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Arlindo Ugulino Netto ● MEDRESUMOS 2016 ● MICROBIOLOGIA 1 www.medresumos.com.br INTRODUÇÃO À MICROBIOLOGIA A microbiologia (Mikros = pequeno + Bio = vida + logos = ciência) é o ramo da biologia que estuda os microrganismos, incluindo eucariontes unicelulares e procariontes, como as bactérias, fungos e vírus. Atualmente, a maioria dos trabalhos em microbiologia é feita com métodos de bioquímica e genética. Também é relacionada com a patologia, já que muitos organismos são patogênicos. Microbiologistas têm feito muitas contribuições à biologia, especialmente nos campos da bioquímica, genética, e biologia celular. Micróbios possuem características que os tornam os modelos de organismos ideais. Foi descoberta a origem das bactérias, tendo sido anterior a origem de outros corpos, tais como protozoários, eucariotes e vírus. Dentre os citados, o último a se desenvolver foram os protozoários, por tratar-se de seres com uma complexidade maior. São muito pequenos, então eles não consomem muitos recursos; Alguns possuem ciclos de vida bastante curtos (aprox. 30 minutos para E. coli, desde que esteja na presença das condições ótimas de crescimento); Células podem sobreviver facilmente em isolamento das outras células; Eles podem se reproduzir por divisão mitótica, permitindo a propagação de clones idênticos em populações; Eles podem ser congelados por longos períodos de tempo. Mesmo se 90% das células são mortas pelo processo de congelamento, há milhões de células em um mililitro da cultura líquida. Estes traços permitiram que Joshua e Esther Lederberg pudessem dirigir um elegante experimento em 1951 demonstrando que adaptações evolutivas surgem melhor da preadaptação do que da mutação dirigida. Para isto, eles inventaram a replicação em placa, que permitiu que eles transferissem numerosas colônias de bactérias para locais específicos de uma placa de petri preenchida com Ágar-ágar para regiões análogas em diversas outras placas de petri. Após a replicação de uma placa com E. coli, eles expuseram cada uma das placas a fagos. Eles observaram que colônias resistentes aos fagos estavam presentes em partes análogas de cada placa, possibilitando-os concluir que os traços de resistência aos fagos existiam na colônia original, que nunca havia sido exposta aos fagos, ao invés de surgirem após as bactérias terem sido expostas aos vírus. A extensiva caracterização dos micróbios tem nos permitido o uso deles como ferramentas em outras linhas da biologia: Bactérias (especialmente Escherichia coli) podem ser usadas para reduplicar DNA na forma de um (plasmídeo). Este DNA é frequentemente modificado quimicamente in vitro e então inserido em bactérias para selecionar traços desejados e isolar o produto desejado de derivados da reação. Após o crescimento da bactéria e deste modo a replicação do DNA, o DNA pode ser adicionalmente modificado e inserido em outros organismos; Bactérias podem também ser usadas para a produção de grandes quantidades de proteínas usando genes codificados em um plasmídeo; Genes bacteriais têm sido inseridos em outros organismos como genes repórteres; O sistema de hibridação em levedura combina genes de bactérias com genes de outros organismos já estudados e os insere em uma célula de levedura para estudar interações proteicas em um ambiente celular. HISTÓRICO Esta área do conhecimento teve seu início com os relatos de Robert Hooke e Antony van Leeuwenhoek, no século XVII, que desenvolveram microscópios que possibilitaram as primeiras observações de bactérias e outros microrganismos, além de diversos espécimes biológicos. Leeuwenhoek descobriu por acidente uma maneira de observar seres microscópicos no leite: lustrando lentes no local onde trabalhava, observou que, associando algumas delas, era possível observar elementos minúsculos, como os micro-organismos. Nesse momento, acontecia a descoberta do mundo microbiano, ou seja, o mundo de “pequeninos animálculos” (bactérias, fungos, protozoários), chamados assim por ele. Embora van Leeuwenhoek seja considerado o "pai" da microbiologia, os relatos de Hooke, descrevendo a estrutura de um bolor, foram publicados anteriormente aos de Leeuwenhoek. Assim, embora Leeuwnhoek tenha fornecido importantes informações sobre a morfologia bacteriana, estes dois pesquisadores devem ser considerados como pioneiros nesta ciência. Recentemente foi publicado um artigo discutindo a importância de Robert Hooke para o desenvolvimento da