relatório 4 Extração de DNA genômico

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Introdução:
O DNA (ácido desoxirribonucleico) são moléculas encontradas no núcleo ou na região nucleóide da célula, sendo que também são encontradas nas mitocôndrias e nos cloroplastos, esta molécula foi descoberta por volta de 1969 por Johann Friedrich Miescher. Ele é o responsável por todas as informações genéticas necessárias para criação de um organismo, ele controla toda a atividade celular que é transmitida de geração em geração. O DNA se constitui de nucleotídeos, esses nucleotídeos são polímeros constituídos de uma molécula de açúcar com cinco carbonos (pentose), um fosfato (mais especificamente, ácido fosfórico) e uma base nitrogenada. No caso do DNA, o açúcar referido se trata da desoxirribose e as bases nitrogenadas, que podem ser púricas ou pirimídicas, são a adenina, guanina, citosina e a timina. Nesse sentido, as duas primeiras são as púricas e as duas últimas as pirimídicas (ALBERTS,2010).
O DNA ou material genético contém a informação crucial para a hereditariedade, determinando o fenótipo dos indivíduos. A descoberta da sua estrutura representa um marco no desenvolvimento da biologia dos últimos dois séculos, contribuindo para avanços significativos no melhoramento de organismos vivos e no entendimento de processos biológicos (ARIAS, 2004).
Atualmente existem vários protocolos de extração de DNA e RNA descritos na literatura, a escolha do método mais eficiente depende da molécula desejada (DNA e/ou RNA), o grau de pureza, a amostra, o rendimento desejado além de recursos para a realização da mesma (MESQUITA; OLIVEIRA; NUNES; 2001). Neste trabalho utilizou-se o método de extração de DNA vegetal, usando a técnica do maceramento para quebrar a parede celulósica da banana.
Objetivos:
Extrair o material genético (DNA) de origem vegetal através da execução de uma técnica de extração simplificada, relacionando as atividades aos conhecimentos teóricos sobre nucleicos discutidos em aula teórica.
Materiais:
	Água
	Dois copos ou béqueres de vidro
	Saco plástico de cozinha
	Álcool etílico 95% gelado
	Bananas frescas
	Sal de cozinha
	Bastão de vidro
	Palito de madeira ou espátula plástica
	TE ph 7,0 ou solução salina-citrato ph 7,0
	Detergente de cozinha
	Peneira ou coador
	
Procedimentos:
Selecionou-se meia banana. Retirou-se a casca da banana;
Colocou-se a fruta dentro de um saco plástico e a macerou, pressionando-a com os dedos até obter uma pasta quase homogênea (figura 1). Transferiu-se a pasta de frutas para um copo ou béquer. 
Figura 1- Pasta homogênea:
Em outro copo ou béquer misturou-se 150 ml de água, uma colher (sopa) de detergente e uma colher (chá) de sal de cozinha. Mexeu-se bem com o bastão de vidro, porém devagar para não fazer espuma.
Colocou-se uma peneira sobre um copo ou béquer limpo e passou-se a mistura pela peneira para retirar os pedaços de fruta que restaram.
Incubou-se em temperatura ambiente por 30 minutos. Mexeu-se eventualmente com o mesmo bastão.
Colocou-se uma peneira sobre o copo ou béquer limpo e passou-se a mistura pela peneira para retirar os pedaços de fruta que restaram (figura 2).
Figura 2-Usando a peneira para filtrar os pedaços maiores de banana:
Colocou-se metade do líquido peneirado em um tubo de ensaio, preenchendo no máximo “três dedos” de altura a partir do fundo do tubo.
Adicionou-se delicadamente, pela parede do tubo, duas vezes o volume de líquido de álcool comum. Não se misturou o álcool com a solução. Aguardou-se três minutos para o DNA começar a precipitar entre as fases de líquido e álcool (Figura 3).
Figura 3- Álcool sendo adicionado na solução filtrada:
Usou-se um palito de vidro, plástico ou madeira para enrolar o DNA. Girou-se o palito entre as fases.
Retirou-se o DNA e colocou-se em um microtubo plástico identificando com 0,5 ml de TE, solução salina-citrato ou água. Armazenou-se a -20 °C.
Resultados:
Como o DNA não é solúvel em álcool, isso permitiu o seu isolamento. O detergente quebrou a membrana para que as proteínas e o DNA se soltasse e se dispersasse na solução. O sal usado no começo possibilitou que as moléculas de DNA aparecessem no final dessa prática através da precipitação das proteínas (figura 4).
Figura 4- Pode-se observar as moléculas de DNA flutuando sobre o líquido: 
 
