RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA IDENTIFICAÇÃO DE MICRORGANISMOS

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UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO
DEPARTAMENTO DE SAÚDE
RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA
IDENTIFICAÇÃO DE MICRORGANISMOS
 
 Ana Carolina – RA 
 Barbara - RA 
 Sirlene – RA 
 
Curso: Farmácia e Bioquímica
 Período: noturno/Turma: 7º A
 Disciplina: Microbiologia Clínica
 Professor(a): Clédja Amorim Castro
São Paulo
2016
Introdução: Enterobactérias 
São uma família de bacilos Gram-negativos, anaeróbios facultativos, não esporulados. Embora possam ser encontradas amplamente na natureza, a maioria habita os intestinos do homem e dos animais, seja como membros da microbiota normal ou como agentes de infecção.
A diferenciação dos gêneros e espécies é realizada por meio de uma série de provas bioquímicas. Algumas espécies, em um mesmo gênero, são muito semelhantes, sendo necessário grande número de provas para diferencia-las. Entretanto, este problema não cria dificuldades de ordem prática, uma vez que a diferenciação entre as espécies é dispensável, sob o ponto de vista médico, na maioria das vezes.
O diagnóstico das infecções por enterobactérias é normalmente realizado através do isolamento e identificação. Para o diagnóstico de algumas doenças como por exemplo febre tifoide, recorre-se também à pesquisa de anticorpos anti-O e anti-H.
A identificação de uma enterobactéria é normalmente feita por meio de provas bioquímicas, seguidas ou não de provas sorológicas. Em se tratando de enterobactéria enteropatogênicas, as provas bioquímicas são sempre acompanhadas de provas sorológicas, seja para confirmar a identificação bioquímica ou para diferenciar os sorogrupos e sorotipos. Quando a infecção é causada por uma enterobactéria não enteropatogênica, sua identificação é feita apenas por meio de provas bioquímicas, exceto quando se isola  as salmonellas, tíficas e paratíficas.
A maioria das enterobactérias é normalmente sensível às ampicilinas, cefalosporinas, aminoglicosídeos, tetracilinas, cloranfenol, cotrimoxazol e ao ácido naxilídico. A principal forma de resistência das enterobactérias é mediada por fatores R, com exceção da resistência ao ácido nalidíxico que é determinada por mutação. Aparentemente, os fatores R não transportam genes de resistência para este antimicrobiano. A resistência adquirida pelas enterobactérias é geralmente múltipla, isto é, torna a bactéria simultaneamente resistente a vários antimicrobianos.
Atualmente, as enterobactérias são os germes mais freqüentemente isolados de processos infecciosos, representando em torno de 70 a 80%  das amostras de germes gram-negativos isolados em rotina de laboratório. A freqüência dos diferentes gêneros e espécies é fortemente influenciada pelo local onde a infecção foi adquirida, isto é, se na comunidade  ou no hospital.
Quanto às enterobactérias patogênicas, algumas são adquiridas predominantemente na comunidade e outras em hospitais.
Espécies mais comuns
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
Klebsiella oxytoca
Proteus mirabilis
Enterobacter spp
Salmonella ( sorotipos)
Serratia marcescens
Citrobacter spp
Meios de Cultura
Enterobactérias crescem em meios básicos, meios enriquecidos e meios seletivos (para bacilos Gram negativos). O crescimento dos microrganismos nos diferentes meios de cultura utilizados fornece as primeiras informações para a sua identificação. É importante conhecer o potencial de crescimento de cada meio de cultura e adequar ao perfil bacteriano esperado para cada material. 
Ágar Mac Conkey (fermentação da Lactose)
Rugai
Meios presuntivos
IAL (Pessoa e Silva) 
EPM-MILI
TSI
OBJETIVO
Identificação de enterobactérias em gêneros ou espécies, através da utilização de meios de cultura especiais que possibilitam a verificação da presença de enzimas bacterianas relacionadas ao metabolismo de vários substratos
MATERIAIS E MÉTODOS
PLAQUEAMENTO SELETIVO
É a etapa de isolamento bacteriano a partir do espécime clínico, utilizando meios seletivo-indicadores como o Agar EMB. A presença dos corantes eosina amarela e azul de metileno inibem as bactérias Gram positivas. Ao prepararmos este meio, a eosina e o azul de metileno reagem e formam o eosinato de azul de metileno (sal). As bactérias Gram negativas que fermentam lactose (LAC+) e, consequentemente, produzem ácidos que dissociam este sal, apresentando-se como colônias rosa-avermelhadas com ou sem um centro negro, devido ao azul de metileno, enquanto as não fermentadoras (LAC-) formam colônias transparentes. Usou-se também o Agar McConkey, um meio seletivo para bactérias Gram negativas, onde as colônias fermentadoras (LAC+) ficam de cor rosa e as colônias não fermentadoras (LAC-) ficam transparentes. 
CONFIRMAÇÃO BIOQUÍMICA
É um conjunto de provas bioquímicas necessárias para a identificação das colônias suspeitas. Serão utilizados os meios abaixo. Estes meios totalizam oito testes que somados ao da fermentação da lactose permitem identificar com fidelidade a grande maioria das enterobactérias isoladas em espécimens clínicos.
Meio EPM
O meio EPM contém os testes de fermentação e produção de gás a partir de glicose, produção de H2S, hidrólise da uréia e desaminação de triptofano.
B) Meio MILi
O Meio MILi contém os testes de motilidade, indol e descarboxilação de lisina.
C) Citrato de Simons
Este teste permite identificar espécies que utilizam citrato como única fonte de carbono.
2.1) Fundamento teórico:
Hídrólise da uréia: Este teste verifica a habilidade de um microrganismo em utilizar a uréia, formando duas moléculas de amônia pela ação da enzima urease (uréia 2 NH3 + CO2 + H2O). 
Motilidade: O teste visa verificar se a bactéria é móvel ou imóvel. Logo pode ajudar na diferenciação de alguns gêneros como por exemplo Enterobacter (usualmente +) e Klebsiella (-). A mobilidade das bactérias é proporcionada pela presença de um ou mais flagelos. As bactérias imóveis não possuem flagelos.
Produção de indol: Este teste tem como princípio determinar a habilidade de um microrganismo em produzir indol a partir da molécula de triptofano. Pode ajudar na diferenciação de alguns gêneros de bactérias como, por exemplo: E. coli (usualmente +) do grupo Klebsiella-Enterobacter (-).
Citrato de Simmons: Este teste visa determinar se um microrganismo é capaz de utilizar citrato como uma única fonte de carbono para o seu metabolismo, resultando em uma alcalinidade no meio. As bactérias citrato positivas crescem usando sais de amônia como fonte de nitrogênio, liberando amônia e conseqüentemente deixando o meio alcalino. O indicador de pH é o azul de bromotimol, que em meio ácido fica amarelo e em meio básico, azul.
Produção de H2S: Este teste visa determinar a capacidade de produção de íons S-2 a partir do metabolismo bacteriano.
Produção de gás: Este teste visa determinar a capacidade de produção de gás CO2 a partir da fermentação da glicose.
Descarboxilação de lisina: Este teste visa determinar a capacidade de descarboxilar a lisina, por ação da enzima lisina descarboxilase.
2.2) Procedimento:
	Tocar a colônia com agulha bacteriológica e semear os 3 meios na seguinte ordem: Citrato, EPM e MILi. Para inocular o meio de citrato deslizar a agulha pelo centro estriando toda a superfície inclinanda. No meio EPM introduzir a agulha até o fundo do tubo e ao retirá-la semear a superfície do meio enquanto o MILi deve ser semeado por picada central que deve atingir o fundo do tubo.
2.3) Leitura e interpretação:
A) Meio EPM:
Produção de gás: Aparecimento de bolhas ou deslocamento do meiode cultura do fundo do tubo.
Produção de H2S: Enegrecimento do meio em qualquer intensidade.
Hidrólise da uréia: Aparecimento de cor azul ou verde azulada (reação fraca) que se estende para a base do meio, envolvendo-a totalmente ou não.
Desaminação do triptofano: Aparecimento de cor verde-garrafa na superfície do meio.
B) Meio MILi
Motilidade: 	A bactéria móvel cresce além da linha de picada. A imóvel somente nesta linha.
	Resultado
	Cor do meio
	Positivo (+)
	Crescimento fora do local da picada
	Negativo (-)
	Crescimento ao redor da picada
 
