Relatório Lipoliticas

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS 
FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
DCA- DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS DE ALIMENTOS
TRANSFORMAÇÕES BIOQUÍMICAS EM ALIMENTOS
TA610 B
ESTUDO DA AÇÃO DE ENZIMAS LIPOLÍTICAS
Profa. Dra. Gabriela Alves Macedo
Profa. Colaborador: Dra. Helia Harumi Sato
PED: Annayara Celestina Ferreira Fernandes
PED: Karina Magna Macena Leão
Grupo 09
Fernando Augusto Fernandes 155368
Lourrann Marcoss dos S. Oliveira 156297
Campinas, 10 de Novembro de 2017.
INTRODUÇÃO
	As lipases (triacilglicerol ester hidrolase E.C. 3.1.1.3) estão presentes em diversos organismos, dentre eles animais, plantas, fungos e bactérias. Elas atuam como enzimas hidrolíticas que catalisam reações de hidrólise de triacilgliceróis a ácidos graxos e glicerol. Além disso, as lipases podem ser empregadas em biotecnologia, principalmente em óleos e alimentos (HOSHINO, 1990), e em síntese orgânica, viabilizando a preparação de compostos enantiomericamente enriquecidos (SANTANIELO, 1990;THEIL, 1995).
	A importância das lipases na indústria de alimentos está relacionada ao fato de que, se não forem devidamente controladas, podem hidrolisar lipídeos e conferir aroma e sabor rancificados a produtos lácteos, carnes, peixes, entre outros, o que torna o produto indesejável ao consumidor. Entretanto, alguns alimentos necessitam de sua atividade, como queijos tipo Roquefort e Camembert, nos quais os aromas e sabores desenvolvidos pelas lipases tornam-se característicos desses produtos e, portanto, indispensáveis (REED, 1975).
	A maior parte das lipases possui atividade ótima entre 30 e 40ºC, sendo que a origem influencia em sua termoestabilidade, um exemplo disso é o fato que as de origem microbiana são geralmente mais estáveis. Em relação ao pH, as lipases apresentam alta atividade entre pHs de 5 a 9, uma faixa considerada ampla. Alguns fatores determinam a especificidade das lipases, como características moleculares da enzima, estrutura do substrato ou fatores que afetam a ligação da enzima ao substrato ou à própria conformação da enzima (RIGO, 2004).
	Além disso, as lipases são estáveis em solventes orgânicos (KLIBANOV, 1989; ZAKS, 1988). Entretanto, há uma facilidade com que essas enzimas aceitam substratos diversos, isso sugere que a estrutura polipeptídica é flexível e pode adotar diversas conformações. Devido a esse fato, há uma dificuldade em modelar e prever as interações estereoquímicas para este grupo de biocatalisadores (SIH, 1989).
OBJETIVOS
	O objetivo deste relatório é a determinação da atividade da lipase comercial.
MATERIAIS E MÉTODOS
	Para a determinação da atividade da lipase comercial, foram preparadas três misturas de reação com 5mL de emulsão de óleo de oliva (preparado pela homogeneização de 5g de óleo de oliva + 10mL de goma arábica 7% + 30mL de tampão acetato 0,1M pH 5,5 + 1mL de CaCl2 0,1M em liquidificador por alguns minutos) e variando de zero a 2,0mL os volumes de lipase comercial e de água. 
	Os frascos foram tampados e incubados por 30 minutos em banho maria a 50ºC. Posteriormente, foi adicionado 3mL de etanol e fenolftaleína nos frascos para que seja possível a titulação com NaOH.
	Além disso, na aula prática, foram avaliados os aspectos e aromas de queijos comerciais.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Tabela 1 - Determinação da atividade de lipase
	
	Erlenmeyer
	Emulsão de óleo de oliva
	lipase comercial
0,7 g / 100 mL
	H20
	mL de NaOH 0,05N
gasto na titulação
	1
	5 mL
	1,0mL
	1,0mL
	11,1mL 
	2
	5 mL
	2,0mL
	0,0mL
	11,9mL
	Controle
	5 mL
	0,0mL
	2,0mL
	0,9mL
Tabela 1.
Depois de obtidos os dados da determinação a atividade de lipase, foi possível perceber que houve pouca variação dos resultados pelos grupos, uma vez que o Controle, por não ter lipase comercial os gastos de NaOH foram menores que os testes com 1,0 e 2,0 mL de lipase comercial. 
A partir dos dados da Tabela 2 abaixo, foi possível construir a curva padrão de ácido oléico. 
Tabela 2 - Curva padrão de ácido oléico
	μmol de ácido oléico
	mL de NaOH 0,05 N gastos
	236,25
	4,4
	472,5
	9,4
	945,0
	19,0
	1417,5
	27,8
	1890,0
	37,5
Tabela 2.