Microbiologia. Arlindo Ugulino Netto. MICROBIOLOGIA 2016 http://pt.wikipedia.org/wiki/E._coli http://pt.wikipedia.org/wiki/DNA http://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Gene_rep%C3%B3rter&action=edit&redlink=1 http://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Sistema_de_hibrida%C3%A7%C3%A3o_em_levedura&action=edit&redlink=1 Arlindo Ugulino Netto ● MEDRESUMOS 2016 ● MICROBIOLOGIA 2 www.medresumos.com.br TEORIA DA ABIOGÊNESE Cerca de 2 mil anos atrás, surgiu a ideia de que a vida poderia se originar espontaneamente da matéria inanimada. Aristóteles e outros sábios da época acreditavam que larvas poderiam surgir "espontaneamente" do lixo, assim como outros seres poderiam aparecer na terra, da lama e de outros materiais. Aristóteles admitia que, para um ser vivo se originar da matéria bruta bastava apresentar o que ele chamou de "princípio ativo", que faria uma pedra se transformar num peixe, desde que as condições fossem favoráveis. Entretanto, nunca ocorreu aos pesquisadores isolar sua experiência para que os micro-organismos não pudessem "entrar" no recipiente que continha os ingredientes. Assim, tal experimento sofria abertamente a interferência externa. A teoria da abiogênese começou a desmoronar quando essa possibilidade foi testada. TEORIA DA BIOGÊNESE A vida só se origina de outra forma pré-existente e não de um "Princípio ativo" que, segundo Aristóteles, poderia ser um objeto inanimado. As experiências do médico e biólogo italiano Francesco Redi e Louis Pasteur sepultaram definitivamente a teoria da abiogênese. Francesco Redi (1668), cientista italiano, foi um dos primeiros biogenistas a questionar a teoria da geração espontânea. Em seu experimento, Redi colocou pedaços de carne em dois frascos abertos, cobrindo um deles com uma fina camada de gaze. Após instantes da preparação, analisou que os dois frascos ficaram rodeados por moscas, mas elas só podiam pousar no pedaço de carne contida no frasco descoberto. Transcorridos alguns dias, com a matéria orgânica decomposta, notou o surgimento de larvas apenas no frasco aberto, concluindo então que as larvas surgiram do desenvolvimento de ovos colocados pelas moscas, e não da carne em putrefação, dotada de fonte de vida. Mas que a carne somente contribuía com um meio propício para atração de moscas, deposição de ovos e eclosão de larvas. Com este teste provou que a vida não surge espontaneamente em qualquer circunstância, mas atestando que a vida somente se origina de outro ser vivente. Em meados do século XVII, o holandês Antonie van Leeuwenhoek com um microscópio descobriu o mundo dos micro-organismos, os micróbios. Os abiogenistas acreditaram ainda mais na sua tese, afirmando que seres tão pequenos não se reproduzia e sim surgiam espontaneamente. O cientista inglês John Needham (1713-1481) realizou seus experimentos para provar que os micróbios surgiam de geração espontânea. Diversos frascos contendo um caldo nutritivo foram submetidos à fervura por 30 minutos. Depois Needham lacrava os frascos com rolhas e os deixava por repouso por alguns dias. Depois desse repouso ele examinou o caldo com a ajuda de um microscópio e notou a presença de micro-organismos. A explicação dada foi que a fervura tinha matado todos os seres eventualmente presentes no caldo e nenhum micro-organismo poderia entrar no frasco após de ter sido lacrado com rolhas. Portanto, só havia uma explicação: os micro- organismos surgiram por geração espontâneaou abiogênese. Após alguns anos o padre e pesquisador italiano Lazzaro Spallanzani (1729-1799) repetiu os experimentos de Needham com algumas modificações. Spallanzani colocou caldo nutritivo em balões de vidro e fechou-os hermeticamente. Esses balões eram então colocados em caldeirões e fervidos por cerca de uma hora. Dias depois ele examinou os caldos e obteve resultados completamente diferentes aos de Needham: o caldo estava livre de micro- organismos. Spallanzani explicou que Needham submeteu a solução à fervura por um tempo curto demais para esterilizar o caldo. Needham respondeu às críticas afirmando que o tempo longo usado pelo cientista destruía a força vital ou princípio ativo que dava vida à matéria, e ainda tornava o ar desfavorável ao aparecimento da vida. Em fins do século XVII pôde-se entender porque o ar se tornava desfavorável ao aparecimento da vida. Descobriu-se que o oxigênio é essencial à vida. Segundo abiogenistas o aquecimento prolongado e a vedação hermética excluíam o oxigênio tornando impossível a