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4/3/2014 1 ENZIMAS ) Professora: Vera Maria Morsch 1700 – Catálise biológica, em estudos da digestão da carne pelas secreções do estômago; 1850 – Louis Pasteur concluiu que a fermentação do açúcar em álcool pela levedura é catalisada por fermentos – Vitalismo; 1887 – Eduard Buchner descobriu que extratos de levedura poderiam fermentar açúcar em álcool provando que a fermentação era promovida por moléculas que continuavam a função quando removidas das células; Frederick W. Kuhne chamou essas moléculas de Enzimas; 1926 – James Sumner isolou e cristalizou a Urease. Descobriu que cristais de urease consistiam inteiramente de proteínas e postulou que todas as enzimas são proteínas (Algumas exceções). Histórico Enzimas • Extraordinário poder de catálise; • Alto grau de especificidade; • Aceleram reações químicas; • Desempenham suas funções em soluções aquosas em certas condições de Temperatura e pH. Deficiência ou ausência de uma enzima Doenças Atividade em excesso uma enzima Atividade de Enzimas Plasma sanguíneo Eritrócitos Amostras de tecido Diagnóstico de Doenças 4/3/2014 2 • Com exceção de um grupo de RNA catalítico!!!!!!! • A atividade catalítica da enzima depende da integridade de sua conformação nativa: • Se a enzima for desnaturada ou dissociada em suas subunidades a atividade catalítica é perdida; • Possuem pesos moleculares de cerca de 12.000 até mais de 1 milhão; Estruturas Todas enzimas são proteínas..... Reação Enzimática • E + S ES P + E Co-fatores Pequenas moléculas orgânicas ou inorgânicas que podem ser necessárias para a função de uma enzima. A fração protéica de uma enzima, na ausência do seu co-fator, é chamada de apoenzima. 4/3/2014 3 Coenzima São compostos orgânicos, quase sempre derivados de vitaminas, que atuam em conjunto com as enzimas Uma coenzima ou íon metálico ligado muito forte ou covalentemente á enzima é chamado de grupo prostético Holoenzima = É uma enzima cataliticamente ativa completa, ligada a: enzima + co-fator + coenzima A CLASSIFICAÇÃO DAS ENZIMAS SE DÃO A PARTIR DAS REAÇÕES QUE ELAS CATALISAM... 1. Oxidorredutases: São enzimas que catalisam reações de transferência de elétrons. Ex:. Desidrogenases e as Oxidases; 2. Transferases: Enzimas que catalisam reações de transferência de grupamentos funcionais como grupos amina, fosfato, acil, carboxil, etc. Ex:. as Quinases e as Transaminases; 3. Hidrolases: Catalisam reações de hidrólise de ligação covalente. Ex: As peptidades; 4. Liases: Catalisam a quebra de ligações covalentes e a remoção de moléculas de água, amônia e gás carbônico. Ex:. As Dehidratases e as Descarboxilases; 5. Isomerases: Catalisam reações de interconversão entre isômeros ópticos ou geométricos. Ex:. Epimerases; 6. Ligases: Catalisam reações de formação e novas moléculas a partir da ligação entre duas já existentes, sempre às custas de energia (ATP). Ex:. Sintetases. Oxirredutases Transferases Hidrolases Liases Isomerases Ligases Nomenclatura e Classificação 4/3/2014 4 Cada enzima possui código com 4 dígitos que caracteriza o tipo de reação catalisada... 1955 - Comissão de Enzimas (EC) da União Internacional de Bioquímica (IUB) - nomear e classificar. E.C. e o número.... Que corresponde a: 1° dígito - classe 2° dígito - subclasse 3° dígito - sub-subclasse 4° dígito - indica o substrato Ex:. E.C. 2.7.1.1 Nome: Hexoquinase 2 - classe - Transferase 7 - subclasse - Fosfotransferases 1 - sub-subclasse - Fosfotransferase que utiliza grupo hidroxila como receptor 1 - indica ser a D-glicose o receptor do grupo fosfato • A catálise enzimática das reações é essencial para os sistemas vivos; • Reações não catalisadas tendem a serem LENTAS; • As reações requeridas para digerir os alimentos, enviar sinais nervosos ou contrair um músculo não ocorrem com uma velocidade útil sem a catálise. A característica que distingue uma reação catalisada por uma enzima é que ela se realiza dentro de um bolsão confinado da enzima – SÍTIO ATIVO SUBSTRATO Molécula que é ligada ao sítio ativo e age sobre a enzima. Resíduos de aa!!! Ligação de um substrato a uma enzima no sitio ativo. Se ligam ao substrato Sitio Ativo Revestido com resíduos de aa 4/3/2014 5 Fatores externos que influenciam na velocidade de uma reação enzimática - Temperatura: Quanto maior a temperatura, maior a velocidade da reação, até se atingir a temperatura ótima; a partir dela, a atividade volta a diminuir, por desnaturação da molécula. - pH: Igual à temperatura; existe um pH ótimo, onde a distribuição de cargas elétricas da molécula da enzima e, em especial do sítio catalítico, é ideal para a catálise. As enzimas afetam as velocidades da reação e não o seu equilíbrio.... Estado basal Estado basal ΔG’°= variação de energia livre ΔG = energia de ativação Elas não são consumidas no processo!!! 