Relatório 11

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Faculdade de Engenharia de Alimentos
Unicamp- Universidade Estadual de Campinas
Relatório 11
Aplicação de Renina Microbiana
 
Caroline Mantovani Celegatti, 155008
Gabriella Stein Durazzo Monteiro dos Santos, 155526
Isabella Peressinoto Romero, 155808
Prof. Hélia Sato
TA 610 Transformações Bioquímicas em Alimentos
Turma B - Grupo 2
2º Semestre 2016
Campinas, 22 de novembro de 2016
Introdução
A caseína do leite pode ser coagulada por dois métodos distintos: ácido ou enzimático, porém, na maioria dos tipos de queijo, são utilizadas enzimas proteolíticas para obtenção do coágulo (SPREER, 1975; REED, 1993). Estas enzimas proteolíticas são industrialmente nomeadas reninas e podem ser de diferentes origens: animal, vegetal ou microbiana (SCRIBAN, 1985)
Tradicionalmente, utiliza-se renina proveniente do quarto estômago (abomaso) de bezerros em lactação. Estes animais são abatidos e, com o seu abomaso, é obtido um extrato de enzimas proteolíticas, denominado coalho (REED, 1993; SCRIBAN, 1985; SPREER, 1975). 
Vários microrganismos foram testados na tentativa de obtenção de uma enzima com qualidades aceitáveis para a fabricação de queijo, tais como: Endothia parasitica, Mucor pussilus, Cryptococcus albidus, Bacillus cereus e Mucor miehei (FOX, 1991; ROSE, 1980; BAYLEY e OLLIS, 1986). Dentre estes, descobriu-se que os zigomicetos Mucor miehei e Mucor pussilus produziam uma enzima coagulante com características muito similares ao coalho bovino comercial por produzir altas taxas de coagulação aliada a altas taxas de produção (ROSE, 1980; AUNSTRUP, 1976; REED, 1993; BAILEY e SIIKA-AHO, 1988).
Entre os coalhos microbianos o de E. parasitica é o que exibe atividades proteolíticas mais altas sobre α- e b- caseínas e menor atividade proteolítica sobre k-caseína, mas, geralmente, causa um sabor amargo no queijo (REED, 1993). Embora a especificidade proteolítica destas enzimas seja diferente do coalho tradicional, geralmente produzem queijos com boa qualidade e são intensamente utilizados nos Estados Unidos.
A protease de Mucor pusillus var. Lindt, a qual não possui carboidratos em sua cadeia, alcançou resultados satisfatórios como coalho alternativo na produção de uma grande variedade de queijos, mas não foram todas as cepas da var. Lindt que produziram queijos de qualidade aceitável. Esta enzima é mais sensível a mudanças de pH na faixa entre 6,4 e 6,8 do que o coalho bovino (REED, 1993).
Enzimas extracelulares de Mucor miehei, Mucor pusillus e Endothia parasitica tem sido aceitas para aplicação na indústria devido à alta taxa de coagulação do leite e baixa atividade proteolítica (LASURE, 1980; BAILEY e SIIKA-AHO,1988; THAKUR et al., 1990; ESCOBAR e BARNETT, 1993). Um outro aspecto do coalho proveniente do zigomiceto Mucor miehei é sua alta termoestabilidade e esta enzima permanece ativa no soro e fica concentrada nos produtos provenientes do mesmo, causando problemas quando tais produtos, contendo coalho microbiano residual, entram em contato com caseína, como subprodutos provenientes do soro ou queijos que necessitam do processo de maturação. Consequentemente, quase todo o coalho utilizado na indústria de queijo é, agora, submetido ao tratamento com peróxido de hidrogênio sob condições controladas, com o intuito de diminuir sua termoestabilidade. Alguma atividade enzimática é perdida, mas a enzima modificada tem estabilidade similar à enzima de origem bovina (REED, 1993).
As proteases industriais são as maiores representantes no mercado internacional das enzimas (FOGARTY, 1990). Durante a década de 90, o coalho microbiano foi utilizado para a manufatura de um terço de todo o queijo produzido no mundo (NEELAKANTAN et al., 1999) e, nos Estados Unidos apenas uma pequena porcentagem de coalho bovino é utilizado para a fabricação de queijos. A maioria dos fabricantes de queijo prefere renina microbiana produzida por fermentação (BURRINGTON, 2001).
 
