Relatório Completo Separação e Purificação de Proteínas

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI 
CAMPUS ALTO PARAOPEBA 
CURSO DE GRADUAÇÃO ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS 
 
 
 
 
Brunna D‟Onofre Couto, Camila Cristina Vieira Velloso e Maira Fernanda Alves 
Bueno 
 
 
 
 
RELATÓRIO DE SEPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA ENZIMA INVERTASE 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ouro Branco, MG. 
2015 
Trabalho apresentado à 
disciplina de Separação e 
Purificação de Produtos 
Biotecnológicos. 
Sumário 
 
1. Introdução 
1.1 Saccharomyces Cerevisiae síntese da enzima invertase 
1.2 Rompimento Celular 
1.3 Precipitação de Proteínas 
1.4 Dosagem de Proteína Total e Atividade Enzimática 
1.5 Cromatografia de Troca Iônica 
2. Resultados e Discussão 
2.1 Rompimento Celular 
2.2 Precipitação da Invertase 
2.3 Atividade Enzimática da Invertase 
2.4 Cromatografia de Troca Aniônica 
2.5 Dosagem de Proteína Total e Atividade Enzimática da Invertase 
3. Conclusão 
4. Referências Bibliográficas 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1. Introdução 
1.1. Saccharomyces Cerevisiae na síntese da enzima invertase 
A Saccharomyces cerevisiae é um dos microrganismos mais utilizados 
na produção da enzima invertase tanto em escala industrial quanto em 
laboratorial. Invertases ou β-D frutofuranosidase é uma enzima que catalisa a 
hidrólise da ligação glicosídica da sacarose de β–frutofuranosidase em 
frutofuranosídeos (SANTOS, 2010), convertendo-a em glicose e frutose. 
Comumente conhecida como invertase, catalisa a hidrólise da sacarose, 
levando à inversão da rotação óptica do meio reacional, causada pelo 
surgimento de frutose ao se observar em polarímetro. O produto de hidrólise da 
sacarose, o xarope de glicosefrutose, é conhecido como “açúcar invertido”, o 
qual apresenta diversas características interessantes em relação ao xarope de 
sacarose: maior poder educorante (devido à presença da frutose), maior 
possibilidade de concentração (os monossacarídeos formados são mais 
solúveis que o dissacarídeo original), ponto de ebulição mais alto e ponto de 
congelamento mais baixo (em virtude da maior pressão osmótica do produto) 
(SANTOS, 2010). 
De acordo com FLEURI, a parede celular da levedura Saccharomyces 
cerevisiae é formada por três componentes principais: glucana, um polímero de 
β-1,3 e β-1,6 glicose (48-60%), mananaproteínas (20-23%) e quitina, um 
polímero de β-1,4 N-acetilglicosamina (0,6-2,7%). A parede celular possui duas 
camadas principais: uma externa, composta de mananaproteínas e uma 
interna, de glucana. 
 A parede celular de leveduras tem muitas funções: proteção física, 
estabilidade osmótica, suporte de enzimas, adesão célula/ célula e barreira de 
permeabilidade seletiva. Além disso, promove rigidez e transporte de nutrientes 
para o citoplasma, proporcionando a integridade, o metabolismo e o 
crescimento celular. Constitui cerca de 15 a 25% da massa seca da célula e 
não é uma estrutura estática e sim, uma estrutura em constante crescimento e 
mudança. Os componentes da parede celular são sintetizados e unidos entre 
si; estruturas especializadas, como os septos são formados em sincronia com o 
crescimento e divisão celular (FLEURI, 2005). 
 A parede celular de leveduras é formada por uma camada de 
mananaproteínas que sobrepõe a camada de glucana, sendo uma estrutura 
dinâmica ajustável durante o ciclo celular e em resposta às condições 
ambientais como nutrientes, disponibilidade de O2, temperatura e pH. 
Perturbações na parede celular de leveduras desencadeiam mecanismos de 
reparo que reorganizam toda a estrutura molecular, para preservar a 
integridade da célula (FLEURI, 2005). 
A enzima invertase pertence a família GH32 de glicosídeos hidrolases, a 
qual engloba mais de 370 elementos, cujos são encontrados em vegetais 
(aspargo, beterraba, 23 cebola, chicória, entre outras) (SANTOS, 2010), 
bactérias, leveduras (Saccharomyces sp.) e fungos filamentosos (Aspergillus 
sp.) (SANTOS, 2010). A principal fonte de invertase industrial são as leveduras 
(Saccharomyces sp.), as quais produzem diferentes tipos dessa enzima: 
intracelulares, ligadas à parede, e, mais raramente, extracelulares, sendo que a 
externa possui resíduos de cisteína e a interna não. Da invertase produzida, 
80% é extracelular, a qual é uma glicoproteína com cerca de 50% de 
carboidrato e 20% é intra, que não possui elevada quantidade de carboidratos 
em sua estrutura (SANTOS, 2010). 
A temperatura ótima de atuação da invertase é 55 ºC para soluções 
diluídas de sacarose e de 65 ºC a 70 ºC para soluções com concentração 
superior a 10%. Soluções acima de 20% de sacarose apresentam taxas 
decrescentes de hidrólise em virtude da reduzida disponibilidade de água no 
meio reacional (SANTOS, 2010). A termoestabilidade da invertase pode ser 
devido à estrutura terciária da proteína, a qual contém interações carboidrato – 
proteína, com ligações cruzadas na cadeia polipeptídica (SANTOS, 2010). 
Algumas das propriedades da invertase externa e interna estão apresentadas 
na Tabela1 (GÁSCON et al., 1981). 
 
 
Tabela 1: Propriedades da invertase externa e interna. 
Propriedades Invertase Externa Invertase Interna 
Massa Molecular (kDa) 270000 135000 
% Carboidrato 50 3 
Atividade Específica 
(U/mg de proteína) 
2700 2900 
Km (mM de Sacarose) 26 25 
pH – estabilidade 3,0-7,5 6,0-9,0 
pH ótimo 3,5-5,5 3,5-5,5 
Fonte: GÁSCON et al., 1981. 
 
No presente trabalho, pretende-se purificar a invertase a partir de células 
de levedura Saccharomyces cerevisiae, as quais foram obtidas de extrato de 
levedura processado industrialmente. Esse microrganismo é o mais bem 
caracterizado para produção dessa enzima. A fim de atingir possível 
purificação da mesma, utilizaram-se as operações unitárias de rompimento 
celular, centrifugação, precipitação por sulfato de amônio, dosagem de proteína 
total e atividade enzimática e cromatografia adsortiva de troca aniônica. 
 
