Reagentes Marcados AULA

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Testes utilizados em 
Imunologia Clínica – 
Testes de Reagentes Marcados 
 
Profa Alessandra Xavier Pardini 
Imunologia Clínica 
• Alta sensibilidade 
• Boa especificidade 
• Direta – detecção de Antígeno 
• Indireta – detecção de Anticorpo 
• Competição – amostra compete com reagente marcado 
• Custo mais alto – produção dos reagentes 
• Permitem automação completa ou não 
• Permite detectar anticorpo de uma classe específica que sejam 
específicos para um determinado antígeno 
• Reagente marcado – Ag ou Ac 
• Sistema heterogêneo – lavagem – retira reagente não ligado 
Reagente marcado 
• Marcação não modifica interação Ag-Ac. 
• Alto custo. 
• Permite detecção de classes específicas de anticorpo para um 
determinado antígeno. 
• Tipo de marcador determina nome do teste. 
 
MARCADOR 
• Radioisótopo = RADIOIMUNOENSAIO 
• Fluorocromo = IMUNOFLUORESCÊNCIA 
• Enzima = ELISA, IMUNO-DOT, WESTERN BLOT 
Radioimunoensaio 
- Primeira técnica com reagente marcado. 
- Desenvolvido em 1956 – detecção de Ac anti-insulina em 
pacientes tratados com o hormônio. 
- Radioisótopos - I125 ou I131 – ligação a resíduos de tirosina em 
proteínas. 
- Vantagens: quantitativo, rapidez, precisão, limiar de detecção 
em nano ou picogramas. 
- Desvantagens: alto custo do teste, vida média dos reagentes e 
risco operacional – radiosótopos. 
- Uso: Ag e Ac, marcadores tumorais, hormônios. 
Princípio 
• quantidade de reagente marcado (radioativo) quantifica o Ag ou Ac não 
marcado presente na amostra através de ligação específica. 
• medida da resposta - contagem radioativa - tipo de radiação emitida. 
• radiações  e  - contador de cintilação. 
• radiação  - contador gama de cristal sólido. 
 
Realizado em 3 estágios 
Estágio 1 – construção da curva de calibração – diluição seriada do padrão 
Estágio 2 – interpolação dos resultados 
Estágio 3 – controle de qualidade (amostras com [ ] conhecida) 
- Interferente: fração não ligada. 
- Deve-se realizar a remoção da fração não ligada ou adotar sistema com 
fase sólida. 
- Fase sólida – matrizes particuladas (celulose e agarose) ou superfície 
contínua (tubos, discos e placas)‏. 
Ac + 
traçador + 
Ag da 
amostra 
carbono 
PEG 
Tipos de Radioimunoensaio 
Contador de radiação gama 
cintiladores 
IMUNOFLUORESCÊNCIA 
Princípio: 
• Baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpo se 
ligarem covalentemente a fluorocromos sem perder sua 
reatividade específica com o antígeno. 
 
Fluorocromos 
- São substâncias que, absorvem luz de um comprimento de onda 
menor quando excitados com luz UV, emitem luz em comprimento 
de onda maior (fluorescência). 
- Características: estabilidade, grande capacidade de absorção, 
absorção e fluorescência de luz no espectro visível, nenhuma 
interferência com a reação imunológica. 
Fluorocromos 
Anticorpos + fluorocromos - reatividade específica com o Antígeno 
 
 Excitação (nm) Emissão (nm)‏ 
Fluoresceína FTIC 495 524 
Texas Red 595 620 
R-ficoeritrina 565 574 
 
- Desvantagens: custo do equipamento, sensibilidade limitada. 
- Dificuldade de automação. 
- Vantagens: específica e reprodutível. 
- Tipos – direta, indireta e citometria de fluxo 
Cuidados: 
• Padronização adequada do conjugado fluorescente (titulação). 
• Treinamento do pessoal que realizará a leitura, sendo subjetiva, deve ser 
padronizada para evitar erros que super ou subestimem a fluorescência. 
 
Reagentes necessários 
• Ac marcados – alta especificidade – poli ou monoclonais. 
• Ag ou amostras fixas em lâmina de vidro. 
• Glicerina alcalina – pH 8,5 – montagem da com lamínulas – melhoram a 
intensidade da emissão de fluorescência. 
• Azul de Evans ou vermelho Congo – corantes de fundo – melhoram a 
visualização da fluorescência. 
• Lâmina de sílica não fluorescente e de espessura mínima. 
 