2. Objetivos
Verificar a ação de diferentes enzimas proteolíticas sobre a caseína do leite e estudar o efeito da concentração de enzima, concentração de cálcio e da temperatura na coagulação do leite pela renina microbiana.
3.Materiais e Métodos
· Coalho comercial diluído. 2:50 
· Renina microbiana solução 10 mg/mL 
· Renina microbiana solução 16 mg/mL 
· Papaína solução 2 mg/mL 
· Pepsina solução 10 mg/mL 
· Bromelina solução 10 mg/mL 
· Leite em pó desnatado 10% (p/v) 
· CaCl2 0,5% 
I - Verificar a ação de diferentes enzimas proteolíticas sobre a caseína do leite.
II - Efeito da concentração de renina microbiana na coagulação do leite.
III- Efeito da adição de abacaxi e mamão fresco em leite. 
VI - Provar queijo frescal e verificar se apresenta gosto amargo, logo em seguida provar abacaxi fresco e verificar se sentiu sabor amargo.
4. Resultados e Discussão
ITEM I - Verificar a ação de diferentes enzimas proteolíticas sobre a caseína do leite
A Tabela 1 a seguir mostra a ação de diferentes enzimas proteolíticas sobre a caseína do leite.
Tabela 1. Ação de diferentes enzimas proteolíticas sobre a caseína do leite
	 Tubo
 
	 Protease
 
	5 min.
	10 min.
	30 min.
	1 hora
	1 hora
	
	
	coagulado (sim ou não)
	coagulado (sim ou não)
	coagulado (sim ou não)
	coagulado ou parcialmente hidrolisado
	sabor de leite ou sabor amargo
	IA
	Coalho comercial diluído (2:50)
	 Sim
	 Sim
	 Sim
	coagulado
 
	 leite
	IB
	Renina microbiana sol. 10 mg/mL
	 Sim
	 Sim
	 Sim
	coagulado 
	 leite
	IC
	Papaína sol. 2 mg/mL
	 Sim
	 Sim
	 Sim
	hidrolisado
	 amargo
	ID
	Pepsina sol. 10 mg/mL
	 Sim
	 Sim
	 Sim
	pouco hidrolisado 
	 leite
	IE
	Bromelina sol. 10 mg/mL
	 Sim
	 Sim
	 Sim
	 hidrolisado
	 amargo
	Controle 
	-
	 Não
	 Não
	 Não
	hidrolisado 
	 leite
Pode-se observar que todas as enzimas testadas foram capazes de promover a coagulação do leite em apenas 5 minutos após sua adição à amostra. Nota-se também que, após 1 hora, o coalho comercial e a renina microbiana foram capazes de manter a coagulação do leite completamente, enquanto a pepsina foi capaz de manter apenas parcialmente. A papaína e a bromelina não mantiveram a coagulação do leite, observando assim a hidrólise. Como no controle não foram adicionadas enzimas, ele não foi coagulado em nenhum momento. Foi observado também que apenas nas amostras com adição de papaína e bromelina foi sentido o sabor amargo.
De acordo com a empresa Bela Vista, produtora de coalho, o produto comercial é uma mistura de pepsina e renina, em proporções variadas. Dependendo de sua origem, as composições enzimáticas são diferenciadas, tanto em quantidade quanto em qualidade (NEELAKANTAN et al., 1999).
ITEM II - Efeito da concentração de renina microbiana na coagulação do leite
A Tabela 2 a seguir apresenta os resultados dos grupos 1 a 5 para a renina em diferentes concentrações.
Tabela 2. Resultados dos grupos para renina em diferentes concentrações
	
Tubo
	
Renina microbiana
	Tempo de coagulação (seg.)
	