1.2. Rompimento Celular 
De acordo com PESSOA Jr. & KILIKIAN (2005), o aumento pela 
demanda de produtos intracelulares, como proteínas e enzimas, pelas 
indústrias alimentícias e farmacêuticas tem evidenciado a importância dos 
processos de rompimento celular. Com os avanços de técnicas de 
reconhecimento de DNA, várias moléculas intracelulares têm sido sintetizadas 
a partir de procariotos e eucariotos, o que tem impulsionado o desenvolvimento 
de técnicas de rompimento celular. 
 Segundo o mesmo autor, o rompimento celular ocorre após a etapa de 
separação e lavagem (clarificação) das células obtidas ao final do cultivo. Os 
critérios utilizados para a seleção da técnica de rompimento celular devem 
considerar alguns fatores, como: tamanho da célula, tolerância a tensões de 
cisalhamento, necessidade de controle de temperatura, tempo de operação, 
rendimento do processo, gasto de energia, custo e capital de investimento. 
 Como o rompimento celular é a primeira etapa de separação de 
produtos intracelulares, sendo crucial para o processo de "downstream", pois 
qualquer dano causado à molécula de interesse compromete os próximos 
passos de purificação das mesmas, invalidando todos os processos 
subsequentes, podendo levar o um menor rendimento (NEVES, 2003). 
 Os métodos de rompimento celular são divididos em métodos mecânicos 
como homogeneizador de alta pressão, moinho de bolas, prensa francesa e 
ultrassom e os não-mecânicos, que são o choque osmótico, 
congelamento/descongelamento, aquecimento e secagem. Tem os químicos, 
os quais são os que utilizam álcalis, solventes, detergentes e ácidos e, por 
último, o método enzimático, que faz a lise enzimáticaou inibição da síntese 
da parede celular. Também há os métodos alternativos como o liquidificador 
industrial, utilizado para romper tecido animal e vegetal (PESSOA Jr. & 
KILIKIAN, 2005). 
 No entanto, os métodos mais utilizados para amplificação de escala 
piloto e industrial são os mecânicos e os métodos de rompimento químico e 
enzimático, apesar de específicos (NEVES, 2003), são de difícil reprodução em 
uma escala maior, devido aos vários parâmetros a ser controlados. 
 Porém, para escolher um dos métodos de rompimento celular, 
primeiramente, deve-se ter conhecimento da morfologia, tamanho da célula, ou 
seja, conhecer a estrutura para escolher o método mais adequado. Células de 
mamíferos são facilmente rompidas por serem frágeis, sob baixas tensões de 
cisalhamento, por simples variação da pressão osmótica do meio, adição de 
detergentes ou aplicação de ultrassom de baixa intensidade, portanto requerem 
pouca energia para seu rompimento (PESSOA Jr. & KILIKIAN, 2005). 
 Já células com estruturas de parede celular mais robusta são de difícil 
rompimento. Bactérias gram-negativas são mais fáceis de serem rompidas do 
que bactérias gram-positivas, devido à parede possuir menor quantidade de 
peptideoglicano. E as paredes celulares de leveduras e fungos são ainda mais 
difíceis de serem rompidas por possuírem estruturas mais complexas, devido 
sua composição de polissacarídeos (PESSOA Jr. & KILIKIAN, 2005). 
 Como no presente trabalho se fez o rompimento celular da 
Saccharomyces cerevisiae, com fim de se obter a enzima invertase purificada, 
a qual é intracelular, foi escolhido o método de rompimento por moinho de bola. 
 
1.3. Precipitação de Proteínas 
A precipitação é uma das etapas de clarificação de simples amplificação 
de escala, foi uma das primeiras técnicas utilizadas na separação de uma 
mistura proteica e é empregada há décadas (PESSOA Jr. & KILIKIAN, 2005). 
Sendo que, em soluções aquosas, tem-se a precipitação de proteínas, com 
posterior com recuperação do precipitado, o que compõe uma das mais 
importantes operações unitárias de processos de separação e purificação de 
proteínas (WATANABE, 2004). 
 De acordo com PESSOA Jr. & KILIKIAN (2005) "Precipitados são 
agregados de diferentes moléculas proteicas, grandes o suficiente para serem 
observados a olho nu e sedimentam sob valor de força centrífuga relativamente 
baixa. O termo precipitação é usado para descrever a operação na qual 
perturbação, química ou física, em uma solução proteica, causa a formação de 
partículas insolúveis de proteínas, recuperadas posteriormente por uma 
operação de separação sólido-líquido”. 
 Na precipitação de proteína podem-se utilizar sais neutros, solventes, 
polímeros, temperatura, ponto isoelétrico, entre outros como afinidade e íons 
metálicos, esses métodos não podem causar desnaturação da proteína, pois 
se deseja uma conformação ativa. 
 A precipitação de proteínas em altas concentrações de sal é conhecida 
como "salting-out". O mecanismo de precipitação com sais ocorre devido à 
neutralização das cargas superficiais da camada de hidratação, favorecendo os 
agregados dos resíduos hidrofóbicos. Quando se adiciona o sal ao sistema, ele 
se dissocia; a água, que anteriormente estava solvatando as regiões 
hidrofóbicas da proteína, irá interagir mais fortemente com os íons de sal. De 
acordo com a termodinâmica (eq.1), há o aumento da entropia, por 
consequência, a energia livre de Gibbs diminui, favorecendo as interações 
hidrofóbicas, pois as proteínas têm sua solubilidade reduzida no meio aquoso 
(PESSOA Jr. & KILIKIAN, 2005). O sal mais utilizado em "salting-out" é o 
sulfato de amônio devido a sua alta solubilidade em água, à baixa densidade 
de suas soluções (WATANABE, 2004), ao fato de ter ação bactericida, evitar 
proteólise e possuir efeito estabilizante sobre as proteínas (PESSOA Jr. & 
KILIKIAN, 2005). 
 (1). 
 Já no mecanismo de precipitação por solvente orgânico, há redução da 
atividade de água, causada por diminuição da constante dielétrica do sistema, 
aumentando a energia livre do sistema. A fim de diminuí-la, a existência de 
grupos carregados na proteína não é favorecida, formando os aglomerados 
proteicos para neutralização das cargas. Ou seja, com aumento na 
concentração de solvente, a solvatação da água em regiões carregadas e 
hidrofílicas da superfície da proteína diminui, aumentando as interações 
eletrostáticas (PESSOA Jr. & KILIKIAN, 2005). A acetona e o etanol são os 
solventes orgânicos mais utilizados na precipitação, pois são completamente 
miscíveis em água (WATANABE, 2004), propriedade bactericida e apresentam 
densidade menor que água, fazendo com que a sedimentação do precipitado 
seja mais rápida (PESSOA Jr. & KILIKIAN, 2005). 
 Na precipitação de proteínas utilizando polímeros, entende-se que o 
mecanismo é devido à exclusão da proteína do meio aquoso (PESSOA Jr. & 
KILIKIAN, 2005). O emprego de polímeros não iônicos, de alta massa 
molecular e solúveis em água, para a precipitação fracionada de proteínas foi 
introduzida por POLSON et al., em 1964, citado por WATANABE, 2004. O 
polietilenoglicol (PEG) é o mais usado, devido à variedade de graus de 
polimerização. A concentração necessária deste depende do tamanho da 
proteína e da massa molar do polímero e é inversamente proporcional à 
concentração da proteína (PESSOA Jr. & KILIKIAN, 2005). 
 No entanto, quando feita por ajuste de pH, precipitação isoelétrica, 
adicionam-se ácidos ou bases até que o pH do meio seja igual ao ponto 
isoelétrico da proteína, onde a carga líquida da molécula é nula e a repulsão 
eletrostática entre as moléculas é mínima, prevalecendo as interações 
hidrofóbicas entre proteína e proteína (WATANABE, 2004). 
 Por temperatura, há indução das interações hidrofóbicas, podendo 
causar desnaturação, sendo que sua diminuição provoca redução da 
solubilidade de proteínas; já com aumento, expõem grupos hidrofóbicos, 
formando aglomerados proteicos, porém, causa perda de estrutura terciária, o 
que não sendo um método muito usado somente quando a enzima é 
termoestável. 
 O objetivo do experimento era efetuar a precipitação da invertase, 
tentando obter um bom rendimento. 
 
