Relatório 10 bioquímica

Prévia do material em texto

Faculdade de Engenharia de Alimentos
Unicamp- Universidade Estadual de Campinas
Relatório 10
 Enzimas proteolíticas vegetais
 
Caroline Mantovani Celegatti, 155008
Gabriella Stein Durazzo Monteiro dos Santos, 155526
Isabella Peressinoto Romero, 155808
Prof. Hélia Sato
TA 610 Transformações Bioquímicas em Alimentos
Turma B - Grupo 2
2º Semestre 2016
Campinas, 26 de outubro de 2016
1. INTRODUÇÃO
As proteínas são polímeros que compreendem uma seqüência de dezenas ou centenas de resíduos de aminoácidos (monômeros) ligados por meio de ligações peptídicas. Dentre as diferentes funções das proteínas no organismo, destaca-se a sua atividade como enzimas ou catalisadores biológicos. Algumas enzimas são capazes de quebrar ligações peptídicas de cadeias protéicas, sendo denominadas assim de proteases. (LIMA et al, 2008). 
As enzimas proteolíticas ou proteases catalisam a quebra das ligações peptídicas em proteínas, sendo classificadas como enzimas da classe 3, as hidrolases, e subclasse 3.4, as peptídeo-hidrolases ou peptidases. Estas enzimas constituem uma grande família, dividida em endopeptidases ou proteinases e exopetidases, de acordo com a posição da ligação peptídica a ser clivada na cadeia peptídica (CARVALHO, 2008). 
Em vegetais, as enzimas proteolíticas estão envolvidas nos processos de amadurecimento, de germinação, de diferenciação e morfogênese, de morte celular, de resposta de defesa de plantas a processos de estresse oxidativo, entre outros. Algumas enzimas envolvidas no amadurecimento de frutos, como a ficina (figo), a papaína (mamão) e a bromelina (abacaxi), podem ser extraídas em grandes quantidades e representam por isso uma significativa importância econômica (LIMA et al, 2008). 
A bromelina é encontrada no caule, folhas, raízes e no fruto do abacaxi (A. comosus) e em todas as espécies da família Bromeliaceae. A bromelina tem diversos usos, todos baseados em sua atividade proteolítica (FRANÇA-SANTOS et al, 2009). A sua importância econômica está relacionada com a produção de fármacos e a sua utilização na indústria alimentícia (na clarificação de cervejas, na fabricação de queijos, no amaciamento de carnes, no preparo de alimentos infantis e dietéticos, entre outros), no tratamento de distúrbios, digestivos, feridas e inflamações, preparo de colágenos hidrolisados, nas indústrias têxteis, para amaciamento de fibras e também na produção de detergentes (DRAETTA & GIACOMELLI, 1993). 
A papaína é uma enzima proteolítica presente no mamão verde(Carica papaya), de alto valor comercial, sendo extraída do látex dos frutos do mamoeiro e é usada na indústria alimentícia e laboratórios de pesquisa (MONTI, 2004; ALVES, 2015). Essa enzima é muito utilizada na indústria como principal ingrediente de amaciantes de carnes [1].
Vantagens e Desvantagens
As enzimas proteolíticas possuem diversas vantagens, entre elas: a especificidade única, o que evita reações paralelas mantendo as características do produto; a digestão ocorre em condições amenas de pH e temperatura; apresentam alta atividade; a taxa de hidrólise pode ser controlado por aquecimento e a não destruição dos aminoácidos mantendo o valor nutricional da proteína (8).
Por outro lado, algumas das desvantagens são evidenciadas como, por exemplo: as proteases em sua maioria não são estáveis as condições apresentadas em sistemas de alimentos, como pH, temperatura e concetração de substrato. Outro fator negativo é a difícil reutilização das proteases após seu uso (8).
Atividade de Proteases Vegetais
Segundo Baldini et. al. (1993), as proteases vegetais são enzimas sulfídricas e como característica das enzimas pertencentes a esse grupo, requer grupamentos sulfídricos livres para sua atividade catalítica. Agentes redutores como a cisteína, sulfetos, sulfitos e também cianetos atuam como ativadores da ação enzimática de acordo com diversos autores citados em seu trabalho (10).
