Relatório 5 bioquím

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Faculdade de Engenharia de Alimentos
Unicamp- Universidade Estadual de Campinas
Relatório 5
Escurecimento enzimático por polifenoloxidase (PFO)
 
Caroline Mantovani Celegatti, 155008
Gabriella Stein Durazzo Monteiro dos Santos, 155526
Isabella Peressinoto Romero, 155808
Prof. Hélia Sato
TA 610 Transformações Bioquímicas em Alimentos
Turma B - Grupo 2
2º Semestre 2016
Campinas, 4 de outubro de 2016
1. INTRODUÇÃO
Um dos maiores problemas encontrados na manipulação e processamento de várias frutas e vegetais é o escurecimento enzimático e não enzimático (GALEAZZI, 1984). Segundo Varouquaux e Wiley (1997), as polifenoloxidases representam a classe das enzimas envolvidas no escurecimento enzimático de vegetais e, pequena redução no pH pode diminuir em até 50% sua atividade enzimática. Essas enzimas são responsáveis por oxidar mono, di e polifenóis na presença de oxigênio molecular, resultando ao final em melanina, um pigmento marrom-avermelhado (GALEAZZI, 1984).
O mecanismo de ação dessas enzimas pode ser explicado por Belitz & Grosch (1997): No centro ativo da enzima existem dois íons Cu+, cujos campos de ligação possuem dois resíduos de histidina cada um. Primeiramente, a enzima se liga primeiro ao oxigênio e depois ao monofenol. A mudança de valência dos íons cobre leva a formação de complexo enzima-substrato, no qual a ligação O – O fica muito polarizada permitindo a ocorrência de hidroxilação, seguida da formação de um ortodifenol. A oxidação do ortodifenol a ortoquinona termina o ciclo. As quinonas, compostos amarelados, instáveis e reativos, podem reagir entre si, formando polímeros com alta massa molecular de cor escura, denominados melaninas, como pode ser ilustrado na Figura 1.
Figura 1. Reação de escurecimento enzimático (SANTOS, 2009)
A polifenoloxidase tem sua ação aumentada após evento de danos mecânicos, cortes ou outros tipos de danos à célula, sendo mais presente nos frutos mais jovens. 	A enzima pode ser encontrada dentro dos mais diversos compartimentos celulares, dessa forma o escurecimento enzimático acaba sendo uma conseqüência direta da desintegração do tecido, pois o dano às paredes e membranas lesionadas, dificulta a separação física entre as enzimas e os substratos fenólicos, ocasionando, assim, a reação de escurecimento (SILVA et al., 2012; SANTOS,2009).
2. OBJETIVO
A aula prática teve como objetivo estudar o efeito do pH, da temperatura e de diferentes compostos na inibição da atividade da polifenoloxidase em frutas e vegetais
3. MATERIAL E MÉTODOS
ITEM A - Extração de polifenoloxidase
O item A foi preparado pelos técnicos do laboratório antes do início da aula prática. As amostras de 60g de batata (sem casca), 60g de banana (sem casca), 60g de berinjela (sem casca) e 120g de maçã (sem casca) foram homogeneizadas, separadamente em 600 mL de água destilada resfriada a 10 oC, em liquidificador.
As amostras foram filtradas em algodão utilizando-se funil. Os filtrados foram utilizados, posteriormente, como extratos da enzima polifenoloxidase (PFO). Cada grupo do laboratório utilizou um extrato enzimático de PFO diferente para os ensaios
ITEM B - Inativação térmica da PFO através do tratamento da fruta ou vegetal em água em ebulição por 5 minutos 
Para a inativação térmica da PFO as frutas e os vegetais foram descascados e cortados em cubos de 1 cm de aresta. 30g de cada amostra foram aquecidas em uma panela contendo 300 mL de água em ebulição durante 5 minutos. Após o tratamento térmico as panelas foram colocadas em bandeja com gelo para resfriar. As amostras (fruta ou vegetal + água) foram homogeneizadas em liquidificador. As amostras foram filtradas em algodão utilizando funil. As amostras de filtrado foram utilizados para o teste de determinação da atividade residual de polifenoloxidase. 
ITEM B-1- Determinação da atividade da polifenoloxidase após tratamento da amostra em água em ebulição durante 5 minutos