Figura 1. Curva padrão do ácido óleico
Com a curva padrão de titulação do Ácido Oléico, é feito o cálculo da atividade de lipase para cada Erlenmeyer da seguinte forma:
O Erlenmeyer controle não apresenta atividade de lipase, pois em sua preparação não se adicionou enzima, mas deve-se considerar ele no cálculo das atividades de lipase dos demais erlenmeyers como será visto abaixo.
 Cálculo da atividade de lipase comercial - Erlenmeyer 1:
V1 – Vcontrole = (11,10 – 0,90) mL = 10,20 mL
Y= 50,309X + 5,189 → Y= 518,341 μmol de ácido óleico
Sabemos que 1 unidade de atividade = 1 μmol de ácido graxo liberado/minuto/mL de lipase comercial. Então, já que o tempo de reação foi de 30 min: 
Unidade de atividade = (518,341 μmol) / [30 min x 1 mL]
Unidade de atividade= 17,278 μmol de ácido graxo liberado/ minuto x mL de lipase comercial.
 Cálculo da atividade de lipase comercial - Erlenmeyer 2:
V2 – Vcontrole = (11,90 – 0,90) mL = 11,00 mL
Y= 50,309X + 5,189 → Y = 558,588 μmol de ácido óleico
Sabemos que 1 unidade de atividade = 1 μmol de ácido graxo liberado/minuto/mL de lipase comercial. Então, já que o tempo de reação foi de 30 min: 
Unidade de atividade = (558,588 μmol) / [30 min x 2 mL]
Unidade de atividade = 9,310 μmol de ácido graxo liberado/ minuto x mL de lipase.
DISCUSSÃO
O ensaio realizado acima não condiz com o resultado esperado. Isso ocorre, pois era esperado que no segundo erlenmeyer, que tinha maior quantidade de enzima lipolítica, a quantidade de NaOH consumida fosse maior do que no primeiro erlenmeyer, já que quanto maior a extensão da lipólise, maior deveria ser a quantidade de ácido graxo liberado. Dessa forma, as unidades de atividade da lipase deveriam ser próximas senão iguais, por se tratar da mesma preparação enzimática. No entanto, analisando os resultados, vimos que a atividade do segundo erlenmeyer deu muito menor, não correspondendo ao esperado. Visto isso, podemos atribuir tal erro por possível falta de substrato ou inibição da enzima pelo produto.
Aspecto e aroma das amostras de queijo comerciais:
Queijo gorgonzola: Os ácidos graxos são metabolizados e se transformam em Metilcetona. Aspecto mais úmido, cremoso e gomoso, porém ainda firme. Coloração esverdeada, com desenvolvimento de fungos. Aroma de proteólise e lipólise que lembra o de chulé.
Queijo parmesão ralado: Aspecto seco. Aroma mais evidente e de manteiga fresca e de coloração amarelada. 
Queijo parmesão inteiro: Aspecto seco. Aroma mais rançoso que o parmesão ralado e de coloração amarelada. 
Queijo brie: Aspecto seco na superfície e cremoso no interior. Coloração mais esbranquiçada. Aroma de proteólise e lipólise que lembra o de mofo de parede úmida.
Questões:
1) Explique porque o aumento da concentração de lipase não resulta em aumento proporcional de liberação de ácido graxo.
As lipases (triacilglicerol ester hidrolase E.C. 3.1.1.3) são biocatalisadores responsáveis por catalisar reações de hidrólise de óleos em ácidos graxos livres, monoacilgliceróis, diacilgliceróis e glicerol. Um elevado número de compostos de alta e baixa massa molecular também pode ser substrato dessa enzima, tais como tioésteres, amidas, poliidroxiesteres/hidroxiácidos, etc. Além da hidrólise, as lipases também são capazes de catalisar reações reversas, como esterificação, transesterificação (interesterificação, alcóolises e acidólises), aminólise (síntese de amidas) e lactonização, sendo que a atividade de água do meio reacional é um dos fatores determinantes para cada classe de reação. (MACEDO e PAQUES, 2005).
2) Verificar na literatura as características bioquímicas (especificidade quanto ao substrato, condições ótimas de atividade e estabilidade) das lipases pancreáticas, lipases do leite e de cereais (trigo).
- Lipases pancreáticas:
A lipase pancreática (LP) é a principal enzima lipolíticasintetizada e secretada pelo pâncreas e desempenha papel fundamental na digestão eficiente dos triglicerídeos. Ela remove ácidos graxos preferencialmente dos carbonos 1 e 3 dos triglicerídeos ingeridos na dieta, liberando 2-monoacilglicerol e ácidos graxos de cadeia longa saturados e poli-insaturados como produtos lipolíticos. (Mukherjee, 2003; Shi & Burn, 2004). A LP exige uma proteína pancreática, a colipase, como cofator para a sua atividade enzimática. A colipase liga-se à LP, tornando-se um intermediário que permite a formação do complexo lípase-substrato e contrinui para ancorar a lípase na superfície e estabilizá-la na conformação ativa. (Brockman, 2000). 	