Discussão:
A banana precisou ser macerada para que os produtos químicos utilizados para a extração chegassem mais facilmente em todas as suas células. Ao esmagar a banana foi rompida a parede celular, sendo esse um passo importante para a extração do DNA, pois rompeu as células e as membranas. Logo após colocamos a solução de detergente porque como as membranas são lipídicas os detergentes agem sobre as moléculas de lipídio, fizeram com que as biomembranas se rompessem deixando o DNA solto no líquido pois antes o DNA estava preso nas membranas. Depois coamos para separar tudo que era resto da célula que não queríamos por ser muito grande, sobrando o líquido onde estava solto o DNA. Usamos o álcool para separar o DNA dos outros componentes, como o DNA é insolúvel em álcool, formou-se assim uma aglomeração de moléculas, portanto o álcool permite o isolamento do DNA. Pudemos ver várias moléculas de DNA meio que em formato de fio, porque as proteínas ao redor foram retiradas deixando-a linear, sem poder ver a dupla hélice porque o diâmetro de uma dupla hélice de uma molécula de DNA é medido em angstrom, precisaríamos de um microscópio eletrônico para podermos vê-la. O DNA genômico é formado por moléculas muito longas lembrando que cada cromossomo é formado por uma única molécula de DNA. Sendo assim é praticamente impossível extrair o DNA sem que inúmeras quebras mecânicas ocorram durante os procedimentos de extração. A função do sal proporcionou o DNA um ambiente favorável, pois o sal contribuiu com os íons positivos que neutralizaram a carga negativa do DNA, para que assim as numerosas células de DNA pudessem coexistir na solução, através da precipitação das proteínas.
Conclusão:
Ao realizarmos essa prática pudemos concluir com êxito a existência do DNA na banana. Ao macerar a banana quebramos suas proteínas, fazendo com que o álcool tivesse papel fundamental no isolamento do DNA, quando adicionamos o detergente a membrana foi quebrada e seus conteúdos celulares juntamente com o DNA e as proteínas se soltaram e se dispersaram na solução. A adição de sal proporcionou ao DNA um ambiente favorável, pois contribuiu com íons positivos Na+ que neutralizaram a carga negativa do DNA, assim fazendo com ele se precipitasse. Apesar do DNA ser a maior molécula da célula, a sua estrutura não pode ser observada a olho nu por ser muito pequena, mas podemos observar como verificamos na prática, várias cadeias de DNA aglomerados. 
Referências:
ALBERTS, B. et al. Biologia Molecular da Célula. 5ª Edição. Editora Artmed.2010
ARIAS, G. Em 1953 foi descoberta a estrutura do DNA. Etapas de um grande avanço científico. EMBRAPA. ISSN 1518-6512. 2004.
MESQUITA, R. A.; ANZAI, E. K.; OLIVEIRA, R. N.; NUNES, F. D. Avaliação de três métodos de extração de DNA de material parafinado para amplificação de DNA genômico pela técnica da PCR. v. 15, n. 4, p. 314-319, out./dez. 2001.
Universidade Estadual do Rio Grande do Sul-UERGS
Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia
Disciplina Bioquímica I
Prática IV:
EXTRAÇÃO DNA GENÔMICO
2017