Dois tubos de ensaio foram numerados como B-1 teste e B-1 controle. 4mL de solução 0,2 % de catecol em tampão fosfato 0,05M pH 6,0 (já preparado) foi pipetado nos 2 tubos de ensaio numerados.
No tubo B-1 teste, foi adicionado 0,5mL de água destilada e 0,5 mL de extrato enzimático de PFO, obtido após tratamento da amostra de fruta ou vegetal por 5 minutos em ebulição como descrito no item B. No tubo B-1 controle, 1mL de água destilada foi adicionado.
Os tubos foram agitados e homogeneizados e incubados em banho maria termostatizado a 35°C por 30 minutos. A coloração foi observada. 
Neste item determinou-se se a PFO da banana foi inativada após tratamento térmico durante 5 minutos de ebulição.
Para os itens C, D e E, foi utilizado o estrato enzimático de PFO de banana.
ITEM C - Efeito do pH na atividade de polifenoloxidase de frutas e vegetais
6 tubos de ensaio foram numerados como pH 2,6; 3,6; 4,0; 5,0; 6,0 e 7,0. 4mL de soluções de 0,2% de catecol em tampão de diferentes valores de pH 2,6; 3,6; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0 foram pipetados nos tubos de ensaio previamente numerados.
0,5mL de água destilada e 0,5mL de PFO foram adicionados em cada um dos seis tubos de ensaio, os quais foram agitados, homogeneizados e incubados em banho maria a 35°C por 15 minutos.
A intensidade da coloração foi anotada após 15 minutos de reação. O pH ótimo de atividade foi observado e anotado. 
ITEM D- Efeito do ácido ascórbico na atividade da polifenoloxidase de frutas e vegetais
6 tubos de ensaio foram numerados como D-0,5%; D- 0,25%; D- 0,1%; D- 0,05%; D- 0,02% e D-controle. A partir da solução 0,5% de ácido ascórbico, 5 tubos de ensaio foram preparados (0,5mL) com diferentes concentrações: 0,5%; 0,25%; 0,1% ; 0,05% e 0,02%. No tubo controle, 0,5mL de água destilada foi adicionado.
Nos 6 tubos de ensaio, 4mL de solução de catecol 0,2% em tampão fosfato 0,05M pH 6,0 foram adicionados. Posteriormente, 0,5mL de extrato PFO foi adicionado nos tubos, os quais foram agitados, homogeneizados e incubados em banho maria a 35°C.
A intensidade da coloração foi anotada após 15 minutos de reação. Foi anotado em qual concentração de inibidor não ocorreu escurecimento enzimático. 
ITEM E- Efeito do bissulfito de sódio na atividade da polifenoloxidase de frutas e vegetais
6 tubos de ensaio foram numerados como: E- 0,5%; E- 0,25%; E- 0,1%; E- 0,05%; E- 0,02% e E-controle. A partir da solução 0,5% de bissulfito de sódio, 5 tubos de ensaio foram preparados (0,5mL) com diferentes concentrações: 0,5%; 0,25%; 0,1% ; 0,05% e 0,02%. No tubo controle, 0,5mL de água destilada foi adicionado.
4mL de solução de catecol 0,2% em tampão fosfato 0,05M pH 6,0 foram adicionados nos 6 tubos de ensaios. 0,5 mL de extrato PFO foi adicionado nos tubos, os quais foram agitados, homogeneizados e incubados em banho maria a 35°C.
A intensidade da coloração foi anotada após 15 minutos de reação e foi anotado em qual concentração de inibidor não ocorreu escurecimento enzimático.
ITEM F - Efeito do ácido ascórbico, ácido cítrico, bissulfito de sódio, cloreto de sódio e ácido oxálico na atividade da polifenoloxidase de berinjela
30mL de solução de ácido ascórbico, ácido cítrico, bissulfito de sódio, cloreto de sódio e ácido oxálico foram preparados como indicado na Tabela 1. As soluções foram colocadas nas placas de petri numeradas.
Após preparadas as soluções, descascou-se a berinjela em 11 fatias de 0,7cm de espessura. Cada fatia foi colocada em uma placa de petri. As fatias foram amassadas com um garfo, que foi lavado entre uma amostra e outra. A intensidade do escurecimento foi anotada.
Tabela 1. Preparo de soluções para o item F
	Placas
	Amostra
	1
	berinjela + 30mL água
	2
	berinjela + 30mL ácido ascórbico 0,5%
	3
	berinjela + 30mL ácido cítrico 1,0%
	4
	berinjela + 30mL ácido cítrico 0,5%
	5
	berinjela + 30mL NaHSO3 0,5%
	6
	berinjela + 30mL NaHSO3 0,25%
	7
	berinjela+ 30mL NaHSO3 0,1%
	8
	berinjela + 30mL NaHSO3 0,05%
	9
	berinjela + 30mLNaHSO3 0,02%
	10
	berinjela + 30mL NaCl 1,0%
	11
	berinjela + 30mL ácido oxálico 1,0%
 