	
	Grupo 1 
	Grupo 2
	Grupo 3
	Grupo 4
	Grupo 5
	E1
	16mg/mL
	10
	10
	140
	190
	40
	E2
	14mg/mL
	15
	13
	170
	174
	51
	E3
	12mg/mL
	20
	15
	233
	134
	60
	E4
	10mg/mL
	27
	20
	800
	200
	75
	Controle
	-
	-
	-
	-
	-
	-
As unidades de atividade da renina em diferentes situações podem ser medidas através da seguinte fórmula: (Unidades de atividade)/mL = 1/tempo (s). Os resultados dos cálculos estão mostrados na Tabela 3.
Tabela 3. Efeito da concentração de renina na coagulação do leite
	Tubo
	Renina microbiana
	Unidades de atividade/mL
	
	
	Grupo 1
	Grupo 2
	Grupo 3
	Grupo 4
	Grupo 5
	E1
	16 mg/mL
	0,1
	0,1 
	0,007
	0,0053
	0,025
	E2
	14 mg/mL
	0,067
	0,077 
	0,0058
	0,0057
	0,02
	E3
	12 mg/mL
	0,05
	0,067 
	0,0043
	0,0075
	0,017
	E4
	10 mg/mL
	0,037
	0,05 
	0,00125
	0,005
	0,013
	Controle
	-
	-
	- 
	-
	-
	-Figura 1. Gráfico do efeito da concentração de renina na coagulação do leite
Pela Figura 1, pode-se observar grandes diferenças entre os resultados dos grupos, tal fato pode ter ocorrido devido a erros experimentais. Apesar das diferenças entre os grupos, pode-se observar que as unidades de atividade diminuem conforme a concentração de renina diminui. Foi observado também que os tubos controle não apresentaram unidade de atividade, uma vez que não possuíam renina adicionada.
Em algum ponto das curvas, a relação pode deixar de ser linear, devido a uma possível inibição da enzima pelo produto da reação. Porém, este ponto não foi alcançado e nem se pode afirmar que ele exista. Trata-se do mecanismo de inibição por feedback, no qual a enzima, catalisando uma reação, é temporariamente inativada quando a concentração do produto final alcança determinado nível. Essa inibição exerce um controle sensível e imediato sobre a atividade anabólica de uma célula (KARP, 2002).
ITEM III - Efeito da concentração de cálcio na coagulação do leite
		A Tabela 4 a seguir mostra os resultados dos grupos de 6 a 10 para o cálcio em diferentes concentrações. Os resultados do grupo 6 não foram disponibilizados.
Tabela 4. Resultados dos grupos para cálcio em diferentes concentrações
	
Concentração de CaCl2
	Tempo de coagulação (seg.)
	
	Grupo 6
	Grupo 7
	Grupo 8
	Grupo 9
	Grupo 10
	1%
	-
	24
	125
	120
	270
	0,75%
	-
	40
	210
	150
	540
	0,5%
	-
	92
	274
	180
	559
	0,25%
	-
	367
	311
	300
	480
	0,15%
	-
	550
	579
	360
	499
	Controle
	-
	-
	-
	-
	-
As unidades de atividade de CaCl2 em diferentes situações podem ser medidas através da seguinte fórmula: (Unidades de atividade)/mL = 1/tempo (s). Os resultados dos cálculos estão mostrados na Tabela 5.
Tabela 5. Efeito da concentração de cálcio na coagulação do leite
	Concentração CaCl2
	
Unidades de atividade/mL
	
	Grupo 6
	Grupo 7
	Grupo 8
	Grupo 9
	Grupo 10
	1%
	-
	0,042
	0,008
	0,0083
	0,0037
	0,75%
	-
	0,025
	0,0048
	0,0067
	0,00185
	0,5%
	-
	0,011
	0,0036
	0,0055
	0,0018
	0,25%
	-
	0,0027
	0,0032
	0,0033
	0,002
	0,15%
	-
	0,0018
	0,0017
	0,0028
	0,002
	Controle
	-
	- 
	-
	-
	-
Figura 2. Efeito da concentração de cálcio na coagulação do leite
A partir da Figura 2, pode-se observar que houve diferenças entre os resultados dos grupos, o que pode ter acontecido devido a erros experimentais. Apesar das diferenças, pode-se notar que a medida que a concentração de CaCl2 diminui, as unidades de atividade também diminuem. Pode-se perceber também que, por não ter sido adicionado CaCl2 no tubo controle, este não apresentou unidades de atividade.
A formação do coágulo se dá pela súbita remoção do macropeptídeo hidrofílico e pelo conseqüente desbalanceamento das forças inter-moleculares. Começam a ocorrer ligações entre os sítios hidrofóbicos e estas são reforçadas por ligações de cálcio, formando r-caseinato de cálcio. Além disso, o cálcio, junto com o fósforo, fica retido no interior do coágulo, conferindo rigidez, impermeabilidade e coesão a ele. Na indústria, costuma-se adicionar cálcio ao leite que vai ser transformado em queijo, principalmente se este for pasteurizado; isso porque o aquecimento causa precipitação do cálcio iônico e, portanto, diminuição do poder coagulante da enzima (TESSIER et al., 1958).
ITEM IV - Efeito da concentração de cálcio na coagulação do leite
A Tabela 6 a seguir indica os resultados dos grupos 11 a 15 em relação ao efeito da temperatura na coagulação do leite. Os dados do grupo 15 não foram disponibilizados.
Tabela 6. Efeito temperatura na coagulação do leite
	Temperatura (ºC)
	Tempo de coagulação (s)
	