1.4. Dosagem de Proteína Total e Atividade Enzimática 
A purificação de um produto biotecnológico requer diversas operações 
unitárias para que o mesmo seja completamente purificado. O grau de pureza 
varia de acordo com a aplicação deste produto, ou seja, para processos 
envolvendo produtos com grau de pureza elevado, se gasta mais recursos 
fazendo com que o valor agregado a esse seja alto. 
O estudo cinético de um processo químico ou bioquímico é uma etapa 
vital para investigar a formação de produtos. Um modelo cinético adequado 
permite uma fácil análise de dados e fornece uma estratégia para resolver 
problemas encontrados na etapa posterior, relacionada ao projeto de reatores 
(ALMEIDA, 2003). 
 De uma maneira geral, a grande maioria das enzimas pode ser definida 
como proteínas globulares formadas por resíduos de aminoácidos unidos por 
ligações peptídicas. São catalisadores biológicos que diminuem a energia de 
ativação, acelerando uma reação termodinamicamente possível, sem alterar a 
constante de equilíbrio e a energia livre de reação (GÜRSEL et al., 2003; ISIK 
et al., 2003; BLANCH & CLARK, 1997). 
Os métodos para a determinação da concentração de proteínas totais são 
muito variados, no entanto, as metodologias mais utilizadas são as 
espectrofotométricas no ultravioleta e no visível. Ao longo dos anos, muitos 
métodos espectrofotométricos têm sido propostos para a determinação deproteínas totais, porém não existe uma metodologia considerada de uso 
universal para todos os meios. Os métodos geralmente mais utilizados são o 
do Biureto, de Lowry, de Bradford, de Smith e de absorção de proteínas no 
ultravioleta (ZAIA et al., 1998). 
A principal vantagem do método de Lowry é a sua alta sensibilidade e, por 
isto, tem sido utilizado para a determinação da concentração de proteínas 
totais em diversos meios (ZAIA et al., 1998). Apesar do método de Lowry 
apresentar uma grande sensibilidade para proteínas, o mesmo possui algumas 
desvantagens como estar sujeito a diversos interferentes. O método utilizado 
na prática foi o de Brandford. 
O método de Bradford emprega o corante Coomassie Brilliant Blue G-250 
e baseia-se na interação de grupos ácidos e básicos de proteínas com grupos 
dissociados de corantes orgânicos, formando precipitados coloridos. O corante 
Coomassie Brilliant Blue liga-se primariamente à resíduos de aminoácidos 
aromáticos básicos, em especial à arginina, na superfície da proteína. Trata-se 
de um método que não apresenta tantos interferentes, como o método de 
Lowry. Apenas substâncias como SDS, Triton X-100, detergentes comerciais, 
tampões básicos, hidróxido de sódio e Tris (> 2,0 M) causam grandes 
interferências (PESSOA Jr. & KILIKIAN, 2005). 
O limite inferior de detecção do método de Lowry é de proteínas com 
massas molares de 3 a 5 kDa, e assim, aminoácidos ou pequenos peptídeos 
não se ligam. Já para o método de Bradford, apenas proteínas com massa 
molar superior a 10kDa são detectadas, razão pela qual, em alguns casos, 
obtém-se valores menores de concentração de proteína com o método de 
Bradford, em relação aos valores obtidos com o método de Lowry (PESSOA Jr. 
& KILIKIAN, 2005). 
Para determinação do rendimento e da pureza, além da quantificação de 
todas as proteínas, é necessário dispor de métodos específicos de 
quantificação da molécula alvo. Quantificação indireta é obtida com relativa 
facilidade quando a molécula considerada apresenta atividade biológica 
específica, como é o caso da invertase, por ser uma enzima, deve ser realizada 
a determinação da atividade enzimática da mesma. 
A atividade enzimática é por definição a velocidade inicial da reação 
específica catalisada pela enzima, determinada em condições padronizadas de 
pH, temperatura, força iônica e concentração do substrato, portanto, condições 
reprodutíveis. Defini-se uma unidade de atividade enzimática como a 
quantidade de produto liberado ou substrato consumido (µmol) em um minuto 
nas condições do ensaio (PESSOA Jr. & KILIKIAN, 2005). 
As proteínas a determinar são inicialmente diluídas para garantir uma 
gama de absorbâncias apropriada. O sistema reacional montado pelo método 
supracitado é quantificado por espectrometria. Os métodos de espectrometria, 
em específico os de absorção molecular (espectrofotometria), se valem da 
capacidade de todas as moléculas orgânicas serem capazes de absorver 
radiação eletromagnética, por conterem elétrons de valência que podem ser 
excitados para níveis mais altos de energia. Estas transições envolvem a 
excitação de elétrons não ligantes (n) para orbitais σ. Também pode ocorrer, e 
de forma mais comum, as transições de elétrons não ligantes ou π para o 
estado excitado π. Neste caso, a molécula precisa possuir um grupo funcional 
insaturado para fornecer tais elétrons. Essas moléculas orgânicas são 
chamadas de cromóforas (SKOOG et. al., 2002). 
 