 
São fatores que interferem na imunofluorescência: 
• a qualidade do vidro/lâmina/lamínula. 
• qualidade e tratamento dos Ag fixados antigenicidade e 
acessibilidade. 
• temperaturas e tempo de incubação. 
• lavagens adequadas. 
• montagem da preparação em glicerina alcalina. 
• microscópio perfeitamente calibrado e limpo. 
• corantes: diminuem a coloração de fundo, facilitando a leitura da 
fluorescência (azul de Evans).‏ 
 
Microscópio 
- fonte de luz de alta intensidade 
- lâmpada de mercúrio ou halogênio 
- filtros de excitação (ativam a fluorescência)‏ 
- filtros de barreira (remover interferentes)‏ 
- microscópios de transiluminação 
- microscópios de epiiluiminação (apresentam a vantagem de 
combinar a luz transmitida para exame de contraste de fase, 
análise da amostra em diferentes comprimentos de onda, no 
caso de utilização de mais de um fluorocromo) (a luz UV não 
tem chance de atravessar a ocular)‏ 
 
Microscópio de imunofluorescência com epiluminação 
Filtro de excitação 
lâmina 
Fluorescência 
emitida 
Filtro de 
emissão 
Fonte de luz 
branca 
câmera 
Fibra óptica 
Fibra 
óptica 
Microscópio de imunofluorescência automatizado 
Reações de Imunofluorescência 
• Reação de Imunofluorescência direta 
• Reação de Imunofluorescência indireta 
• Reação de Imunofluorescência de captura 
• Reação de Imunofluorescência amplificada com complemento 
• Reação de Imunofluorescência amplificada com sistema 
avidina-biotina 
Imunofluorescência direta 
• Conjugado - Ac marcado com fluorocromo. 
• Vantagens: alta sensibilidade e especificidade, possibilidade de localizar 
componentes intracelulares com fluorocromos contrastantes. 
• Desvantagens: um conjugado para cada antígeno. 
• Uso: imunohistoquímica – doenças renais e de pele. 
célula 
Conjugado 
fluorescente 
Adenocarcinoma de glândula salivar humana 
http://www.olympusmicro.com/galleries/fluorescence/pages/adenocarcinomahumansmall.html 
ITCF 
diiodeto de 
propídio 
http://www.olympusmicro.com/galleries/fluorescence/pages/hivinfectedcellssmall.html 
Linfócitos infectados com HIV 
ITCF 
Imunofluorescência Indireta 
• Conjugado Ac antiimunoglobulina específico para as diferentes 
classes de anticorpos. 
• Diluições seriadas – título de Ac – máxima diluição onde há 
fluorescência. 
• Vantagens: sensível, específica, reprodutível , fácil, padronizada, 
mesmo conjugado determina Ac produzidos em diferentes 
doenças. 
• Desvantagens: custo do microscópio, subjetividade na leitura e 
dificuldade de automação. 
Uso: 
• Detecção de anticorpos para Treponema pallidum (FTA-ABS), 
Toxoplasma gondii, vírus da rubéola, citomegalovírus, vírus herpes 
simples, Trypanosoma cruzi, Plasmodium falciparum, auto-anticorpos. 
Conjugado 
fluoresncente 
Anticorpo 
primário 
Citosol 
Anticorpo 
Antígeno 
Reação primária 
Reação secundária 
Conjugado Anticorpo FITC 
lavagem 
lavagem 
Microscópio de fluorescência 
Fluorescência indireta para Sífilis 
Fluorescência indireta para Chagas 
Fluorescência indireta para HIV 
Citometria de fluxo 
Princípio: 
• Análise individual e simultânea de componentes celulares através da 
medição do desvio de luz incidente sobre uma célula e de sinais 
fluorescentes emitidos pela mesma. 
• Vantagens: permite detecção do tamanho relativo da célula, sua 
granulação e de 2 a 7 emissões fluorescentes diferentes em milhares 
de células por segundo. 
• Desvantagens: alto custo, necessidade de treinamento. 
• Váriosfluorocromos. 
• Uso: imunofenotipagem de linfócitos do sangue periférico de pacientes 
infectados pelo HIV, diagnóstico e prognóstico de leucemias 
Suspensão 
de mistura 
de células 
Conjugado 
fluorescente 
Feixe de laser 
Detector 
Defletor 
Células não- 
fluorescentes 
Células 
fluorescentes 
• Espalhamento de luz incidente pode ser de 2 tipos: 
• baixo ângulo de dispersão – tamanho das células. 
• ângulo de dispersão de 90o – granulação das células. 
• Fluorescência emitida por cada fluorocromo é detectada por 
fotodetectores e convertida em sinais processados, quantificados e 
analisados por um computador. 
• Sinais de luz emitidos pelos fluorocromos são detectadas por um 
sistema de canais, originado histogramas 
Técnicas imunoenzimáticas 
• Ac ou Ag marcados com enzimas – conjugado 
ENZIMA 
• elevada especificidade. 
• fácil de ser obtida na forma purificada. 
• conjugação a Ag e Ac – sem interferências. 
• produto de reação com substrato – fácil de ser quantificado, 
mesmo com pequenas quantidades de enzima. 
• Estável. 
• Custo acessível. 
• Diferentes tipos – fosfatase alcalina, peroxidase. 
• Determina o tipo de substrato. 
SUBSTRATO CROMOGÊNICO 
• ao serem consumidos por enzimas geram produtos coloridos solúveis ou 
insolúveis. 
• quantificação do produto – espectrofotômetro, cor visual ou comparação 
com padrão. 
• depende do tipo da enzima utilizada. 
Substrato 
Produto 
colorido 
solúvel ou 
insolúvel 
PEROXIDASE 
 - substrato H2O2 ligado a um cromógeno 
 - cromógeno com produto solúvel - OPD ou TMB 
 - cromógeno com produto insolúvel - DAB ou 4-cloro-1-naftol 
 