	Grupo 11
	Grupo 12
	Grupo 13
	Grupo 14
	Grupo 15
	30
	360
	780
	600
	570 
	-
	35
	240
	660
	120
	380 
	-
	40
	180
	270
	258
	320 
	-
	50
	150
	420
	330
	200 
	-
	60
	600
	60
	660
	1075 
	-
	70
	840
	0
	150
	1250 
	-
As unidades de atividade em diferentes situações pode ser medida através da seguinte fórmula (Unidades de atividade)/mL = 1/tempo (s). Os resultados dos cálculos estão mostrados na Tabela 7.
Tabela 7. Efeito temperatura na coagulação do leite
	Temperatura
	
Unidades de atividade/mL
	
	Grupo 11
	Grupo 12
	Grupo 13
	Grupo 14
	Grupo 15
	30
	0,0028
	0,0013
	0,0017
	0,00175
	-
	35
	0,0042
	0,0015
	0,0083
	0,0026
	-
	40
	0,0056
	0,0037
	0,0039
	0,0031
	-
	50
	0,0067
	0,0024
	0,003
	0,005
	-
	60
	0,0017
	0,0167
	0,0015
	0,00093
	-
	70
	0,0012
	-
	0,0067
	0,0008
	-
Figura 3. Efeito temperatura na coagulação do leite
A partir da Figura 3, pode-se verificar que houve um pico a 60ºC para o grupo 12 que se diferenciou bastante dos outros grupos. Isso pode ter ocorrido devido a erros experimentais. Para os grupos 11 e 14 é possível dizer que há um aumento da atividade até 50ºC e depois um decaimento da mesma, até uma estabilização entre 60 e 70ºC. Algo parecido pode ser observado para o grupo 13, há um aumento até 35ºC e um decaimento até 60ºC, porém a estabilização não foi observada.
A temperatura em que há uma velocidade máxima é a temperatura ótima de reação. De acordo com THYS, 2004, a temperatura ótima da renina microbiana produzida por Microbacterium sp. está por volta de 50ºC, com atividade sendo verificada entre 45 e 65ºC. Esse dado está coerente com os grupos 11 e 14, entretanto não está condizente com os grupos 12 e 13. 
ITEM V - Efeito da adição de abacaxi e mamão fresco em leite.
A Tabela 8 mostra o aspecto do leite após a ação das proteases de diferentes substâncias.
Tabela 8. Ação das proteases no leite
	Béquer
 