1.5. Cromatografia de Troca Iônica 
Segundo AULER, “o termo “cromatografia” é usado para indicar métodos 
de separação físico-químicos, os quais se baseiam na distribuição dos 
componentes entre a fase móvel e a fase estacionária. A descoberta da 
cromatografia é atribuída a Tswett, que, em 1903, foi o primeiro a separar 
pigmentos de folha em uma fase sólida polar e a interpretar este processo. 
Considerou-se que a época moderna da cromatografia começou na década de 
30, quando Kuhn e Lederer “redescobriram” e aperfeiçoaram a cromatografia 
em coluna, repetindo as experiências de Tswett, separando e identificando as 
xantofilas da gema de ovo, usando uma coluna recheada com carbonato de 
cálcio pulverizado e éter de petróleo como fase móvel”. 
Os primórdios do processo chamado atualmente de troca iônica datam 
de vários séculos antes de Cristo. As primeiras descrições da cromatografia de 
troca iônica em coluna foram realizadas no século dezenove (SOUZA, 2005). 
A cromatografia por troca iônica também teve seu início com a síntese, 
por Adams e Holmes, das primeiras resinas de troca iônica, as quais eram 
baseadas em fenol e formaldeído e permitiam a troca catiônica. 
Posteriormente, as resinas de poliacrílico ou poliestireno entrecruzado com 
divinilbenzeno, com substituintes sulfônicos, carboxílicos ou alquilaminos, 
substituíram as originais (AULER, 2006). 
De acordo com AMARO, “a cromatografia de troca iônica em meio não 
aquoso foi aplicada, na década de 1950, para a separação de fitofármacos, 
utilizando resinas sulfônicas com baixo grau de ligações cruzadas, não 
apresentando, entretanto, bom desempenho na recuperação das moléculas de 
interesse. Em 1962, Kunin e colaboradores propuseram a utilização de 
suportes poliméricos macroporosos, com alto grau de ligações cruzadas, os 
quais não exibiam alteração de porosidade em meio não aquoso. Essas 
“novas” resinas macroporosas trocadoras de íons apresentaram melhores 
desempenhos de recuperação, tendo sido utilizadas na separação de 
antibióticos, proteínas e açúcares. Estudos recentes mostram a aplicação 
destas resinas também para alcaloides, inclusive àqueles presentes em 
extratos brutos vegetais”. 
A Cromatografia de Íons (CI), a qual foi desenvolvida por Small, inclui 
todos os métodos cromatográficos com mecanismos baseados em troca iônica. 
Segundo Sarzanini, a CI é um processo baseado na troca reversível de íons 
entre uma solução e um sólido, um material insolúvel polimérico ou inorgânico 
contendo íons fixos e contra- íons trocáveis. Os analitos são separados com 
base em suas diferentes afinidades (AULER, 2006). 
Por meio dessa cromatografia adsortiva se torna possível separar uma 
amostra contendo ácidos carboxílicos, bases orgânicas, peptídeos, 
aminoácidos, ácidos nucleicos, ânions inorgânicos, cátions metálicos e 
complexos que apresentam cargas (AULER, 2006). 
De acordo com Auler, “um trocador iônico compreende três elementos 
importantes: uma matriz insolúvel que pode ser orgânica ou inorgânica, natural 
ou sintética, sítios iônicos fixos e uma quantidade equivalente de íons de carga 
oposta àquelas fixadas nos sítios. Os grupos fixados são referidos como 
grupos funcionais e os íons associados (que estão próximos) são chamados de 
contra-íons”. 
Os trocadores iônicos a base de resina devem apresentar propriedades 
específicas, como a habilidade de trocar os íons com rapidez, boa estabilidade 
química em uma ampla faixa de pH e resistência à deformação durante a 
aplicação da amostra na coluna e quando são expostos à vazão da fase móvel 
(AULER, 2006). 
Neste trabalho, utilizou-se uma resina de carga positiva para possível 
adsorção da enzima invertase e posterior purificação da mesma. 
 
2. Resultados e Discussão 
 
 2.1. Rompimento Celular 
Na escolha do método de rompimento foram analisados a estrutura e 
tamanho da célula, as características da enzima, como resistência a tensões 
de cisalhamento, a estabilidade, a temperatura, a localização da molécula 
dentro da célula, o método mais eficiente que irá liberar a maior concentração 
do produto de interesse e menor quantidade de contaminantes. As opções 
disponíveis eram liquidificador, grau e pistilo e moinhode bolas, dentre elas, 
decidiu-se que a mais viável era o moinho de bolas. 
 Não se escolheu grau e pistilo devido a grande tensão de cisalhamento 
que o equipamento pode causar às células, tendo um maior número de 
contaminantes e dificultando os próximos passos de purificação. E não se 
optou pelo liquidificador, porque gera muito espuma, o que pode causar 
desnaturação da proteína-alvo, sendo um procedimento mais indicado para 
rompimento de células animais e vegetais, além de exigir um sistema mais 
complexo de refrigeração. 
 Apesar das esferas de vidro disponíveis para o equipamento não 
estarem de acordo com o tamanho ideal encontrado da literatura, segundo 
JÚNIOR & KILIKIAN (2005), diâmetro de 0,5mm para células de leveduras, 
sendo essa de 7mm, considerando significativa perda de rendimento, já que de 
acordo os mesmos autores, esferas com diâmetros menores tendem a 
proporcionar rompimento mais eficiente, pois é maior a probabilidade de 
cisalhamento com as células intactas. 
 O moinho de bolas utilizado no experimento tinha uma câmera cilíndrica, 
posicionada na horizontal. A movimentação da câmera, em vez de ser por um 
eixo de rotação contendo discos, é por ondas mecânicas em uma determinada 
frequência, que no caso poderia ser escolhida. Optou-se por 20 Hz de acordo 
com dados da literatura, servindo somente para experimentos realizados em 
laboratórios, devido ao elevado consumo de energia. 
 O tempo também foi outro fator que se determinou, 9 minutos, e 
programou no equipamento. Levou-se em consideração o tamanho das 
esferas, já que a mesma estava 14 vezes maior que o recomendado, decidiu-
se utilizar esse tempo para tentar uma melhor eficiência de rompimento e não 
prejudicar a estrutura terciária da invertase. 
 O mecanismo de rompimento ocorre através das esferas, as quais se 
movimentam. Tem-se que a energia potencial será transformada em energia 
cinética e mecânica, gerando camadas, onde cada uma dessas possui uma 
velocidade diferente, transferindo energia cinética para as esferas, o que leva a 
formação de um fluxo turbulento e a tensão de cisalhamento, rompendo a 
célula. Logo, o rompimento ocorre devido à força de cisalhamento aplicada 
pelas esferas contra a parede celular da Saccharomyces cerevisiae. 
 O volume da câmera cilíndrica horizontal era de 5 mL. De acordo com 
JÚNIOR & KILIKIAN (2005), a concentração celular mais recomendada para 
ocupar o volume da câmera é de 30 a 50% (v/v), sendo que concentrações 
menores geram menos calor, mas aumenta o consumo de energia por unidade 
de massa, fator importante para escala industrial. Carga de esferas de 80 a 
85% do volume, observando que se a carga muito pequena aumenta a 
ocorrência de colisão suficiente para proporcionar boa desintegração, se muito 
grande, elas se chocarão e diminuirão a eficiência do processo, além de 
aumentarem a temperatura e o consumo de energia. 
 Analisando esses parâmetros, decidiu utilizar 70% de volume de carga 
de esferas, já que as mesmas apresentavam tamanho elevado e 18% de 
concentração de leveduras; os 12% restante preencheu-se com tampão PBS. 
Como o objetivo era somente o rompimento e não ampliação de escala, não se 
preocupou com o consumo de energia por unidade de massa e sim com a 
eficiência de rompimento, e com uma menor quantidade de contaminantes, 
que, em experimentos posteriores, será analisada pela quantificação de 
proteínas totais e atividade enzimática da invertase. Logo: 
 
 
 
 
 
 
 
 Após o rompimento celular, obtém-se um extrato bruto, sendo ele 
constituído por invertase, biomoléculas contaminantes e fragmentos celulares. 
Posteriormente, os compostos indesejáveis devem ser removidos por etapas 
do processo de clarificação. Para verificação se o procedimento ocorreu como 
esperado, analisou-se a atividade enzimática específica da invertase. Onde o 
extrato bruto deve apresentar uma maior atividade, já que ainda não se fez 
nenhuma etapa de purificação. 
 