4/3/2014 6 Comparação de uma reação catalisada de uma reação não-catalisada E + S ES EP E + P Aumento da velocidade da reação e diminuição da energia de ativação O requerimento de interações fracas para impulsionar a catálise é uma razão por que as enzimas são tão grandes pois elas devem oferecer grupos funcionais para as interações iônicas, pontes de hidrogênio e outras, posicionando esses grupos para que a energia de ativação seja otimizada no estado de transição. Formas complementares de um substrato e seu sitio de ligação em uma enzima Emil Fischer 1894 – “as enzimas são estruturalmente complementares aos seus substratos, de forma que se ajustam entre si como uma chave e fechadura” MECANISMO DE AÇÃO • Efetividade das interações E - S: • Emil Fischer (1894) : “chave – fechadura” • Haldane (1930), Linus Pauling (1946): • E complementar ao ET dos S – 4/3/2014 7 A energia de ativação contribui para a especificidade da reação e a catálise... • A enzima não será capaz de interagir com outras moléculas que não estão arranjadas de maneira a formar interações especificas com o seu sitio ativo, neste caso o substrato é pobre para a enzima; Energia formada através da interação enzima-substrato • Reação muito estável.. Improvável de ocorrer... Interações fracas.. Reação ocorre... 4/3/2014 8 Alinhamento dos grupos funcionais catalíticos da enzima • Enzima sofre uma conformação quando o S se liga interações fracas: Ajuste Induzido (Koshland -1958) Organiza os grupos funcionais específicos da enzima na posição correta para catalisar a reação Potencializa as propriedades catalíticas da E; Formação de interações de ligação fracas adicionais no estado de transição. Grupos catalíticos específicos contribuem para a catálise... • Catálise ácido-base geral • Catálise covalente • Catálise por íons metálicos A concentração do substrato afeta a velocidade das reações catalisadas por enzimas... Uma abordagem simplificadora nos experimentos de cinética é medir a velocidade inicial (Vo), quando a [S]for maior que a [E]. Onde a E pode estar em [ ] nanomolares, enquanto que S em [ ] cinco a seis ordens de magnitude maior!! Cinética enzimática Determina as constantes de afinidade do S e dos inibidores; Conhecer as condições ótimas da catálise; Ajuda a elucidar os mecanismos de reação; Determinar a função de uma determinada enzima em uma rota metabólica. O modelo de Michaelis-Menten é útil para explicar a cinética das reações catalisadas por enzimas. 4/3/2014 9 Modelo de Michaelis e Menten O modelo de Michaelis-Menten considera que uma reação enzimática ocorre em dois passos: ETAPA 1. Ligação de um substrato (S) a uma enzima (E), formando um complexo intermediário (ES) ETAPA 2. Formação do produto (P) a partir do complexo ES, com recuperação da forma livre da enzima (E) • Enzima primeiro combina reversivelmente com o S para formar o ES, em uma etapa reversível e rápida: • O complexo ES depois se quebra em uma segunda etapa mais lenta produzindo a E livre e produto P da reação • A medida que a [S] aumenta a Vmax é proporcional a [S]. • E essa Vmax é observada quando virtualmente toda a Enzima estiver presente como complexo ES e a [E] é pequena Atinge a SATURAÇÃO 4/3/2014 10 • Quando essa E é misturada a um grande excesso de substrato, ocorre um período inicial, o estado pré-estacionário onde o ES se estabelece; (duração de poucos microsegundos) • A reação logo alcança o Estado Estacionário, onde a [ES] permanece constante com o tempo. A relação entre a concentração de substrato e a velocidade da reação pode ser expressa quantitativamente • A curva expressando a relação entre a [S] e a Vo segue a mesma forma para a maioria das enzimas • E são expressas algebricamente pela equação de Michaelis e Menten Essa equação deriva da hipótese de que a etapa limitante da reação nas reações enzimáticas é a quebra do complexo ES até o produto e a Enzima livre 4/3/2014 11 Parâmetros Cinéticos são usados para comparar