 	Dependendo do microrganismo produtor de lipase, a massa molecular desta enzima pode variar na faixa de 20 a 200 KDa, apresentando atividade enzimática numa ampla faixa de pH que varia de 4 a 9 e temperatura numa faixa de 25ºC a 70ºC. Lipases são usualmente estáveis em soluções aquosas neutras à temperatura ambiente. Contudo, sua termoestabilidade varia consideravelmente em função da origem, sendo as lipases microbianas as que possuem maior estabilidade térmica. (CASTRO-OCHOA et al., 2005).
- Lipase do leite:
 	A lipase é responsável pelo sabor rançoso do leite ou dos derivados lácteos. A lipase desdobra a gordura do leite, com liberação de ácidos graxos de cadeia curta (butírico, capróico e caprflico) que conferem sabor e odor rançosos ao leite. O leite cru apresenta lipase natural, que atua espontaneamente. Esta atividade varia de acordo com o grau de agitação a que o leite é submetido após a ordenha e no transporte. As principais bactérias responsáveis pela produção de lipase no leite cru pertencem ao gênero Pseudomonas. Pouca informação existe sobre os efeitos da lipase dessas bactérias em cremes de leite e manteiga, mas outros microrganismos lipolíticos, especialmente fungos e leveduras, podem causar deterioração desses produtos. A pasteurização inativa a lipase natural do leite, mas não inativa completamente a produzida por bactérias. A lipase produzida por Alca/igenes viscolatis no leite cru resiste à pasteurização e é responsável pela rancificação de queijos.
 	A lipase produzida por Pseudomonas sp é extremamente resistente ao calor. Sua temperatura ótima de atividade é 40ºC, porém mantém 27 a 41% de sua atividade a temperatura ambiente, 20 e 25ºC respectivamente. O pH ótimo é de 8,5; em pH 6,5 apresenta somente 8,3% de atividade e, em pH 7, 43%. O pH parece ser o fator limitante da atividade das lipases em produtos lácteos (ADAMS; BRAWLEY, 1981).
-Lipase do trigo:
Outro exemplo pode ser dado na indústria de panificação, no fabrico do pão, a lipase degrada os lípidos do trigo, modificando a sua interação com o glúten, obtendo um resultado condicionador na massa, aumentando o volume do pão, melhorando a textura. Neste caso, utiliza-se a lipase 1,3 específica para obter este efeito (CASTRO, 2004). A hidrólise realizada por lipases 1,3 específicas é aplicada para a obtenção de monoacilgliceróis que são usados como agentes emulsificantes (FREIRE; CASTILHO, 2008). Foram estudados temperaturas ótimas na faixa de 45 a 55°C e pH variando de 7,5 a 8,0 para lipases de fontes vegetais (GIORDANI, 1991).
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ADAMS, D.M.; BRAWLEY, T.G. Heat resistant bacterial lipases and ultra-high temperature sterilization of dairy products. Journal of Dairy Science, v. 64, p.1951-1957, 1981.
BROCKMAN, H.L. Kinetic behaviour of the pancreatic lípase-colipase-lipid system. Biochimie, Paris, v.82, n.11, p. 987-995, 2000.
CASTRO-OCHOA, L. D.; RODRIGUEZ-GOMEZ, C. VALERIO-ALFARO, G.; ROS, R. O. Screening, purification and characterization of thermoalkalophilic lipase produced by Bacillus thermoleovorans CCR11. Enzyme and Microbial Technology, v. 37, p. 648-654, 2005.
FREIRE, D. M. A.; CASTILHO, L. R. Lipases em biocatálise. In: BON, E. P. S.;
GIORDANI, R.; MOULINA, A.; VERGER, R.; Tributyroylglycerol hydrolase activity in Carica papaya and other lattices; Phytochemistry; v.30(4); p. 1069-1072; 1991
MACEDO, G. A; PAQUES, F. W.; 2005. LIPASES DE LÁTEX VEGETAIS: PROPRIEDADES E APLICAÇÕES INDUSTRIAIS. Departamento de Ciências de Alimentos, 
SANTANIELO, E.; Ferraboschi, P.; Grisenti, P.; Manzocchi, A.; Chem. Rev. 1990, 92, 1071.
THEIL, F.; Chem. Rev. 1995, 95, 2203.
HOSHINO, T.; Yamane, T.; Shimizu, S.; Agric. Biol. Chem. 1990, 54, 1459.; Hanson, M.; Oils Fats Int. 1990, 5, 29.
KLIBANOV, A. Trends Biochem. Sci. 1989, 14, 141-144.
ZAKS A.; Klibanov, A. M.; J. Biol. Chem. 1988, 263, 3194- 3201.
SIH, C. J.; Chen, C. S. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1989, 28, 695.
REED, G. – Enzymes in Food Processing. 2ªEd. Academic Press, Nova Iorque, p.182, 1975
RIGO, E. – Aplicação de lípases como auxiliar no pré-tratamento de efluentes de frigoríficos de suínos e bovinos. Departamento de Ciências Agrárias, Universidade Regional Integrada, Erechim RS, 2004