 2.2. Precipitação da Invertase 
Primeiramente se fez um levantamento na literatura para saber-se quais 
são as concentrações ideais para a precipitação da invertase. Tem-se que, 
com etanol de 60-70%, acetona de 70-75%, sulfato de amônio de 45-55%. 
Todas as opções estavam disponíveis no laboratório. 
 Dentre as condições oferecidas, se escolheu a precipitação por sulfato 
de amônio, pois oferece maior estabilidade para proteína, não há muita 
geração de calor, ação bactericida e proteolítica. Porém, se o objetivo fosse 
ampliação de escala não seria o ideal para a invertase, que é uma enzima 
muito utilizada na indústria farmacêutica e alimentícia. Pois, o sulfato de 
amônio apresenta características corrosivas, caráter ácido, difícil manuseio e 
disposição final. Quando presente em produtos alimentícios pode apresentar 
gosto ruim, é tóxico para uso clínico, tendo que ser removido (JÚNIOR & 
KILIKIAN, 2005). É importante destacar que todo o procedimento experimental 
foi efetuado no banho de gelo para evitar possível desnaturação. 
 A eficiência do procedimento será analisada quando se fizer a análise de 
atividade enzimática da invertase. No pellet deve estar o sal com a invertase e 
no sobrenadante as proteínas contaminantes e uma concentração pequena de 
molécula-alvo, já que a concentração de sal necessária para a precipitação é 
diferente para cada proteína. 
 
 2.3. Atividade Enzimática da Invertase 
Após os processos de rompimento celular, centrifugação e precipitação 
realizaram-se a determinação da atividade enzimática das amostras e a 
dosagem de proteína total. 
A primeira etapa realizada para dosar a atividade enzimática de 
amostras é a preparação dessas amostras. As preparações foram feitas 
conforme medidas da tabela 2. 
 
Tabela 2: Dados para preparação das amostras para posterior leitura destas no 
espectofotômetro. 
Tubos Amostra 
Solução de 
Sacarose 
Tampão 
acetato 
Amostra DNS H2O 
1ª Extrato Bruto 250 µL 200 µL 50 µL 500 µL 4,0 mL 
1B Extrato Bruto 250 µL 200 µL 50 µL 500 µL 4,0 mL 
2A Sobrenadante 250 µL 200 µL 50 µL 500 µL 4,0 mL 
2B Sobrenadante 250 µL 200 µL 50 µL 500 µL 4,0 mL 
3A "Pellet" 250 µL 200 µL 50 µL 500 µL 4,0 mL 
3B "Pellet" 250 µL 200 µL 50 µL 500 µL 4,0 mL 
4ª Branco 250 µL 250 µL - 500 µL 4,0 mL 
5ª Branco - 500 µL - 500 µL 4,0 mL 
Fonte: Protocolo oferecido na aula prática “Determinação da atividade enzimática das 
amostras”. 
 
 
 
Figura 1: Preparação da amostra para dosagem enzimática após a precipitação com 
sulfato de amônio. 
 
A enzima sacarase ou invertase (β-fructofuranosidase) é uma enzima que 
catalisa a hidrólise da sacarose (açúcar não redutor) em glicose e frutose (dois 
açúcares redutores). 
Sacarose + H2O  Glicose + Frutose (2) 
Na reação, 1 unidade (U) de invertase hidrolisa 1 mg/mL de sacarose a 
glicose e frutose por minuto, a pH 4,6 (25ºC). A reação segue determinando a 
quantidade de açúcares redutores libertados por ação da enzima, utilizando, a 
reação do ácido 3,5- dinitrosalicílico (DNS) e espectrofotometria. 
Durante o procedimento experimental, tomou-se o cuidado de aplicar as 
substâncias levando em consideração o tempo de reação. Esperava-se 1 
minuto para aplicar a amostra ou DNS no próximo tubo, para que assim, todos 
os tubos tivessem o mesmo tempo de reação, apresentando resultados 
melhores e mais precisos. 
Na presença de um açúcar redutor, o DNS, é reduzido a 3-amino-5-
nitrosalicílico, e apresenta uma cor laranja avermelhado. Através da leitura 
realizada no espectrofotômetro (Tabela 3) é possível calcular a concentração 
do açúcarredutor por intermédio de um gráfico de ajuste linear que relaciona 
as duas grandezas (Figura 2). 
 
Tabela 3: Leituras das absorbâncias à 540 nm das amostras no espectrofotômetro. 
Tubos Amostra Abs 540 nm 
1A Extrato Bruto 0,963 
1B Extrato Bruto 0,996 
2A Sobrenadante 0 
2B Sobrenadante 0,002 
3A "Pellet" 0,226 
3B "Pellet" 0,303 
4A Branco 0,037 
5A Branco 0,055 
 Fonte: Próprio Autor. 
 
O tubo branco é utilizado para minimizar os erros causados pela luz não 
absorvida pelo equipamento espectrofotômetro. Nos tubos brancos as 
absorbâncias corresponderam a 0 (UA). Isto ocorre porque no tubo nomeado 
como branco, não há solução de sacarose 2M e por isso não houve a formação 
de produto, pois invertase é a responsável por hidrolisar a sacarose à glicose e 
frutose e não havendo sacarose não é possível determinar a concentração do 
açúcar redutor. 
Quanto à coloração obtida, verifica-se que a invertase, ao reagir provoca 
o escurecimento da solução. 
 
Figura 2: Curva de Calibração feita no dia 07 de Outubro de 2015. 
 
A equação da reta (y = 5,42498557x - 0,01514512) foi obtida após a 
linearização da curva, como mostrado na Figura 2. A partir da equação abaixo, 
é possível calcular a concentração de proteínas para cada amostra da 
purificação, uma vez que „y‟ é a média da absorbância obtida das amostras em 
duplicata e „x‟ é a concentração de proteína em cada amostra (Tabela 4). 
 
 
 
 
 (3) 
 
Tabela 4: Concentração de glicose em miligramas por mililitro nas amostras coletadas 
com base na curva padrão construída. 
Amostra 
Concentração de 
glicose (mg/mL) 
Extrato Bruto 0,1833450605 
Sobrenadante 0,002976064472 
"Pellet" 0,05154758258 
 Fonte: Próprio Autor. 
 