sobrevivência de qualquer forma de vida. Foi por volta de 1860 que um grande cientista francês conseguiu provar definitivamente que seres vivos só podem se originar de outros seres vivos. Louis Pasteur (1822-1895) preparou um caldo de carne – excelente meio de cultura para micróbios – colocou então, esse caldo em um frasco com pescoço de cisne e submeteu o líquido contido dentro desse frasco à fervura para a esterilização. Após a fervura a medida que o líquido resfriava, gotículas de água se acumulavam no pescoço do frasco agindo como uma espécie de filtro retendo os micróbios contidos no ar que penetrava no balão, impedindo a contaminação do caldo. Esse experimento mostrou que não era a falta de ar fresco que impedia a formação de micro-organismos no caldo. Pasteur provou também que não havia nenhuma ‘’força vital’’ que era destruída após a fervura, pois se aquele mesmo caldo esterilizado fosse submetido ao ar sem a filtragem que o balão pescoço de cisne proporcionava, surgiriam sim micro-organismos que advinham de contaminação. Com esse espetacular Arlindo Ugulino Netto ● MEDRESUMOS 2016 ● MICROBIOLOGIA 3 www.medresumos.com.br experimento Pasteur recebeu um prêmio compensador da Academia Francesa de Ciências e derrubou de uma vez por todas a hipótese da geração espontânea ou abiogênese. OBS 1 : Spallanzani durante seus experimentos submeteu seus caldos à vedação hermética, isto é, livre de gazes. Um confeiteiro parisiense François Appert aproveitou as experiências de Spallanzani, notando que alimentos cozidos podiam ser guardados sob vedação hermética sem se estragar, inventou a indústria de enlatados. OBS²: Pasteur submeteu seus caldos a uma cuidadosa técnica de esterilização, com aquecimentos e resfriamentos bruscos. Hoje, essa técnica é conhecida como pasteurização. A partir destas descobertas e experiências que o mundo se viu voltado para um novo ramo da ciência. Lister (1867), por exemplo, viu-se preocupado em proteger as cirurgias desses seres microscópicos, desenvolvendo, assim, a cirúrgia antisséptica. Robert Koch (1876) e Pasteur se interessaram em estudar as possíveis relações desses seres com algumas doenças que acometiam populações nesse tempo. Foi daí que o primeiro observou bactérias no sangue de carneiro: bactérias causadoras da cólera e tuberculose. Louis Pasteur foi requisitado para investigar a doença do bicho- da-seda e durante seis anos tentou provar que um protozoário causava a doença. Também estudou o papel dos microrganismos nas doenças dos seres humanos e dos animais. Em 1880 ele descobriu o que bactérias atenuadas conferiram proteção contra a cólera aviária e em 1884 relatou que os vírus atenuados protegiam contra a raiva. Pasteur com a finalidade de matar esporos, iniciou a prática de esterilizar as infusões empregando o vapor sob pressão (15 libras a 121 o C), enquanto que materiais estáveis eram esterilizados em fornos com calor seco na temperatura de 160ºC. Robert Koch provou que as bactérias eram responsáveis pela doença do carbúnculo. Foi o primeiro a provar que um tipo específico de micróbio causa um tipo definido de doença. Em 1877 foi o primeiro a utilizar o cristal violeta com sucesso para a coloração do antraz, Paul Ehrlich utilizou o azul de metileno e F Ziehl e F. Neelsen desenvolveram a coloração pelo ácido, permitindo que Koch observasse mais tarde o bacilo da tuberculose. Introduziu também o meio contendo ágar, identificou o bacilo da tuberculose e foi o primeiro a isolar as bactérias causadoras do antraz e da cólera asiática. Koch, por volta de 1880, organizou postulados baseado em quatro critérios necessários para provar que um micróbio específico causa uma doença particular. OBS 3 : Postulados de Koch: Um microrganismo específico deve sempre estar associado a uma doença; O microrganismo deve ser isolado e cultivado em cultura pura, em condições laboratoriais; A cultura pura do microrganismo produzirá a doença quando inoculada em animal susceptível; É possível recuperar o microrganismo inoculado do animal infectado experimentalmente. O ramo da imunologia desenvolveu-se dos estudos iniciais da bacteriologia. Porém os chineses, persas e brahmins já praticavam a variolização, técnica que consistia na exposição de um indivíduo são às crostas secas de um indivíduo que se recuperava da doença. Em 1776, Edward Jenner, introduziu a prática de imunização ativa, expondo indivíduos a antígenos da varíola humana mais branda, protegendo-os da forma mais agressiva. Pasteur, após 100 anos, estendeu