ITEM G- Detecção da atividade de polifenoloxidase em alimentos frescos
2mL de solução 0,2% catecol em tampão fosfato 0,05M pH 6,0 foi adicionado em fatias de batata, maçã, banana e abacaxi. Foi verificado se houve formação de pigmento escuro, que indica a presença de catecolase.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO	
A Tabela 2 mostra se houve inativação térmica da PFO em banana após tratamento térmico em água em ebulição por 5 minutos
Tabela 2. Item B1 - inativação térmica da PFO de frutas e vegetais através de tratamento térmico em água em ebulição por 5 minutos
	PFO
	Resultado
	Banana
	Ativa
 
Como o tubo obteve coloração amarela, é possível afirmar que a inativação térmica da PFO através de tratamento térmico em água em ebulição por 5 minutos não foi eficiente.
A Tabela 3 mostra o efeito do pH na atividade de PFO de banana, indicando a intensidade com a quantidade de “+”.
 Tabela 3. Item C - efeito do pH na atividade de PFO de frutas e vegetais
	pH
	PFO Banana
	2,6
	+
	3,6
	++
	4,0
	+++
	5,0
	++++
	6,0
	++
	7,0
	++
 
O pH ótimo para a atividade da polifenoloxidases de diferentes fontes se situa entre pH 5,0 e 7,0. Esses ótimos de pH variam também com métodos de extração, pureza da enzima, substratos e soluções tampão utilizadas (SILVA, 2009). Portanto o resultado está coerente com a literatura, pois o pH ótimo observado foi de 5,0.
A Tabela 4 identifica o efeito do ácido ascórbico na atividade da PFO de banana, indicando a intensidade com a quantidade de “+”.
Tabela 4. Item D - efeito do ácido ascórbico na atividade de PFO de frutas e vegetais
	Ác. Ascórbico
	PFO Banana
	0,50%
	-
	0,25%
	-
	0,10%
	+
	0,05%
	+++
	0,02%
	+++
	Controle
	++++
 