Descarboxilação da lisina: Quando a lisina é descarboxilada o meio adquire cor púrpura acentuada ou discreta. Quando o aminoácido não é utilizado, o meio adquire cor amarelada nos seus 2/3 inferiores. Considerar o teste positivo sempre que o meio não estiver amarelo. 
Produção de indol: Adicionar 3 gotas a 4 gotas do reativo de Kovacs à superfície do meio e agitar levemente. Quando a bactéria produz indol, o reativo adquire cor rosa ou vermelha. Quando não produz, o reativo mantém sua cor inalterada.
	Resultado
	Cor do reagente
	Positivo (+)
	Rosa
	Negativo (-)
	Amarelo
C) Meio Citrato de Simmons
			A utilização do citrato revela-se pelo aparecimento de cor azul na superfície do meio. O teste deve ser considerado negativo quando a cor do meio não sofre alteração.
	Resultado
	Cor do meio
	Positivo (+)
	Azul
	Negativo (-)
	Verde
Resultados:
A partir da cultura em meio ágar macconkey, tirou-se uma pequena amostra das duas colônias de bactérias para que o teste de coloração de Gram pudesse ser realizado, as duas colônias apresentaram coloração rosa, sendo assim, são Enterobactérias Gram Negativo Lac positivo, sendo assim, fermentou a lactose, um carboidrato. Após a coloração, foi realizado o teste do Tubo EDM, Tubo Citrato e Tubo Mili, tendo os seguintes resultados:
	Testes
	Resultado
	Padrão
	Oxidase
	positivo
	apresentou coloração rosa
	Tubo EDM
	