Bromelina
A bromelina é encontrada no caule, folhas e frutos do abacaxizeiro. As enzimas proteolíticas encontradas nos talos recebem o nome de bromelina do talo, enquanto as encontradas no fruto são chamadas de bromelina do fruto. A bromelina é uma glicoproteína, tendo um resíduo oligosacarídeo por molécula, que está covalentemente ligado à cadeia peptídica. A bromelina do talo é uma enzima sulfidrílica e este grupamento é essencial para a sua atividade proteolítica. A bromelina do fruto é uma proteína ácida e seu ponto isoelétrico foi determinado por focalização isoelétrica como pH 4,6, com mudanças conformacionais irreversíveis em valores de pH maiores que 10,3. Não se aconselha a utilização da bromelina do fruto, pois, estes devem se destinar para a industria e consumo “in natura” (13).
Papaína
A papaína é uma mistura complexa de enzimas proteolíticas e peroxidases existentes no látex do mamão papaia verde. Esta é reconhecida pela sua eficácia na aceleração do processo cicatricial de feridas, de diversas etiologias e notadamente nas feridas crônicas são mais utilizadas, favorecendo o processo cicatricial por meio da estimulação da angiogênese, promove a manutenção do meio úmido, ambiente favorável à cicatrização das feridas. Também é reconhecida pela sua eficácia como agente desbridante, anti-inflamatório e bactericida no tratamento de lesões da pele não agredindo tecidos sadios (14).
Ficina
A ficina é contida no látex, exsudado que resulta de incisões feitas nas cascas de figueiras tropicais como Ficus glabrata, Ficus carica e outras espécies (15).
(3) PERSSON, J., JOHANSSON, H-O., TJERNELD, F. Thermoseparating water/polymer system: a novel one-polymer aqueous two-phase system for protein purification. 11th International Conference on Partitioning in Aqueous Two-phase Systems, Gulf Shores, Alabama, USA, June 27-july 2, 1999.
(4) BOLAND M. J.; HESSELINK P. G. M.; PAPAMICHAEL, N.; HUSTEDT, H. Extractive purification of enzymes from animal using aqueous two-phase systems: Pilot scale studies. Journal of Biotechnology, v. 19, p. 19-34, 1991.
(5) TJERNELD, F., BERNER, S., CAJARVILLE, A. E., JOHANSSON, G. New aqueous two-phase system based on hydroxypropil starch useful in enzyme purification. Enzyme Microbiology Technology, v. 8, p. 417- 423, 1986.
(6) STURESSON, S.; TJERNELD, F.; JOHANSSON, G. Partition of macromolecules and cell particles in aqueous two-phase systems based on hydroxypropil starch and poly(ethylene glycol), Applied Biochemistry and Biotechnology, v.3, p. 281-295, 1990.
(7) Disponível em: <http://www.enq.ufsc.br/eventos/sinaferm/trabalhos_completos/t297.doc>.
Acesso em: 09 nov. 2010.
(8) ARASAKI L. H., Otimização do processo de obtenção de hidrolisado protéico de carne escura de atum (Katsuwonus pelamis), 2000. Tese de Mestrado – Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2000.
(9) Disponível em: Disponível em: <http://libdigi.unicamp.br/document/?view=vtls000381898>.
Acesso em: 09 nov. 2010.
(10) Baldini, V.L.S.; Iaderoza, M.; Ferreira, E.A.H; Sales, A.M.; Draetta, I.S.; Giacomelli, E.J. Ocorrência da Bromelina e cultivares do abacaxizeiro. Colet. ITAL, v. 23, n. 1p. 44-55, Campinas, 1993.
(11) REED, G., Enzymes in Food Processing , 4. ed. Londres: Academic Press, 1966.
(12) Disponível em: <http://www.unimep.br/phpg/editora/revistaspdf/rct19art09.pdf>.