y = 5,42498557x - 0,01514512 
R² = 0,98904344 
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12
A
b
s 
(5
4
0
 n
m
) 
Concentração de Glicose (mg/mL) 
Como houve atividade enzimática no extrato bruto, o moinho de bolas é 
considerado um bom método para o rompimento, apresentando eficiência. 
Sabe-se que no extrato bruto encontra-se a invertase - molécula de interesse, 
contaminantes e fragmentos celulares, os quais podem inibir um pouco a 
atividade enzimática da invertase, inibindo o seu sítio ativo. Mesmo assim, o 
extrato bruto deve apresentar uma maior atividade enzimática do que os 
próximos passos de purificação, o que realmente ocorreu. 
A concentração de glicose formada foi maior no “pellet” indicando a 
presença de maior concentração de invertase, como era esperado após a 
precipitação. Observa-se que houve perda de parte da invertase no 
sobrenadante, porém indica apenas cerca de 5,8% do que foi encontrado no 
“pellet”. 
Comparando a concentração de glicose que havia no extrato bruto e a 
formada nas demais frações, constata-se que houve uma grande perda da 
enzima de interesse, cerca de 70% dessa enzima foi perdida. Isso indica que 
provavelmente a invertase perdeu sua atividade enzimática, houve mudança da 
sua estrutura tridimensional, tornando-a inativa ou desnaturando-a, mesmo que 
o protocolo inclua o banho de gelo, cuja finalidade é evitar a inativação da 
enzima pela temperatura. 
Esse procedimento não seria adequado para ampliação e nem 
aplicação, pois o rendimento do processo, no primeiro passo, já foi muito baixo. 
A fim de confirmar o resultado mencionado, deve-se realizar novamente o 
procedimento supracitado, com possível alteração na concentração de sal 
utilizada. Caso permaneça com esse baixo rendimento, poderia ser feita uma 
precipitação com solvente, a fim de tentar obter um processo viável para 
purificação da invertase. 
Um dos motivos de ter havido essa perda de molécula alvo durante a 
precipitação com sulfato de amônio, pode ter sido a alta temperatura do dia em 
que foi realizado o experimento; a espuma formada durante a prática; as 
condições de precipitação escolhida, sendo que pode ter sido utilizada uma 
concentração de sal superior a necessária. 
O aumento da temperatura favorece a precipitação de proteínas por 
salting-out, mas o processo deve ser conduzido preferencialmente a 4ºC para 
reduzir o risco de desnaturação, sobretudo por ação de proteases (PESSOA Jr. 
& KILIKIAN, 2005). 
A Atividade enzimática da Invertase é dada pela seguinte fórmula: 
 ( ) 
( ) çã 
 
 (4) 
 
Onde: 
 
AbsAmostra= Absorbância da Amostra; 
AbsBranco = Absorbância do Branco correspondente; 
Fator = Fator de contração da curva padrão de glicose (mg/mL); 
540 = fator de conversão para atividade (u.m.a-1 x min
-1) mol de grupos 
redutores, medidos como glicose por minuto, nas condições de reação 
utilizadas. 
 
Utilizando essa fórmula, obteve-se o resultado apresentado na Tabela 5. 
 
Tabela 5: Atividade Enzimática encontrada em todas as frações após a 
precipitação com sulfato de amônio. 
Amostra 
Atividade Enzimática da 
Invertase (U) 
Extrato Bruto 0,464388811 
Sobrenadante 0 
"Pellet" 0,010523467 
 Fonte: Próprio Autor. 
 
 
 Observa-se, conforme já citado acima, que o sobrenadante não 
apresentou atividade enzimática, sendo um parâmetro positivo para o processo 
de purificação. Já no pellet, obteve-se atividade enzimática, a qual foi bem 
reduzida em relação ao extrato bruto. Tal fato já é esperado, pois, ao aumentar 
o número de operações unitárias, pode haver diminuição do rendimento. 
 
2.4. Cromatografia de Troca Aniônica 
A cromatografia de troca-iônica é uma cromatografia adsortiva 
caracterizada pela ocorrência e prevalência de interações eletrostáticas entre 
as cargas opostas dos ligantes acoplados à resina e a proteína de interesse. 
No presente experimento, utilizou-se uma resina de troca aniônica, ou seja, 
uma resina cujos ligantes possuem carga positiva. 
 De acordo com a literatura (TOMOTANI&VITOLO 2006), o pI (ponto 
isoelétrico) da invertase situa-se na faixa de pH de 3,4 a 4,5. Portanto, para 
que ocorresse a adsorção da invertase, sua carga líquida foi direcionada a ser 
negativa. Para isso, utilizou-se o tampão de equilibro Acetato de Sódio 100mM 
com pH 5, o qual é maior que o ponto isoelétrico da invertase, proporcionando 
que a mesma assuma carga negativa e se adsorva aos ligantes positivos. 
 A amostra contendo o extrato bruto foi previamente filtrada em uma 
membrana de PVDF, com o auxílio de uma seringa, para retirar contaminantes 
maiores que poderiam prejudicar a integridade da resina e atrapalhar o 
processo cromatográfico. O loop do cromatógrafo possuía capacidade para 1 
mL, cooperando para a passagem cuidadosa do fluxo. 
O volume da coluna utilizada foi de 5,0 mL e os volumes utilizados no 
equilíbrio, lavagem e eluição foram, respectivamente, 3, 3 e 7 volumes de 
coluna, totalizando 65 mL. Além disso, alterou-se o fluxo de alimentação a cada 
etapa, sendo ele 1 mL/min para o equilibro; 0,2 mL/min para adsorção, na qual 
foi aplicada 1 mL da amostra de extrato bruto; 0,5 mL/min para lavagem; 0,85 
mL/min para eluição. 
O tampão A (acetato de sódio 100 mM em pH 5) foi o tampão de 
equilíbrio e adsorção; já o tampão B (acetato de sódio 100mM + 1M de NaCl 
em pH 5) foi o tampão de eluição, a qual foi feita em gradiente linear, já que era 
a primeira vez a ser feita essa cromatografia, logo não se sabia as 
concentrações dos tampões para eluição, sendo assim, não era possível 
utilizar o gradiente em passos. O resultado do processo cromatográfico está 
indicado no cromatograma obtidoa partir do equipamento AKTA Purifier®. 
 
Figura 3: Cromatograma obtido através da cromatografia de troca aniônica. 
 
Pode-se observar pela figura 3, que a amostra foi injetada no instante 0,0 
demarcado pela linha vertical na cor roxa. Inicialmente, ocorreu a formação de 
um platô que é caracterizado pela liberação de moléculas não adsorvidas. 
Após atingir a linha basal, em 25 minutos, iniciou-se a aplicação do tampão B, 
responsável pela eluição das moléculas retidas na coluna, em gradiente linear. 
O pico de lavagem, o qual se iniciou com 16 minutos e terminou com 24 
minutos, foi recolhido para posterior dosagem de proteína total e atividade 
enzimática da invertase. Neste pico saíram as moléculas que não adsorveram 
à resina. Logo após a lavagem, iniciou-se a aplicação do tampão B. 
Pode-se observar que, à medida que a concentração do tampão B 
aumentou, iniciou-se a formação de picos. Os primeiros dois picos da eluição 
não foram coletados, já que não havia detectado-os como picos. O terceiro pico 
da eluição foi coletado em 35,5 minutos até 36,6 minutos; o quarto foi em 35,6 
minutos até 39, 5 minutos; o quinto e maior pico foi coletado de 39,6 minutos 
até 43,5 minutos. 
A eluição das proteínas adsorvidas na resina ocorreu devido ao aumento 
da força iônica, proporcionado pelo 1 M de NaCl presente no tampão B. O pH 
se manteve, logo, não influenciou no processo de dessorção. Ao adicionar o 
tampão B, o sal NaCl, que entrou em contato com o meio aquoso, dissocia-se 
gerando cátions Na+ e ânions Cl-. Dessa forma, os íons Cl- competem com a 
proteína pela ligação à resina, além disso, tanto os cátions quanto os ânions, 
podem se ligar aos resíduos carregados da molécula alvo, favorecendo sua 
eluição. Portanto, com o aumento do gradiente de concentração do tampão B, 
as moléculas adsorvidas, foram eluídas. 
Nota-se que o último pico a ser traçado no cromatograma precisou de 
40% do tampão B para ser eluido. A não coletagem dos dois primeiros tubos 
trazem incertezas para a cromatografia, já que a molécula alvo invertase pode 
ter sido dessorvida nesses picos. 
É possível observar que os picos de eluição não possuem boa 
resolução, já que não têm adequada distância entre si; além disso, são 
espalhados e não, de fato, picos, dificultando até mesmo a definição do seu 
volume de eluição. Tais fatos podem ter acarretado na mistura das frações, 
prejudicando o processo de purificação e indicando que não ocorreu apropriada 
transferência de massa na cromatografia utilizada. Além disso, o processo 
pode não ter sido eficiente pela eluição ser ocasionada somente pela força 
iônica e não pela alteração de pH, para que a molécula alvo adquirisse carga 
oposta ao ligante e se dessorvesse da coluna. 
 