	
	Urease
	negativo
	permaneceu a coloração verde
	Glicose
	positivo
	apresentou bolhas
	H2S
	negativo
	não apresentou coloração preta
	Tubo Mili
	
	
	Indol
	positivo
	apresentou coloração "cereja"
	Mobilidade
	negativo
	não apresentou mobilidade
	Lisina
	positivo
	apresentou coloração "roxa"
	Tubo de Citrato
	negativo
	permaneceu a coloração verde
Conclusão:
As bactérias Gram negativas que fermentam lactose (LAC+) apresentando-se como colônias rosa-avermelhadas com ou sem um centro negro, devido ao azul de metileno, enquanto as não fermentadoras (LAC-) formam colônias transparentes. Para a confirmação bioquímica, foram utilizados testes, um conjunto de provas bioquímicas necessárias para a identificação das colônias suspeitas. Estes meios totalizam oito testes que somados ao da fermentação da lactose permitem identificar com fidelidade a grande maioria das enterobactérias isoladas. 
O meio EPM contém os testes de fermentação e produção de gás a partir de glicose, produção de H2S, hidrólise da ureia e desaminação de triptofano:
Hidrólise da ureia verifica a habilidade de um microrganismo em utilizar a ureia, formando duas moléculas de amônia pela ação da enzima uréase:
 (uréia 2 NH3 + CO2 + H2O);
Produção de H2S: este teste visa determinar a capacidade de produção de íons S-2 a partir do metabolismo bacteriano;
Produção de gás: este teste visa determinar a capacidade de produção de gás CO2 a partir da fermentação da glicose.
 O Meio MiLi contém os testes de motilidade, onde a bactéria móvel cresce além da linha de picada. A imóvel somente nesta linha, indol e descarboxilação de lisina. 
Produção de indol: este teste tem como princípio determinar a habilidade de um microrganismo em produzir indol a partir da molécula de triptofano. Pode ajudar na diferenciação de alguns gêneros de bactérias como, por exemplo: E. coli (usualmente +) do grupo Klebsiella-Enterobacter (-);
Descarboxilação de lisina: Este teste visa determinar à capacidade de descarboxilar a lisina, por ação da enzima lisina descarboxilase. 
O teste de Citrato permite identificar espécies que utilizam citrato como única fonte de carbono para o seu metabolismo, resultando em uma alcalinidade no meio. As bactérias citrato positivas crescem usando sais de amônia como fonte de nitrogênio, liberando amônia e conseqüentemente deixando o meio alcalino. O indicador de pH é o azul de bromotimol, que em meio ácido fica amarelo e em meio básico, azul.
Com os resultados em mão pode-se concluir que a colônia de bactéria analisada é de E. coli, a E. coli assume a forma de um bacilo e pertence à família das Enterobacteriaceae. São aeróbias e anaeróbias facultativas. O seu habitat natural é o lúmen intestinal dos seres humanos e de outros animais de sangue quente. Possui múltiplos flagelos dispostos em volta da célula.  Algumas espécies são tão similares ao Shigella e tão diferentes entre si que alguns biólogos recomendam que ambos sejam reclassificados.
Referências:
https://pt.wikipedia.org/wiki/Escherichia_coli (acesso em 01/05 às 16:30);
http://www.ebah.com.br/content/ABAAAfPOwAD/identificacao-bacterias (acesso em 02/05 às 18:40)