Pode-se verificar que, a partir dos resultados, o ácido ascórbico inibiu a PFO em banana até 0,25% e ainda restou uma atividade residual em concentração de 0,10%. Entretanto, pode-se notar também que a concentração 0,02% obteve menor efeito da PFO que na amostra controle.
O ácido ascórbico, assim como outros antioxidantes são permitidos em baixas concentrações (0,001 a 0,01%) nos alimentos. A Tabela 5 mostra o limite de áciso ascórbico em produtos de frutas e vegetais.
Tabela 5. Limite máximo de ácido ascórbico para produtos de frutas e vegetais
	Produto
	Limite máximo (g/100g ou g/100ml)
	Geléia de fruta
	quantum satis
	Doces de frutas/vegetais
	0,05
	Suco, néctar, polpa de fruta, suco tropical e água de coco
	quantum satis
	Frutas em conserva, pasteurizadas ou não
	0,03
	Vegetais in natura embalados e com tratamento de superfície (incluindo cogumelos comestíveis)
	quantum satis
	Vegetais descascados e ou picados, congelados ou não (incluindo cogumelos comestíveis)
	0,01 (Somente para congelados)
	Frutas cristalizadas ou glaceadas
	0,005
	Vegetais secos ou desidratados (incluindo cogumelos comestíveis)
	quantum satis
[ANVISA, 1997]
A Tabela 5 mostra o efeito do bissulfito de sódio na atividade da PFO de banana, indicando a intensidade com a quantidade de “+”.
Tabela 5. Efeito do bissulfito de sódio na atividade da PFO de frutas e vegetais
	Bissulfito de sódio
	PFO Banana
	0,50%
	++
	0,25%
	++
	0,10%
	-
	0,05%
	-
	0,02%
	-
	Controle
	+++
 
Pode ser verificado que o bissulfito de sódio inativou a PFO da banana em concentrações de 0,02% a 0,10%.
A concentração máxima de bissulfito permitida em polpas (de frutas ou vegetais) é de 0,03 (g/100g ou g/100mL), e no caso de purês (de frutas ou vegetais) é de 0,06 (g/100g ou g/100mL) (ANVISA, 1997).
A Tabela 6 mostra o efeito do ácido ascórbico, bissulfito de sódio e cloreto de sódio na atividade da PFO de berinjela, indicando a intensidade com a quantidade de “+”.
Tabela 6. Item F - efeito do ácido ascórbico, bissulfito de sódio e cloreto de sódio na atividade da PFO de berinjela
	Placas
	Amostra
	Intensidade do escurecimento enzimático
	1
	Berinjela + 30mL água
	+
	2
	Berinjela + 30mL ácido ascórbico 0,5%
	++
	3
	Berinjela + 30mL ácido cítrico 1,0%
	++
	4
	Berinjela + 30mL ácido cítrico 0,5%%
	+++
	5
	Berinjela + 30mL NaHSO₃ 0,5%
	-
	6
	Berinjela + 30mL NaHSO₃ 0,25%
	+
	7
	Berinjela + 30mL NaHSO₃ 0,1%
	++
	8
	Berinjela + 30mL NaHSO₃ 0,05%
	+
	9
	Berinjela + 30mL NaHSO₃ 0,02%
	+
	10
	Berinjela + 30mL NaCl 1,0%
	-
	11
	Berinjela + 30mL ácido oxálico 1,0%
	+
 
A partir dos resultados, pode-se perceber que a água teve efeito sobre a PFO da berinjela, assim como as outras substâncias, entretanto nas outras substâncias pode-se analisar o efeito de diferentes concentrações. O NaHSO₃ 0,5% e o NaCl 1,0% inibiram completamente o efeito da PFO.
A Tabela 7 indica a detecção da atividade de PFO em alimentos frescos, indicando a intensidade com a quantidade de “+”.
Tabela 7. Item G - detecção da atividade de PFO em alimentos frescos
	Amostra
	Atividade de PFO
	Batata
	+
	Maçã
	++
	Banana
	+++
	Abacaxi
	-
 