FOSFATASE ALCALINA 
 - cromógeno com produto solúvel - NPP 
 - cromógeno com produto insolúvel – BCIP ou NBT 
450 
amarelo 
lilás 
P-NFF 
5-B-4-C-3-IF 
Fosfatase 
alcalina 
492 
laranja, azul 
marrom, violeta 
OPD, TMB 
DAB, 4CN 
H2O2 Peroxidase 
nm cor cromógeno substrato enzima 
SUBSTRATO FLUORIGÊNICOS 
• emitem luz fluorescente após serem consumidos pela enzima. 
• quantificação da luz emitida pelo produto – fluorômetro. 
FATASE ALCALINA 
• 4-metilumbeliferil-fosfato que gera um fluoróforo 
(4-metilumbeliferona)‏ 
 excitação 
Emissão 
 
Fluorescência 
SUBSTRATO QUIMILUMINESCENTE 
• amplificação de sinal - hormônios e marcadores tumorais. 
• emitem brilho após serem consumidos pela enzima. 
• quantificação do brilho emitido pelo produto – luminômetro. 
FOSFATASE ALCALINA 
• adamantildioexietano-fosfato que gera um ânion 
(adamantildioexietano). 
brilho 
luminol 
Ensaio heterogêneo 
• etapa de lavagem – retira reagente marcado não ligado a fase 
sólida 
 
FASE SÓLIDA 
- conhecido como suporte 
- tubos, microplacas, micropartículas ou tiras 
- partículas de agarose, poliacrilamida, dextran, poliestireno 
- micropartículas – lavagem – decantação, centrifugação, adsorção 
em fibra de vidro ou captura 
- tipos: ELISA, dot – ELISA, IMUNNOBLOT 
Immuno-Dot 
• Variação do ELISA conhecida como Dot-ELISA. 
• Fase sólida - membrana de nitrocelulose, PVDF ou náilon. 
• Substrato cromógeno – forma produto estável e insolúvel – 
mancha (dot). 
• Pode-se usar conjugado radiativo – detecção por auto-
radiografia. 
• Vantagens: pequeno volume de amostra, teste rápido, com 
sensibilidade e especificidade boas. 
• Uso: emergência com suspeita de HIV e estudos 
epidemiológicos. 
Fracione o pente de acordo 
com o número de amostras 
Colocar as amostras e 
os controles nos 
pocinhos da fileira A 
Colocar o pente na 
fileira A e incubar 
segundo as 
instruções 
Colocar o pente na 
fileira B e incubar 
Incubar nas fileiras C, D e E. 
Reação com substrato na 
fileira F 
Ler os resultados e 
comparar com o 
padrão 
Esquema – teste DOT-ELISA 
 ELISA 
• capaz de detectar menor concentração de Ag e Ac. 
• reagente ligado a uma enzima. 
• imobilização em fase sólida - placa de ploiestireno. 
• Vantagens: maior sensibilidade e especificidade, rapidez, 
baixo custo e adaptação a diferentes graus de automação. 
• Tipos: direta, indireta, de captura e de competição. 
• Uso: detecção de Ac para diversas doenças e Ag como 
partículas virais, hormônios, proteínas tumorais e interleucinas 
Determinação de Ag 
 ELISA direto de captura 
 ELISA direto de competição 
 