	Amostras
Incubação a 50 OC
	Aspecto do Leite
	1-Teste
	Béquer contendo 50 g de abacaxi fresco picado e 150 mL de leite em pó desnatado 10% (p/v).
	 sem coagulação
	2-Controle
	Béquer contendo 50 g de abacaxi cozido picado e 150 mL de leite em pó desnatado 10% (p/v).
	 sem coagulação
	3-Teste
	Béquer contendo 50 g de mamão fresco picado e 150 mL de leite em pó desnatado 10% (p/v).
	 coagulação
	4 -Controle
	Béquer contendo 50 g de mamão cozido picado e 150 mL de leite em pó desnatado 10% (p/v).
	 sem coagulação
	5-Teste
	Béquer contendo pedaço de 3 cm2 de 4° estômago desidratado de bezerro (abomassum) e 150 mL de leite em pó desnatado 10% (p/v).
	 coagulação
A bromelina é a protease presente no abacaxi (LOPES et al., 2009), enquanto a papaína está presente no mamão (MONTI et al., 2000). Já o abomassum do bezerro contém o agente coagulante convencional utilizado na produção de queijos, que é extraído do quarto estômago de bezerros em lactação (YOUSIF et al., 1996). Foi observada a coagulação apenas nos tubos 3-Teste e 5-Tese. O Tubo 3 possuía mamão fresco e portanto papaína e o Tubo 5 continha o abomassum, ou seja, renina e pepsina. Seria esperado a visualização da coagulação no Tubo 1-Teste também, uma vez que continha abacaxi, ou seja bromelina. Já os tubos 2-Controle e 4-Controle não apresentaram coagulação do leite, já que o cozimento das frutas (abacaxi e mamão) promove a inativação das enzimas nela presentes. A papaína apresenta atividade efetiva em temperaturas entre 10ºC e 90ºC, sendo a temperatura ótima entre 65ºC e 80ºC (WHITEHURST, 2010), enquanto a bromelina apresenta como temperatura ótima um valor entre 50ºC e 60ºC (CESAR, 2005). 
ITEM VI - Provar queijo frescal e verificar se apresenta gosto amargo, logo em seguida provar abacaxi fresco e verificar se sentiu sabor amargo.
Os queijos são preparados pela precipitação da caseína do leite a partir da adição de renina ou outro agente coagulante. Além disso, as enzimas proteolíticas formam peptídeos a partir da caseína, conferindo sabores característicos a cada tipo de queijo (ARAÚJO et al., 2009). Alguns autores citam que, em decorrência da proteólise não específica em níveis elevados, pode ocorrer diminuição do rendimento do queijo, bem como alteraçãoem suas propriedades reológicas e sensoriais. A diminuição do rendimento seria reflexo da perda de substâncias nitrogenadas e gordura para o soro. A maior taxa de proteólise seria responsável também pelo desenvolvimento de amargor durante a maturação, além de modificações indesejáveis na textura do queijo (USTUNOL & HICKS, 1990). 
Foi analisado no queijo frescal que havia uma perda de soro em volta do queijo, entretanto não foi observado amargor, nem modificações indesejáveis na textura do queijo. Após a análise do queijo, foi ingerido um pedaço de abacaxi, que possui bromelina, entretanto também não foi percebido o amargor por nenhum integrante do grupo.
O que é proteólise limitada?
A proteólise é um mecanismo muito comum em todas as células e pode ser dividida em duas categorias distintas: proteólise limitada - na qual são clivadas apenas uma ligação peptí­dica ou um número limitado delas numa proteína específica e, proteó­lise não limitada - que basicamente compreende a completa degradação da proteína alvo através da hidró­lise de múltiplas ligações peptí­dicas (SILVA-LÓPEZ, 2010). 
A proteólise limitada se presta a funções regulatórias, não destrói o substrato, mas modifica suas propriedades e funções biológicas e, portanto, a hidrólise das ligações peptídicas media funções essenciais na vida de qualquer organismo vivo (WOLF, 1992).
Características bioquímicas da quimosina ou coalho animal e da renina microbiana
Quimosina, é uma aspartil protease utilizada como coagulante do leite na indústria de fabricação de queijo. Tradicionalmente, a quimosina é extraída a partir do abomaso de bezerro lactantes. Com o aumento da demanda desta enzima, as fábricas de queijos foram buscar outras fontes alternativas de baixo custo, entre elas a quimosina recombinante que surgiu como uma opção promissora. 
A quimosina (renina; EC 3.4.23.4) é uma aspartil protease gástrica extraída do abomaso de bezerros lactentes, de importância comercial na indústria de fabricação de queijos (LANGHOLM JENSEN et al., 2013; CHITPINITYOL et al., 1998; MOHANTY et al., 1999). O papel desta enzima na digestão do animal é o de coagular o leite ingerido, produzindo uma massa pastosa, aumentando o tempo de permanência do leite no animal, podendo ser degradadas pela ação de outras enzimas proteolíticas (FOX et al., 1997). O coalho de bezerro é constituído de 85-95% de quimosina e de 5-15% de pepsina (USTUNOL et al., 1990). 
 
5. Referências bibliográficas
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