o conceito de imunização ativa, quando observou que a cólera aviária podia ser evitada inoculando cultura velha de bacilos, com a sua virulência reduzida. Em seguida ele aplicou este princípio de imunização na prevenção do carbúnculo, denominando as culturas avirulentas de vacinas (do latim vacca, vaca) e o processo de imunização, com tais culturas, de vacinação. Ele desenvolveu este método através da utilização de organismos atenuados e preparou vacinas protetoras contra o antraz, a erisipela suína e contra a raiva. Koch iniciou estudos sobre as relações celulares do hospedeiro às infecções, o clássico de imunidade mediada por células foi a observação, que o mesmo fez, quando injetou um antígeno derivado do organismo causador da tuberculose, ocasionando reações inflamatórias tardias em seres humanos e animais quando expostos. Alexander Fleming (1881 – 1955) trabalhou como médico microbiologista no Hospital St. Mary de Londres até o começo da Primeira Guerra Mundial. Durante a guerra foi médico militar nas frentes de batalha da França e ficou impressionado pela grande mortalidade nos hospitais de campanha causada pelas feridas de arma de fogo que resultavam em gangrena gasosa. Finalizada a guerra, regressou ao Hospital St. Mary onde buscou intensamente um novo antisséptico que evitasse a dura agonia provocada pelas infecções durante a guerra. Os dois descobrimentos de Fleming ocorreram nos anos 20 e ainda que tenham sido acidentais demonstram a grande capacidade de observação e intuição deste médico britânico. O descobrimento da lisozima ocorreu depois que o muco de seu nariz, procedente de um espirro, caísse sobre uma placa de cultura onde cresciam colônias bacterianas. Alguns dias mais tarde notou que as bactérias haviam sido destruídas no local onde se havia depositado o fluido nasal. O laboratório de Fleming estava Arlindo Ugulino Netto ● MEDRESUMOS 2016 ● MICROBIOLOGIA 4 www.medresumos.com.br habitualmente bagunçado, o que resultou em uma grande vantagem para sua segunda importante descoberta. Em Setembro de 1928, Fleming estava realizando vários experimentos em seu laboratório e ao inspecionar suas culturas antigas antes de destruí-las notou que a colônia de um fungo havia crescido espontaneamente, como um contaminante, numa das placas de Petri semeadas com Staphylococcus aureus. Fleming observou outras placase comprovou que as colônias bacterianas que se encontravam ao redor do fungo (mais tarde identificado como Penicillium notatum) eram transparentes devido a uma lise bacteriana. A lise significava a morte das bactérias, e no caso, das bactérias patogênicas (Staphylococcus aureus) crescidas na placa. CLASSIFICAÇÃO GERAL DOS SERES VIVOS Até a metade do século XX, os seres vivos são classificados em apenas duas categorias: reino animal e reino vegetal. Com o progresso da biologia, a classificação se amplia para incluir organismos primitivos que não têm características específicas só de animais ou de vegetais. A partir da década de 60, o critério internacionalmente aceito divide os organismos em cinco reinos: Moneras: seres unicelulares (formados por uma única célula) procariontes (células sem núcleo organizado). O material hereditário é constituído por ácido nucleico no citoplasma. São as bactérias e as cianófitas (algas azuis), antes consideradas vegetais primitivos. Protistas: seres unicelulares ou pluricelulares eucariontes (que possuem núcleo individualizado). Seu material genético está organizado nos cromossomos, dentro do núcleo. Representados por protozoários, como a ameba, o tripanossomo (causador do mal de Chagas), o plasmódio (agente da malária), que até a metade do século XX eram considerados animais primitivos e algas unicelulares e pluricelulares. Fungos: seres eucariontes uni e pluricelulares como as leveduras, o mofo e os cogumelos. Já foram classificados como vegetais, mas sua membrana possui quitina, molécula típica dos insetos e que não se encontra entre as plantas. São heterótrofos (não produzem seu próprio alimento), por não possuírem clorofila. Animais: são organismos multicelulares e heterótrofos (não produzem seu próprio alimento). Englobam desde as esponjas marinhas até o homem, cujo nome científico é Homo sapiens. Plantas: caracterizam-se por ter as células revestidas por uma membrana de celulose e por serem autótrofas (sintetizam seu próprio alimento pela fotossíntese). Existem cerca de 400 mil espécies de vegetais classificados.
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