Acesso em: 09 nov. 2010.
(13) ORTEGA, F.D; GASSET, D. L.; KANT, F. M. Fruit Enzymes and all the processes envolving them. All about the fruit enzymes, v. 13, n. 23, p. 45 52, 2002.
(14) Disponível em: <http://www.bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/57cbe/resumos/1810.htm>.
Acesso em: 09 nov. 2010.
(15) Disponível em: <http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/lista_exerc/enzimas_aspectos_gerais.pdf>.
Acesso em: 09 nov. 2010.
De outro relatorio:
A aplicação de enzimas na indústria de alimentos possui muitas vantagens. As enzimas possuem alta velocidade de ação, não apresentam toxicidade, são requeridas em baixas concentrações, possuem especificidade para diferentes substratos eatuam em faixas largas de temperatura e pH, preservando grande parte das propriedades originais da matriz alimentícia e consumindo pouca energia no processo (COELHO et al, 2008).
Com a hidrólise de proteínas, pode-se modificar propriedades físicas, químicas, biológicas e imunológicas das proteínas, incrementando características nutricionais dos produtos finais, bem como a vida de prateleira, solubilidade, textura, capacidade de formação de espuma, coagulação, emulsificação e ainda pode remover aromas e sabores indesejáveis e fatores antinutricionais (THYS, 2004)
A extração de enzimas é um processo muito importante na área da saúde e na indústria alimentícia. Entre as enzimas mais utilizadas, as proteases são um grupo muito importante devido ao grande volume de vendas mundiais, na ordem de 60% do mercado global. Neste cenário, o Brasil é um grande importador das enzimas proteolíticas (OLIVEIRA, 2001).
Entre as enzimas mais aplicadas no amolecimento de carnes encontra-se a papaína. Esta enzima proteolítica também é largamente utilizada no tratamento de cerveja afim de se evitar o aparecimento de precipitados, referentes aos complexos proteínas-taninos formados durante a fermentação. A papaína é extraída do látex do mamoeiro Carica papaya (GAVA et al, 2008).
Outras duas importantes enzimas proteolíticas de utilização em alimentos são a ficina e a bromelina. A ficina integra um grupo de enzimas que são obtidas a partir da seiva da figueira. Já a bromelina é uma enzima que se extrai da planta do abacaxi, inclusive de partes desprezadas pela agroindústria, como folhas, coroa, caula e cascas; e compreende aplicações semelhantes às da papaína (GAVA et al, 2008).
Enzimas proteolíticas também são utilizadas no processamento de pães, sendo adicionadas nas farinhas de trigo de alto teor protéico, para diminuir o tempo de mistura e obtenção de massas mais maleáveis. Deste modo, a massa tem extensibilidade aumentada e também retém maior quantidade de gás. Em biscoitos, a protease também ajusta farinhas para seu processamento, sendo usada com sucesso em crackers e waffles. Na indústria de óleos vegetais, proteases são usadas na refinação de óleos e gorduras (OLIVEIRA, 2001). 
ARAÚJO, W. M. C., MONTEBELLO, N. P., BOTELHO, R. B. A., BORGO, L. A. Alquimia dos Alimentos: série alimentos e bebidas. Brasília: Editora Senac, 2007. Vol. 2, 560 p.
CESAR, A. C. W. Análise de viabilidade econômica de um processo de extração e purificação da bromelina do abacaxi. 2005. Tese (Doutorado em Engenharia Química) - Faculdade de Engenharia Química, Universidade Estadual de Campinas, 2005.
COELHO, M.A.Z.; SALGADO, A.M.; RIBEIRO, B.D. – Tecnologia enzimática. 1ª Ed., Editora EPUB, Petrópolis, 2008.
GAVA, A.J.; SILVA, C.A.B.; FRIAS, J.R.G. – Tecnologia de Alimentos: princípios e aplicações. Nobel, São Paulo, 2008.
