionadas por cromatografia em coluna, na qual uma mistura de proteínas em solução é passada através de uma coluna contendo uma matriz sólida porosa:
Cromatografia em troca iônica -> por carga (forças opostas se atraem);
Cromatografia de filtração em gel -> por tamanho;
Cromatografia hidrofóbica -> por hidrofobicidade;
Cromatografia de afinidade -> por ligação a outras moléculas;
Cromatografia líquida de alta performance (HPLC) -> alto grau de resolução.
Eletroforese em gel de poliacrilamida – SDS -> método de separação onde moléculas menores chegam primeiro ao polo oposto (VER SLIDE).
Western Blotting -> uma proteína específica pode ser identificada após seu fracionamento em gel de poliacrilamida pela exposição de todas as proteínas presentes no gel a um anticorpoespecífico acoplado a um corante fluorescente ou a um isótopo radioativo. Membrana de náilon ou nitrocelulose.
Espectrometria de massa -> método altamente sensível para identificar proteínas desconhecidas. MALDI-TOF: fornece medidas acuradas da massa molecular de proteínas e peptídeos.
Cristalografia por raios X -> determinação da estrutura proteica pelo uso de difração de raios X. Um feixe de raios X é direcionado para uma amostra de proteína pura (um cristal bem ordenado). Uma pequena fração é espelhada pelos átomos na amostra. As ondas dispersas aparecerão como pontos de difração em um detector apropriado. Não é possível identificar proteínas em solução.
NMR (espectrometria de ressonância magnética nuclear) -> determina a estrutura de proteínas em solução. Um pequeno volume de solução proteica concentrada é colocado em um campo magnético forte.
Aula 2 – Biotecnologia Parte II
Eletroforese em Gel
Para fragmentos pequenos de DNA -> Gel de policriamida (separa moléculas que diferem em 1 nucleotídeo;
Para moléculas de DNA maiores -> Gel de agarose (poros maiores)
Bandas de DNA são invisíveis -> brometo de etídeo (cancerígeno, pois, se intercala na cadeia de DNA) fluoresce sob luz UV quando ligado ao DNA.
Eletroforese em campo pulsado: campo elétrico altera sua posição. Utilizado para moléculas grandes. Conforme muda a direção, as moléculas tem que se realinhar, ficando mais lentas.
Hibridização de Ácidos Nucleicos
DNA submetido a altas temperaturas (até 100 ºC) ou a pH muito alto (maior ou igual a 13) -> dupla-hélice rapidamente se dissocia em duas fitas simples -> desnaturação do DNA – foi considerado irreversível.
Hibridização (renaturação do DNA) -> duplas hélices mantidas por um período prolongado a 65 ºC. (Pode ser utilizada em técnicas forenses).
Hibridização pode ocorrer em DNA/DNA, RNA/RNA e DNA/RNA – portanto que tenham sequências de nucleotídeos complementares. (Teoria do PCR surgiu aqui).
Hibridização de sondas de DNA com RNA: permite determinar se um gene está ou não sendo transcrito (se está formando RNA, o gene está ativo). A sonda de DNA pode ser tratada com nucleases especificas após a hibridização -> determinação de sítios de início e fim da transcrição.
Northern Blotting
Para tornar as moléculas de RNA acessíveis às sondas de DNA, é feita uma réplica do padrão de bandas de RNA no gel por transferência (blotting) das moléculas de RNA fracionadas para uma membrana de nitrocelulose ou náilon.
A membrana é então incubada em uma solução contendo uma sonda de DNA marcada -> as moléculas de RNA hibridizam com a sonda por serem complementares e podem ser localizadas por autorradiografia ou por meios químicos.
Southern Blotting
O método original de hibridização após a transferência de gel, chamado de Southern Blotting, analisa o DNA e não o RNA 
Clonagem de DNA
Amplificação de uma determinada sequência de DNA.