 Determinação de Ac 
 ELISA indireto 
 ELISA indireto de captura 
 ELISA indireto de competição 
ELISA direto de captura 
Conhecido como “sanduíche”. 
Após a adição de um reagente, realiza-se etapa de lavagem 
para retira reagente não ligado. 
Ag na 
amostra 
Incubação Incubação 
Ac fixado 
na placa Conjugado Ac marcado 
Lavagem 
Adição do 
substrato, 
revelação e 
leitura 
ELISA direto de competição 
ELISA indireto 
Vantagens: único conjugado para vários sistemas 
Uso: detecção de Ac de classes determinadas de acordo com Ag 
que sensibilizou a placa 
Resultado 
- visual (qualitativo)‏ 
- densidade óptica (DO) 
(quantificação / espectrofotômetro) 
- Limiar de reatividade (“cut-off”)‏ 
- Titulação (diluição em série)‏ 
- Absorbância 
- Unidade padrão (absorbância transformada em 
unidade)‏ 
ELISA indireto de captura 
. Vantagens: único conjugado para vários sistemas. 
. Uso: detecção de Ac de classes determinadas de acordo com Ag 
que sensibilizou a placa 
ELISA Indireto de Competição 
. Vantagens: único conjugado para vários sistemas. 
Uso: detecção de Ac de classes determinadas de acordo com 
Ag que sensibilizou a placa. 
Lavadora de microplacas 
Leitora de microplacas 
acoplada a computador 
Equipamento de ELISA 
Equipamento de ELISA 
Western Blotting 
• identificação de proteínas reconhecidas por Ac. 
• separação das proteínas – peso molecular (massa 
nolecular) - eletroforese em gel de poliacrilamida. 
• transferência eletroforética - nitrocelulose. 
• incubação com amostras - presença de Ac específicos - 
complexo formado – conjugado. 
• visualização = cromógeno - precipitado colorido. 
• teste confirmatório. 
Etapas 
• preparação do gel (concentração poliacrilamida/gradiente) 
• SDS (detergente aniônico/confere carga negativa)‏ 
• migração: pólo - pólo + 
• preparo da amostra (solubilização das proteínas)‏ 
• tampão corrida 
• voltagem/amperagem 
• transferência (semi-seco; “over-night”)‏ 
• membrana (nitrocelulose; PVDF)‏ 
Esquema de separação SDS-PAGE e transferência 
Emprego: pesquisa de Ag ou Ac  diagnóstico = qual proteína está 
sendo reconhecida  diferentes perfis  fase da doença 
 
Teste de Western blotting para pesquisa de anticorpos para 
Neurocisticercose (tese de mestrado – BUENO, 2000). Em A revelação com 
substrato cromogênico com 4-cloro naftol e em B DAB. 
A B 
Western blotting 
• critério diferentes para 
interpretação 
• Ac mais importantes contra 
glicoprotéinas do envelope gp120, 
gp160 e gp41 
• Ac anti-p24 – geralmente presente 
mas podem estar ausentes nos 
estágios tardios da infecção 
Esquema de teste de Western blotting – confirmatório para HIV 1 
 
Legenda: 12 controle positivo, 10 controle fraco 
positivo, 19 controle negativo, 20, 24, 25, 26 
amostras 
Agradecimentos 
Profa Paula Knox, pelo material gentilmente cedido 
 
Referências Bibiolgráficas 
FERREIRA, AW & ÁVILA, SL Diagnóstico Laboratorial das Principais 
Doenças Infecciosas e Auto-Imunes, 2001. 
FERREIRA, AW & ÁVILA, SL Diagnóstico Laboratorial das Principais 
Doenças Infecciosase Auto-Imunes, 2013. 
VAZ, A., TAKEI, K., BUENO, E. C. Imunoensaios Fundamentos e 
Aplicações. 1ed. Guanabara Koogan, 2007. 
FORTE, W. C. N. Imunologia do Básico ao Aplicado. 2ed., Artmed, 
2007. 
Atualização – pesquisa na internet setembro de 2016.