OLIVEIRA, L.F.; Os avanços do uso da bromelina na área de alimentação e saúde. Alim. Nutr., São Paulo, 12: 215-226, 2001
RABELO, A. P. B. Estudo e desenvolvimento de uma micro-coluna de campânulas pulsantes para purificação de proteínas. Campinas, 1999, 188p. Tese de Doutorado, Universidade Estadual de Campinas, 1999.
THYS, R.C.S. – Produção, caracterização, purificação e aplicação de uma protease produzida pelo microrganismo Microbacterium SP. Kr10. Engenharia de Alimentos, UFRGS, Porto Alegre, 2004.
WHITEHURST, R. J., OORT, M. V. Enzymes in Food Technology. 2ª ed. Cingapura: Blackwell Publishing Ltd, 2010. 384p.
 
2. OBJETIVO
O objetivo desta aula prática é a determinação qualitativa e quantitativa de protease dos extratos enzimáticos obtidos de mamão verde, mamão maduro, abacaxi verde, abacaxi maduro e figo.
3. MATERIAL E MÉTODOS 	 
I - Obtivemos o extrato enzimático de proteases vegetais, já preparado pelos técnicos do laboratório
II - Teste qualitativo de atividade proteolítica
 
III - Foi determinação quantitativa da atividade da protease: no grupo 2 não houve diluição para testar a atividade de protease em extratos enzimáticos, após foi feito a reação colorimétrica
IV- Foi observado o efeito da bromelina de abacaxi na hidrólise de gelatina 
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
ITEM II - Teste qualitativo de atividade proteolítica
Através das observações realizadas em laboratório para esse teste, pôde ser feita a Tabela 1 com os devidos resultados.
Tabela 1. Teste qualitativo de atividade proteolítica
	 Tubo
	Amostra
	Resultado
	I A
	extrato enzimático de polpa de abacaxi verde
	hidrolização
	I B
	extrato enzimático de polpa de abacaxi maduro
	 hidrolização
	I C
	extrato enzimático de polpa de mamão verde
	 hidrolização
	I D
	extrato enzimático de polpa de mamão maduro
	 hidrolização
	I E
	extrato enzimático de polpa de figo verde
	 hidrolização
	I-Branco
	Água destilada
	gelatinização
Por uma observação mais aprofundada da Tabela 1, pode-se verificar que ocorreu a hidrólise da gelatina em todas as polpas de frutas. Esse resultado se mostra compatível com a literatura (REED, 1966), visto que era esperado que ocorresse a hidrólise da gelatina em todas as polpas, enquanto o tubo “branco”, apenas com água destilada, permanecesse sem o processo de hidrolização, resultando em um processo de gelatinização.
A justificação dessa observação é baseada no fundamento que as proteínas da gelatina foram hidrolizadas pela ação das enzimas dos extratos vegetais. Além disso, foi verificado que a solução ficou mais líquida nas amostras de frutos verdes, evidenciando uma maior atividade hidrolítica. Esse fato ocorre devido a maior presença de enzimas proteolíticas no fruto verde. Essas enzimas serão responsáveis pelo amolecimento e formação de açúcares redutores responsáveis pelo sabor doce do fruto durante o amadurecimento (REED, 1966).
ITEM III - Determinação quantitativa da atividade da protease
Pelos resultados medidos em laboratório no espectrofotômetro, pôde ser montada a Tabela 2 com as absorbâncias correspondentes às amostras analisadas. Os cálculos estão expressos a seguir.
Tabela 2. Determinação quantitativa da atividade da protease
	Tubo
	Amostra
	Diluição
	Abs (660 nm)
	mg de protease/100 mg de amostra
	IIA
	Extrato enzimático de polpa de abacaxi verde
	-
	0,520
	37,86
	IIB
	Extrato enzimático de polpa de abacaxi maduro
	-
	0,658
	47,71
	IIC
	Extrato enzimático de polpa de mamão verde
	-
	0,177
	13,36
	IID
	Extrato enzimático de polpa de mamão maduro
	-
	0,210
	15,72
	IIE
	Extrato enzimático de polpa de figo verde
	-
	0,179
	13,50
 Tabela 3. Curva Padrão de Papaína
	Papaína (mg/mL)
	Abs (660 nm)
	0,1
	0,27
	0,15
	0,41
	0,20
	0,55
	0,25
	0,69
Figura 1. Curva Padrão de Papaína
A partir da Tabela 3, pode ser feita a curva padrão da papaína, mostrada na Figura 1 e com os dados da Tabela 2 e da equação obtida na Figura 1 (y = 0,3571x + 0,0036), pode ser calculada a Atividade de protease do extrato enzimático desejada.