Inserção de um fragmento de DNA particular no DNA genômico de um elemento genético que se autorreplica (vírus ou plasmídeo).
Um fragmento de DNA contendo um gene humano pode ser ligado a um cromossomo de vírus bacteriano, e a nova molécula de DNA recombinante poderá ser introduzida em uma célula bacteriana e replicada junto com o DNA do vírus.
Bibliotecas de DNA
Utiliza-se o mNA de células para fazer uma cópia de DNA a partir do RNA extraído (transcrição reversa – com transcriptase reversa) -> cDNA ou DNA complementar.
Biblioteca de cDNA -> coleção de clones derivados de uma preparação de mRNA.
Clones de cDNA de uma célula -> apenas regiões transcritas e remoção das sequências não-codificantes (íntrons).
PCR
A reação em cadeira polimerase possibilita rápida clonagem: permite que o DNA de uma região selecionada seja amplificado.
O conhecimento da sequência a ser amplificada é utilizado para projetar dois primer de DNA sintéticos.
A técnica requer a utilização de uma DNA polimerase especial, isolada de uma bactéria termofílica, estável a temperaturas altas. (Primer indica o início do DNA. Um para 5’-3’ e outro para 3’-5’).
(Anelamento: primer pareia. Etapa de hibridização, polimerase faz alongamento (polimerização), produzindo cópia do DNA).
Vetores de Expressão
Uma variedade de vetores de expressão está disponível, cada um modificado por engenharia genética para funcionar em um tipo de célula na qual a proteína deverá ser produzida.
Sequenciamento de DNA
Tornaram possível o Projeto Genoma.
Método de didesoxi para sequenciamento de DNA.
Os nucleotídeos terminadores de cadeira marcados com corantes fluorescentes coloridos diferentes facilitam o processo.
Um computador faz a leitura e armazena essa sequência de nucleotídeos. (Nucleotídeos onde o carbono 3 não possui cadeia hidroxila, só o hidrogênio e nenhum nucleotídeo se liga a ele). 
Aplicações Médicas
Como a sequência do genoma de RNA do HIV é conhecida, a RT-PCR (real time PCR) pode ser usada para amplificar e detectar RNA de HIV em amostras de sangue ou tecido.
Entre os genes identificados em doenças humanas (via PCR) estão os genes da anemia falciforme, hemofilia, fibrose cística, doença de Huntington e distrofia muscular de Duchenne.
Muitos visualizam um futuro de “medicina personalizada” em que cada perfil genético pessoal possa informar sobre doenças ou condições para as quais a pessoa corre risco e ajudar na escolha de tratamentos.
Produtos farmacêuticos
Síntese de pequenas moléculas para uso como medicamentos: imatinibe (Gleevec) -> é uma pequena molécula que inibe o receptor especifico de tirosa-cinase, cuja superexpressão é eficaz em causar LMC.
Problema deste método: células resistentes ao medicamento. (Células tumorais).
Terapia Gênica Humana
Introdução de genes em indivíduos doentes para fins terapêuticos.
Em tese, um alelo normal do gene deficiente poderia ser inserido nas células somáticas do tecido afetado pela doença.
As células da medula óssea são as principais candidatas.
Questões éticas.
Vacina Gênica
DNA que codifica para determinado patógeno é injetado nas células humanas.
Evidência Forense e Perfis Genéticos
Método que envolve a eletroforese em gel e a hibridização de ácidos nucleicos para detectar semelhanças e diferenças nas amostras de DNA -> perfil genético.
Método hoje utilizado é ainda mais sensível – STR (repetições curtas em tandem) + PCR.
DNA na Identificação Humana: comparando o DNA da mãe, do filho e do provável pai, pode ser resolvida de forma conclusiva a questão da paternidade.
Qual a confiabilidade? Utilizando-se 13 marcadores de STR a chance de duas pessoas terem perfis genéticos idênticos é de 1 em 10 bilhões.

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