2.5. Dosagem de Proteína Total e Atividade Enzimática da Invertase 
Após a cromatografia de troca iônica realizada, deve-se realizar a 
dosagem de proteína total e novamente determinar a atividade enzimática, 
para posteriormente identificar em qual das frações eluídas se encontra a 
molécula alvo de interesse. 
 
Figura 4: SDS PAGE das amostras obtidas após cromatografia de troca iônica. 
A: Não Adsorvido, B: Amostra Inicial, C: Penúltimo Pico, D: Último Pico, E: Albumina 
66kDa, F: Padrão de Massa Molecular 
 
 O corante mais comumente utilizado para detectar proteínas em um gel 
é o Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBB). A coloração normalmente é feita 
com uma solução a 0.1 % de CBB em metanol:água:ácido acético glacial 
(45:45:10). A mistura ácido-metanol serve como um agente desnaturante que 
precipita e fixa as proteínas no gel, evitando que as proteínas sejam perdidas 
no processo de lavagem do gel. Quando se requer uma coloração mais 
sensível que detecte concentrações mais baixas de proteína, utiliza-se a 
coloração por prata. No processo de coloração o íon de prata (Ag+) é reduzido 
à prata metálica na proteína, onde a prata se deposita formando uma banda de 
cor marrom. A coloração por prata pode ser utilizada imediatamente após a 
eletroforese ou depois da coloração com CBB. A coloração por prata é pelo 
menos 100 vezes mais sensível que o CBB detectando proteínas em torno de 
0.001 ug (1 ng). Outros corantes utilizados são o Sypro Orange (30 ng) e Sypro 
Ruby (10 ng). (WILSON & WALKER, 2010) 
De acordo com o resultado obtido no gel, observa-se que o corante 
Coomassie Brilliant Blue G-250 não apresentou um bom desempenho. Isso 
acontece, pois provavelmente a concentração das proteínas utilizada foi muito 
baixa. Para albumina, por exemplo, foi adicionado apenas cerca de 10µg 
(1µg/1µL) e 10µL de tampão, resultando em uma concentração final de apenas 
1µg/µL, não sendo assim detectada pelo gel. 
A invertase existe em duas formas, proteína periplasmática glicosilada e 
proteína citosólica não glicosilada. A secreção de enzima localizada 
intracelularmente que corresponde à forma reprimida de invertase e um 
extracelular, contendo nove ou dez oligossacarídeos glicosilados ligados que 
corresponde à forma-reprimida de da enzima são regulados por repressão 
catabólica. A alta concentração de glicose no meio de cultura reprime 
completamente a produção da enzima, ao passo que a utilização de sacarose 
ou rafinose como fonte de carbono, permite desrepressão de síntese de 
invertase. Sabe-se que ambas estas enzimas são sintetizadas na matriz do 
mesmo gene estrutural e as suas porções de proteína tem uma massa 
molecular de 60 kDa (AAFIA ASLAM et al, 2013). 
 A invertase possui peso molecular de aproximadamente 60 kDa, como 
mencionado anteriormente, o que não foi identificado em nenhum pico retirado 
segundo o gel de eletroforese. Uma das possibilidades é que a enzima esteja 
em concentração muito baixa e não apareceu no gel. Porém, só foi detectada 
proteína na banda da amostra inicial, indicando que possivelmente houve 
algum erro de pipetagem no experimento ou toda proteína ficou adsorvida na 
coluna, o que é o menos provável. Deve-se repetir o experimento com maior 
atenção e cuidado. 
Após aplicar as proteínas no gel, realizou-se a leitura dessas amostras no 
espectrofotômetro (Tabela 6) e tornou-se possível calcular a concentração de 
proteínas por intermédio de um gráfico de ajuste linear que relaciona as duas 
grandezas (Figura 5). 
 
 
Tabela 6: Leitura das absorbâncias nas diferentes frações da Cromatografia 
Tubos Amostra Abs 540 nm 
1ª Amostra Inicial 0,495 
1B Amostra Inicial 0,651 
2A Não Adsorvido 0,073 
2B Não Adsorvido 0,094 
3A Pico Penúltimo 0,031 
3B Pico Penúltimo 0,032 
4A Pico último 0,026 
5A Pico último 0,032 
 Fonte: Próprio Autor. 
 
 
Figura 5: Curva de Calibração feita no dia 19 de Novembro de 2015. 
 
A equação da reta (y = 23,43133333x + 0,09311282) foi obtida após a 
linearização da curva, como mostrado na Figura 5. A partir da equação abaixo, 
é possível calcular a concentração de proteínas para cada amostra da 
purificação, uma vez que „y‟ é a média da absorbância obtida das amostras em 
duplicata através do método de Bradford e „x‟ é a concentração de proteína em 
cada amostra (Tabela 7). 
 
 
 
 
 (5) 
y = 23,43133333x + 0,09311282 
R² = 0,98732845 
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05
A
b
s 
(5
9
5
 n
m
) 
 
BSA (mg/mL) 
Tabela 7: Concentração de proteína em miligramas por microlitro nas amostras 
coletadas com base na curva padrão construída. 
Amostra 
Concentração de 
proteína total (mg/mL) 
Amostra Inicial 0,020480575 
Não adsorvido 0 
Pico penúltimo 0 
Pico último 0 
 Fonte: Próprio Autor. 
O método se baseiana observação de que o azul brilhante de Coomassie 
G-250 se converte da cor vermelha para azul após ligação à proteína. O 
complexo é formado rapidamente, permanece disperso em solução por um 
tempo relativamente longo, e tem um alto coeficiente de extinção, o que 
permite grande sensibilidade na dosagem das proteínas. 
Analisa-se pelos cálculos realizados, que nenhuma proteína saiu em 
nenhuma das frações (em nenhum dos picos e nem na fração não adsorvida). 
Neste caso, é necessário repetir o experimento, pois pode ser que as proteínas 
tenham ficado adsorvidas na coluna, ou não tenham sido pipetadas pelo grupo 
que realizou o experimento. 
Após realizar a dosagem de proteínas totais na amostra, fez-se a 
determinação da atividade enzimática, para identificação da Invertase nas 
frações. 
 