Pode-se verificar que a atividade de PFO foi mais intensa na banana e nula no abacaxi.
Os métodos de controle de escurecimento enzimático de frutas e vegetais são:
Ação do calor - Consiste na exposição, por curto período de tempo, do tecido à temperatura de 70 a 90o C.
Um dos métodos mais comumente empregado é o branqueamento, que tem como objetivo a inativação enzimática e é utilizado em pré-tratamentos de frutas e vegetais para enlatamento, congelamento e desidratação. O branqueamento é uma das operações do processamento de: alimento infantil à base de maçã e banana, antepasto de berinjela, batata pré-frita congelada, catchup, cogumelo em conserva, ervilha congelada, laranja cristalizada, milho em conserva e seleta de legumes
O calor, contudo, pode trazer alguns problemas, como cozimento, mudança desfavoráveis na textura e desenvolvimento de flavor desagradável.
Exclusão ou remoção dos substratos:
 O2: Atmosfera controlada e embalagens adequadas (à vácuo, impermeáveis, troca pelo N2);
Fenóis: adição de ciclodextrinas em sucos;
Uso de complexantes (EDTA, ácido cítrico ou fosfatos): complexam com o cobre contido no sítio ativo da enzima diminuindo a atividade enzimática
Redução do pH: reduzir o pH ótimo em 1 ou 2 unidades pela adição de ácidos (ácidos empregados de ocorrência natural: cítrico, fosfórico, málico e ascórbico).
As enzimas são inativadas de modo irreversível em pH inferior a 3,0.
Entretanto, nem sempre é possível abaixar tanto o pH do alimento devido ao significante sabor ácido resultante, sendo incompatível com as propriedades sensoriais e tecnológicas do produto final.
Adição de substâncias redutoras: Aplicação de substâncias redutoras, como ácido ascórbico, sulfito e tióis, previnem o escurecimento, pela redução da o-benzoquinona de volta para a forma o-diidróxifenol, ou pela inativação da PPO.
5. CONCLUSÃO
Pode-se concluir que a inativação térmica da PFO através de tratamento térmico em água em ebulição por 5 minutos não foi eficiente. 
O pH ótimo para a atividade da polifenoloxidase de diferentes fontes se situa entre pH 5,0 e 7,0. Esses ótimos de pH variam também com métodos de extração, pureza da enzima, substratos e soluções tampão utilizadas (SILVA, 2009). Portanto o resultado está coerente com a literatura, pois o pH ótimo observado foi de 5,0.
Além disso, pode-se notar que o ácido ascórbico e o bissulfito de sódio inibem a PFO da batata dependendo da concentração. 
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
FENNEMA, O. W. E. N. Química de los alimentos. Acribia. Zaragoza, España, p. 433-469, 2000.
BRASIL, ANVISA. Resolução RDC n º 36, de 25 de julho de 2013. Institui ações para a segurança do paciente em serviços de saúde e dá outras providências. Disponível em: http://bvsms. saude. gov. br/bvs/saudelegis/anvisa/2013/rdc0036_25_07_2013. html, v. 1, 2014.	
BELITZ, H. D.; GROSCH, W. Química de los alimentos. 2. ed. Zaragoza: Acríbia, p. 119- 120, 1997.SILVA, Vânia Maria Barboza da et al. Características de composição química e atividades da Peroxidase e da Polifenoloxidase dos cultivares de abacaxi MD-2 e Pérola. 2012. Disponível em: <http://tede.biblioteca.ufpb.br:8080/bitstream/tede/4053/1/arquivototal.pdf>. Acesso em 01 out 2016
GALEAZZI, M.A. Comportamento das polifenoloxidases em alimentos. Arch. latinoam. nutr, v.34, n.2, p. 269-89, 1984. 						
VAROUQUAUX, P.; WILEY, R.C. Cambios biológicos e bioquímicos en frutas y hortalizas refrigeradas mínimamente procesadas. In: WILEY, R.C. Frutas y hortalizas mínimamente procesadas y refrigeradas. Zaragoza: Abribia, 1997. P. 221-262.
SANTOS, I.R. C. Escurecimento Enzimático em Frutos: Polifenoloxidase de Atemóia. 2009. Dissertação (Mestrado)- Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Disponível em: <http://www2.fcfar.unesp.br/Home/Pos-graduacao/AlimentoseNutricao/IzabellaChavesME.pdf>. Acesso em 01 out 2016