as atividades enzimáticas • As enzimas que seguem o comportamento de uma curva hiperbólica são seguem a cinética de Michaelis e Menten. Quando: Km=[S] quando a Vo= 1/2 Vmax Para uma mesma enzima temos Km diferentes O Km de um substrato para uma enzima específica é característico, e nos fornece um parâmetro de especificidade deste substrato em relação à enzima. Quanto menor o Km, maior a especificidade... Enzimas que obedecem a relação Michaelis e Menten usando o Diagrama de Lineweaver-Burk produzem uma linha reta Facilidade de distinguir tipos de reações Analisar Inibidores Muitas enzimas podem catalisar reações com dois ou mais substratos • Exemplo: Reação catalisada pela HEXOQUINASE Substratos A hexo possui um Km característico para cada substrato. Ambos os substratos podem estar ligados a enzima formando um complexo ternário não-covalente 4/3/2014 12 As enzimas estão sujeitas à inibição reversível ou irreversível Os inibidores enzimáticos são agentes moleculares que interferem na catálise diminuindo parando as reações INIBIDORES ENZIMÁTICOS... Qualquer substância que reduz a velocidade de uma reação enzimática. MISTO •Inibição Enzimática Reversível Um tipo comum de inibição reversível é chamado de inibição competitiva, onde um inibidor competitivo compete com o substrato pelo o sitio ativo de uma enzima Inibidores competem com o sítio ativo da enzima!!! INIBIÇÃO COMPETITIVIA Vmáx inalterada 4/3/2014 13 • Inibição incompetitiva Inibidores incompetitivos ligam-se a um sítio separado, mas unem-se apenas ao complexo ES!!! INIBIÇÃO INCOMPETITIVA Mudança na Vmáx e no Km, tendem a diminuir • Inibição mista Inibidores mistos ligam-se a um sítio separado, mas podem unir-se tanto a E quanto no ES!!! INIBIÇÃO MISTA Afeta o Km e a Vmax 4/3/2014 14 Inibição Enzimática Irreversível Inibidores irreversíveis são aqueles que se ligam de forma covalente ou destroem um grupo funcional de uma enzima que é essencial para a atividade enzimática. A enzima não volta mais a sua atividade normal.. Enzimas Reguladoras Não obedecem a cinética de Michaelis-Menten; Controlam a etapa limitante em uma cadeia de reações enzimáticas; Tem sua atividade catalítica aumentada ou diminuída em resposta a determinados sinais, moléculas sinalizadoras (pequenos metabólicos ou cofatores). Classes de enzimas reguladoras: Enzimas alostéricas; Enzimas reguladas pela modificação covalente reversível Enzimas alostéricas Funcionam através da ligação não-covalente e reversível de um metabólito regulador chamado modulador; Moduladores podem ser inibidores ou ativadores; São maiores e mais complexas, possuem duas ou mais cadeias polipeptídicas. Enzimas reguladas por modificação covalente reversível Grupos químicos são ligados covalentemente e removidos da enzima reguladora por enzimas diferentes. EX:. fosfato, adenosina monofosfato, grupos metil, etc. Modulador Inibidores Estimuladores 4/3/2014 15 Inibição por Retroalimentação Aspartato transcarbamilase, que catalisa a primeira reação da biossíntese de nucleotídeos de pirimidina, apresenta 12 cadeias polipeptídicas organizadas em subunidades catalíticas e reguladoras 2 arranjos catalíticos : azul e púrpura 3 arranjos reguladores : Vermelho e amarelo 2 arranjos catalíticos : azul e púrpura 3 arranjos reguladores : Vermelho e amarelo Enzimas Alostéricas diferem de enzimas não reguladas... Diferenças estruturais Possuem um ou mais sítios alostéricos para a ligação do modulador Cada sitio regulador é especifico para o seu modulador São maiores e mais complexas 4/3/2014 16 As propriedades cinéticas das enzimas alostéricas divergem do comportamento de Michaelis e Menten As enzimas alostéricas mostram relações Vo e [S] diferentes da cinética de Michaelis e Menten Elas não exibem saturação com o substrato quando a [S] for alta; Produzem uma curva de saturação sigmóide e não hiperbólica. • Modulador positivo (ativador), curva mais próxima de uma hipérbole, diminui o K0,5 • Modulador negativo ( inibidor), curva mais sigmoidal, aumento no K0,5 Resumindo enzimas.... ...são proteínas complexas que produzem uma alteração química específica sobre outras substâncias sem que exista uma alteração sobre si mesma. Sua principal função é a catálise biológica, além de reguladoras dessas reações, por isso são consideradas as unidades funcionais do metabolismo celular...
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