 
Figura 6: Preparação da amostra para dosagem enzimática após a cromatografia. 
Como mencionado anteriormente, na presença de um açúcar redutor, o 
DNS, é reduzido e apresenta uma cor laranja avermelhado. Utilizando a 
mesma curva padrão definida para primeira determinação de atividade 
enzimática, e através das leituras realizadas no espectrofotômetro (Tabela 8) 
foi possível calcular a concentração do açúcar redutor (Tabela 9). 
Tabela 8: Leituras das absorbâncias das amostras à 595 nm das amostras no 
espectrofotômetro. 
Amostra Abs 595 nm 
Último Pico 0 
Último Pico 0 
Penúltimo Pico 0,024 
Penúltimo Pico 0,035 
Não adsorvido 0,47 
Não adsorvido 0,496 
Amostra Inicial 3,783 
Amostra Inicial 3,693 
 Fonte: Próprio Autor. 
 
Tabela 9: Concentração em miligramas por mililitro nas amostras coletadas com base 
na curva padrão construída. 
Amostra 
Concentração de glicose 
(mg/mL) 
Pico último 0,002791735 
Pico penúltimo 0,008229537 
Não Adsorvido 0,091824229 
Amostra Inicial 0,691825825 
 Fonte: Próprio Autor. 
 
É possível observar que a cromatografia de troca iônica não foi eficiente 
nesse processo de separação e purificação da Invertase. A concentração de 
proteínas identificada na fração não adsorvida foi a maior, representando 
apenas de 13,3% da detectada na amostra inicial. O pico último e o pico 
penúltimo apresentaram, respectivamente, 0,4% e 1,2%, uma porcentagem 
muito irrisória. 
 A proteína de interesse pode ter sido desnaturada ou se encontrar 
inativa após passar pela coluna, ou então, pode ter ficado ainda adsorvida na 
coluna, as condições usadas para eluição podem não ter sido suficientes para 
causar a desorção da proteína. Além dessas opções, pode ter ocorrido algum 
erro de pipetagem ou no procedimento, como por exemplo, não houve a coleta 
dos primeiros picos. 
 Com a segunda suposição, deve-se tentar utilizar outras condições de 
eluição e analisar o resultado. Caso ainda não tenha atividade enzimática em 
nenhum dos picos e a atividade no não adsorvido permaneça baixa, deve-se 
analisar as condições utilizadas em todo o processo e as características da 
enzima novamente. 
 
Tabela 10: Dados para preparação das amostras para posterior leitura destas no 
espectofotômetro. 
Amostra 
Solução de 
Sacarose 
Tampão 
acetato 
Amostra DNS H2O 
Amostra Inicial 300 µL 1,5 µL 200 µL 500 µL - 
Amostra Inicial 300 µL 1,5 µL 200 µL 500 µL - 
Não Adsorvido 300 µL 1,5 µL 200 µL 500 µL - 
Não Adsorvido 300 µL 1,5 µL 200 µL 500 µL - 
Penúltimo Pico 300 µL 1,5 µL 200 µL 
 
- 
Penúltimo Pico 300 µL 1,5 µL 200 µL 
 
- 
Último Pico 300 µL 1,5 µL 200 µL 500 µL - 
Último Pico 300 µL 1,5 µL 200 µL 500 µL - 
Branco 300 µL 1,5 µL - 500 µL 200 µL 
Branco 300 µL 1,5 µL - 500 µL 200 µL 
Fonte: Dados informados pelo protocolo dado em sala de aula. 
 
A atividade enzimática da Invertase para essas frações foi calculada 
conforme a expressão 3 citada anteriormente, e a partir das soluções 
preparadas conforme tabela 10, e está expressa na tabela 11, onde se pode 
comprovar as discussões já feitas acima. 
 
 
Tabela 11: Atividade Enzimática encontrada em todas as frações após a cromatografia 
de troca iônica. 
Amostra Atividade Enzimática (UA) 
Último Pico 0 
Penúltimo 
Pico 
0,000296365 
Não adsorvido 0,004852348 
Amostra Inicial 0,037552956 
 Fonte: Próprio Autor. 
 
 
A tabela de purificação da invertase está representada abaixo. 
 
 
Tabela 12: Processo de purificação da invertase. 
Etapa Volume 
(mL) 
AE Específica 
(Units/mg) 
AE total 
(Units) 
Rendimento% 
Fator de 
Purificação 
Proteína 
(mg/mL) 
Proteína 
Total (mg) 
Extrato Bruto 1 0,037553 0,000769 100 1 0,020481 0,020481 
Cromatografia – 
não adsorvido 
4 0,004852 0 0 0,129 0 0 
Cromatografia – 
pico último 
2,98 0 0 0 0 0 0 
Cromatografia – 
pico penúltimo 
2,55 0,000296 0 0 0,008 0 0 
Fonte: Próprio Autor. 
 
Observa-se que a tabela de purificação apresentou falhas significativas 
na dosagem de proteína total e/ou determinação da atividade enzimática. Além 
disso, não foram recolhidos os dois primeiros picos como mencionado 
anteriormente, o que aumentou ainda mais o erro experimental. Constata-se 
uma inconsistência no relatório, onde não foi encontrado nenhuma proteína ao 
realizar o método de Bradford, e foi encontrada atividade enzimática em 
algumas frações ao determinar a atividade enzimática. Provavelmente houve 
erro experimental ao realizar o protocolo, erro de pipetagem ou ainda erro no 
manuseio do espectrofotômetro. Recomenda-se refazer todos os 
procedimentos experimentais com maior atenção e com apenas um grupo, a 
fim de minimizar os erros. 
 
 
3. Conclusão 
A Invertase é uma importante enzima para o meio industrial devido, 
principalmente, à produção de açúcar invertido. O processo de purificação 
realizado pode ser melhorado realizando a precipitação por solvente, ao invés 
da precipitação com sulfato de sódio, além de refazendo a cromatografia. 
Deve-se atentar ao realizar a dosagem de proteína total e atividade enzimática, 
para que as mesmas sejam mais precisar e coerentes. 
Observou-se que o rompimento foi a etapa mais eficiente do processo 
realizado na prática e que a precipitação por sal não foi uma boa etapa de 
clarificação. Percebeu-se também a importância dos processos de separação e 
purificação para a atuação do Engenheiro de Bioprocessos o qual deve sempre 
ter uma visão crítica e buscar conhecimentos teóricos antes de realizar 
qualquer procedimento experimental. 
 
4. Referências Bibliográficas 
AAFIA ASLAM*, IKRAM-UL-HAQ AND SIKANDER ALI. Purification 
and characterization of two invertases from mutant strain of 
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