Para a amostra de extrato enzimático de polpa de abacaxi verde:
Incialmente, pode-se calcular a concentração de papaína (mg/mL) do tubo IIA pela equação da curva padrão de papaína:
Dados:
y = 0,3571x + 0,0036 
AbsIIA = 0,520
Logo, por substituição tem-se que:
y = 0,3571 . 0,520 + 0,0036
-> y = 0,1893 mg de papaína / mL de extrato enzimático
Como foram utilizadas 100g de amostra de extrato enzimático homogeneizadas com 200 mL de tampão fosfato 0,1M pH 6,0 em liquidificador, irá ser considerado o volume de 200 mL, sendo que o resultado final pode ser expresso em mg de protease / 100g de amostra.
Então, tem-se que:
 	0,1893 -------- 1 mL
 x --------- 200 mL
-> x = 37,86 mg de papaína / 100g de amostra
Os cálculos para as outras concentrações foram realizados de maneira análoga, sendo que os resultados correspondentes estão apresentados a seguir na Tabela 2.
Pela análise dos valores de atividade de protease, pode-se concluir que a polpa de abacaxi maduro foi a que demonstrou maior atividade, seguida pela polpa de abacaxi verde. Em relação às menoresatividades, pode-se citar que a polpa de mamão verde foi a que apresentou menor valor de atividade, seguida pela polpa de figo verde. Além disso, pode-se verificar que a polpa de mamão maduro apresentou uma atividade física de protease intermediária.
É válido ressaltar também que somente pelo experimento foi possível estabelecer uma correlação entre o estado de maturidade da fruta e sua atividade de protease, visto que a polpa de abacaxi verde apresentou menor atividade de protease que a polpa de abacaxi maduro, e a polpa de mamão verde apresentou uma atividade de protease inferior à polpa de mamão maduro. Entretanto a diferença entre os frutos maduros e verdes foi mais acentuada no abacaxi. Esse fato pode ser justificado por uma diferença específica entre os tipos de proteases: papaína, bromelina e ficina.
Se um fruto não apresenta quantidades significativas das enzimas, no estágio inicial do desenvolvimento do fruto, a concentração enzimática chega ao máximo, podendo apresentar um decréscimo significativo quando atinge a maturação (CESAR, 2005).
O abacaxi é o único fruto que mantém elevadas concentrações enzimáticas mesmo após o amadurecimento. No figo e mamão, a ficina e papaína somente podem ser encontradas nos frutos verdes, com o amadurecimento completo a concentração enzimática é mínima (CESAR, 2005).
A papaína é uma protease vegetal extraída do mamão estável a altas temperaturas e pH neutro, mas desnatura em pH menor que 4. Ela tem uma especificidade bastante ampla em relação ao substrato (WHITEHURST, 2010). Assim como a papaína, a bromelina também apresenta uma especificidade ampla em relação ao substrato, entretanto é obtida através do abacaxi (CESAR, 2005; RABELO, 1999). Por fim, a ficina é uma protease vegetal extraída do látex do figo (WHITEHURST, 2010).
ITEM IV - Efeito da bromelina de abacaxi na hidrólise de gelatina 
Tabela 4. Efeito da bromelina de abacaxi na hidrólise de gelatina
	 
	 Preparação das amostras
	Resultado
	Béquer 1 (controle)
	200 mL de solução de gelatina + 1 fatia de abacaxi cozido em água durante 10 minutos. Incubar a 7-8ºC por 4 horas.
