Colorações Bacterianas

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Colorações Bacterianas: 
Coloração
Os microrganismos são quase todos incolores na observação ao microscópio óptico, assim necessita-se preparar a amostra para ser observada, uma das formas mais comuns é por coloração, de modo que o corante vai ressaltar determinadas estruturas celulares.
O Esfregaço
Para serem corados os microrganismos precisam ser primeiramente fixados em lâminas, estes então são mortos e fixados, dando uma duração significativa para a amostra.
Deve-se formar um filme delgado com a amostra sobre a lâmina, que se denomina esfregaço, que pode ser secado ao ar livre ou em lamparina ou bico de Bunsen. Quando se utiliza o calor para secar a lâmina deve observar que o lado do esfregaço deve ficar para cima, ou seja, com contato indireto com a chama. Desta forma a amostra já está fixada.
Coloração Positiva e Negativa
Quando o cromóforo a parte carrega da molécula do corante se une a determinadas estruturas celulares tornando assim colorida. Comumente a corantes básicos (íon positivo é que dará cor) tendem a corar as estruturas negativas, pois em pH 7 as estruturas bacterianas tendem a ficar carregadas negativamente. Assim a coloração da célula se dá de forma direta. Contudo em corantes ácidos (é o íon negativo que dará cor) não há atração com as estruturas negativas que repelirá o corante, e assim haverá a coloração do fundo. Esta técnica de coloração do fundo é válida para analisar forma geral da célula, tamanho e cápsula pois a célula se torna bem visível contra um fundo escuro.
Corantes Básicos
Violeta de Genciana;
Azul de metileno;
Safranina;
Corantes Ácidos
Eosina;
Nigrosina;
Tinta nanquim;
Coloração Simples
O objetivo da coloração simples é destacar todo o organismo, assim ficando nítida a forma celular e estruturas básicas. Faz um esfregaço, aplica-se a solução corante por determinado tempo, lava-se em água corrente e depois se seca suavemente a lâmina. É comum colocar um mordente na solução, para intensificar a coloração.
Coloração Diferencial
Coloração de Gram
Método de Gram
“Coloração Primária” Recobrir um esfregaço por calor por um corante básico púrpura (violeta genciana);
Lava-se o esfregaço e recobri-lo com um mordente (Iodo). Pois todas as bactérias (Gram positivas e negativas se coram em violeta escuro ou púrpura);
Lava-se a lâmina com álcool-acetona (Agente descolorante);
Lava-se o álcool e cora-se com safranina, o contra-corante (corante básico vermelho)
Lave-se o esfregaço e seque-o;
As gram-negativas são perdem ao corante púrpura após a lavagem com álcool e são sensíveis a safranina. E as gram-positivas não perdem essa coloração e assim não são afetadas pela safranina. Isto ocorre porque as bactérias gram-positivas possuem uma parede mais espessa de peptideoglicano do que as gram-negativas que possuem uma camada de lipopolisacarídeos. Assim o complexo violeta-iodo (CV-I) é formado dentro da parede celular, pois o violeta de genciana não pode mais sair de lá, devido o seu tamanho. Contudo já nas bactérias gram-negativas por haver a camanda de lipopolisacarídeos, este é rompido pela lavem com álcool e assim o CV-I é removido da camada delgada de peptideoglicana, permanecendo assim incolor. Por isso é que se faz necessário o contra-corante de safranina.
O método de coloração Gram é útil para a clínica médica, pois as bactérias gram-positivas tendem a serem mais susceptíveis a antibióticos como penicilinas e cefalosporina. Já as bactérias gram-negativas tendem a ser mais resistente a antibióticos, pois não conseguem atravessar devido a sua camada de lipopolisacarídeos.
Coloração Alcool-Ácido Resistente (Ziehl-Neelsen)
Este tipo de coloração é usado principalmente pelos microbiologistas para corar bactérias do gênero Mycobacterium e identificar cepas patogênicas de Nocardia.
O corante carbolfucsina é aplicado no esfregaço e aquecido lentamente por vários minutos, resfria-se a lâmina e lavada em água, depois tratado com um descolorante (álcool-ácido). Assim as bactérias não álcool-ácida resistentes são descoradas, permanecendo só as coradas de vermelho. Após, aplica-se azul de metileno que corará as bactérias não álcool-ácido resistentes em azul.
Coloração Especial
Coloração Negativa para Cápsulas
Alguns microorganismos possuem um revestimento gelatinoso denominado cápsula que se pode determinar a virulência do organismo.
Esta coloração é mais difícil, pois a materiais capsulares são solúveis em água, que podem ser desalojados ou removidos durante a lavagem. Assim, pode-se fazer uma solução coloidal fina de partículas coradas (tinta nanquim ou nigrosina) para fornecer um fundo escuro e depois corar por coloração simples, por safranina, por exemplo. Devido a composição química, a cápsula nega a maioria dos corantes biológicos, como a safranina, e o uso do nanquim faz uma coloração negativa, evidenciando o contraste entre o fundo, circundante, e a cápsula.
Coloração para Endosporos
Em condições ambientais adversas, forma-se dentro da célula, uma estrutura resistente, dormente, o Endosporo (Esporo). Os esporos não podem ser corados por métodos comuns, de forma que é usado a técnica de Schaeffer – Fulton, onde o verde malaquita é aplicada em esfregaço por calor e aquecido por 5mim (aproximadamente), lava-se por 30 segundos e em seguida aplica-se a safranina para corar as partes da célula que não é endósporo.
Coloração para Flagelos
Cora-se por carbolfuscina para aumentar os flagelos até uma proporção desejada, pois o numero e o arranjo de flagelos servem para o auxilio em diagnósticos.
Coloraçãode Gram 
A técnica de Gram, também conhecida como coloração de Gram, é um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853-1938), em 1884, o qual permite diferenciar bactérias com diferentes estruturas de parede celular a partir das colorações que estas adquirem após tratamento com agentes químicos específicos. O método consiste em tratar sucessivamente um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina básica. As bactérias que adquirem a coloração azul violeta são chamadas de Gram-positivas e aquelas que adquirem a coloração vermelho são chamadas de Gram-negativas.
O método da coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes celulares de bactérias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um tratamento com etanol-acetona enquanto que as paredes celulares de bactérias Gram-negativas não o fazem.
Técnicas de semeadura 
As técnicas de semeadura são o método pelo qual se transfere inóculos bacterianos de um meio de cultura ou material a ser analisado (secreções, alimentos) para um outro meio de cultura. Para garantir que apenas o microrganismo desejado seja semeado, são utilizadas as técnicas assépticas: procedimentos que devem ser adotados visando a não contaminação de materiais, meios e culturas.
Semeaduras em meios sólidos em tubos
Estria sinuosa: semear com alça ou agulha bacteriológica, em zig-zag, partindo da base para a extremidade do bizel (superfície inclinada do meio). 
Objetivo: obtenção de intensa massa de microorganismos.
Estria Reta: semear com agulha bacteriológica, fazendo uma linha reta, com cuidado de não ferir o Agar, partindo da base para a extremidade do bizel (superfície inclinada do meio). 
Objetivo: obtenção de pequena massa de microorganismos.
Picada Central: semear com agulha bacteriológica, no centro do Agar. Dependendo da finalidade, o inóculo deve penetrar até 2/3 do tubo ou até o fundo deste. 
Objetivo: é utilizado para verificar fermentação e motilidade em algumas técnicas.
Picada em Profundidade: semear com agulha bacteriológica, no centro do Agar. Dependendo da finalidade, o inóculo deve penetrar até 2/3 do tubo ou até o fundo deste. 
Objetivo: é utilizado para verificar fermentação e motilidade em algumas técnicas.
Semeaduras em meios sólidos em placas de Petri
Pour-plate ou disseminação (método em profundidade): Transferir 1 mlda cultura para placa de Petri vazia, colocar 10 – 20 ml do meio fundido (e resfriado a cerca de 45 – 50°C) sobre a cultura e homogeneizar suavemente com movimentos circulares. 
Objetivo: contagem bacteriana. É utilizado também para análise de microrganismos anaeróbios, adicionando uma outra camada de meio fundido após o endurecimento da primeira camada.
Estria simples: transferir uma alçada da cultura para meio sólido em placa e estriar com a alça bacteriológica sobre o meio. A estria pode ser realizada em movimento de zig- zag (estria sinuosa) ou como uma linha reta sobre o meio (estria reta). 
Objetivo: Essa técnica é muito utilizada para visualização de determinadas propriedades metabólicas, como a produção de enzimas hidrolíticas (hidrólise de substâncias do meio - gema de ovo, sangue...), e produção de pigmentos.
Esgotamento em estrias ou estrias múltiplas: transferir uma alçada da cultura para meio sólido em placa e estriar com a alça bacteriológica sobre o meio. A placa é dividida em 4 quadrantes e a inoculação pode ser feita de 2 tipos:
• 3 estrias: estriar em metade da placa, com movimentos de zig-zag. Quando atingir a metade, girar a placa 90° e estriar até a metade (1/4 da placa), girar mais 90° e estriar o meio restante. 
• 4 estrias: estriar até 2/3 da metade da placa, girar 90°, estriar 2/3 do próximo quadrante (1/4 da placa), girar 90°, estriar mais 2/3 do próximo quadrante (1/4 da placa), girar 90° e estriar o restante do meio.
Objetivo: obtenção de colônias isoladas. É importante não cruzar as estrias (não tocar a alça na estria anterior), para reduzir o inóculo a cada estria e obter as colônias isoladas. Pode-se, alternativamente, flambar a alça entre as estrias e tocar a ponta da estria anterior, arrastando um pequeno inóculo para a próxima estria.
Spread-plate ou distensão: Transferir 0,1 ml da cultura para o meio sólido na placa e espalhar uniformemente com a própria ponta da pipeta, ou alça bacteriológica / swab / alça Drigalsky.
Objetivo: obtenção de crescimento confluente, ou para contagem bacteriana. Esta técnica é muito utilizada na realização de antibiogramas.
Semeaduras em meios líquidos
Difusão: uma alçada da colônia (Agar em placa) ou da cultura (de outro meio ou líquido) é introduzida no meio líquido, com agitação da alça, para maior difusão dos microorganismos (da alça para o meio e homogeneização no meio). Pode-se inclinar o tubo a 30° e esfregar o inóculo na parede do mesmo, quando o tubo retornar à posição original o inóculo se difundirá no meio. Objetivo: é um repique genérico para crescimento bacteriano em meio líquido.
Trabalho
De
Microbiologia
2017