	Gelatinização 
	Béquer 2 (teste)
	200 mL de solução de gelatina + 1 fatia de abacaxi in natura. Incubar a 7-8ºC em geladeira por 4 horas.
	Hidrólise 
Pode-se observar, através dos resultados do teste acima, que a bromelina foi inativada pelo cozimento em água por 10 minutos, já que a utilização de abacaxi cozido não promoveu a hidrólise da gelatina. Porém, temperaturas baixas, entre 7-8ºC, não inativam a enzima, uma vez que a utilização de abacaxi in natura incubado a essa temperatura por 4 horas promoveu a hidrólise da gelatina, ou seja, a fruta apresentou atividade de bromelina.
5. CONCLUSÃO
A partir dos resultados e da análise da literatura, pode-se verificar a influência do estádio de maturação dos frutos na concentração de proteases e suas características. Com isso, pode-se otimizar a extração de proteases a partir dos frutos e uma possível aplicação na indústria de alimentos, uma vez que o conhecimento do comportamento das enzimas proteolíticas pode contribuir para um aperfeiçoamento dos processos industriais.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
LIMA, S.L.T.; JESUS, M.B.; SOUSA, R.R.R.; OKAMATO, A.K.; LIMA, R.; FRACETO, L.F. Estudo da Atividade Proteolítica de Enzimas presentes em frutos. Química Nova na Escola, n. 28. 2008. Disponível em: < http://qnesc.sbq.org.br/online/qnesc28/11-EEQ-6906.pdf> Acesso em: 21 de outubro de 2016
CARVALHO, H.A.S. Análise bioquímica e molecular de proteases na interação Theobrama cacao- Moniliophthora perniciosa. Dissertação (Mestrado), Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus-BA, 2008. Disponível em: <http://www.biblioteca.uesc.br/biblioteca/bdtd/200560003D.pdf> Acesso em: 21 de outubro de 2016
CESAR, Ana Claudia Wabiszczewicz. Análise de viabilidade econômica de um processo de extração e purificação da bromelina do abacaxi, 2005.
FRANÇA-SANTOS, A. et al. Estudos bioquímicos da enzima bromelina do Ananas comosus (abacaxi). Scientia Plena, v. 5, n. 11, p. 1-6, 2009. Disponível em: <https://www.researchgate.net/profile/Nadjma_Souza_Leite/publication/277069650_Estudos_bioquimicos_da_enzima_bromelina_do_Ananas_comosus_abacaxi/links/55d3a08908ae0b8f3ef93135.pdf> Acesso em: 21 de outubro de 2016
DRAETTA, I.S.; GIACOMELLI, E.J. Ocorrência da bromelina e cultivares de abacaxizeiro. Colet. ITAL, v.23, n.1, p.44-55, Campinas, 1993. 
MONTI, R.; CONTIERO, J.; GOULART, A.J.. Isolation of natural inhibitors of papain obtained from Carica Papaya latex. Brazilian Archives of Biology and Technology. Vol. 47, n5, pp. 747-754, 2004.
RABELO, A. P. B. Estudo e desenvolvimento de uma micro-coluna de campânulas pulsantes para purificação de proteínas. Campinas, 1999, 188p. Tese de Doutorado, Universidade Estadual de Campinas, 1999.
ALVES, Gisele Kirchner. Uso de papaína e bromelina para obtenção de hidrolisados proteícos de fígado suíno. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos, Florianópolis, 2015. Disponível em: <https://repositorio.ufsc.br/handle/123456789/136000> Acesso em: 21 de outubro de 2016
[1]http://www.beefpoint.com.br/radares-tecnicos/qualidade-da-carne/enzimas-proteoliticas-de-plantas-usadas-no-amaciamento-da-carne-bromelina-ficina-e-papaina-4977/ 
WHITEHURST, R. J., OORT, M. V. Enzymes in Food Technology. 2ª ed. Cingapura: Blackwell Publishing Ltd, 2010. 384p.
REED, G., Enzymes in Food Processing , 4. ed. Londres: Academic Press, 1966.