Aula 5 Purificação e detecção de ácidos orgânicos

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PURIFICAÇÃO E DETECÇÃOÁCIDOS ORGÂNICOS
RECONHECENDO AS ETAPAS
DEFINIÇÃO
• Isolamento e purificação de um produto formadobiotecnologicamente para um estado adequadopara uso• Importância: evitar a perda do produto• Eli Lilly: 90% envolvidos no processo downstream da produção da insulina humana – Humulin
A PURIFICAÇÃODEPENDE DO PRODUTO
Depende da aplicação final e das característicasfísico-químicas da molécula-alvo
o Bem como àquelas das impurezas
Produto NÃO requer alto grau de pureza
 Concentração do meio
Produto requer alto grau de pureza
 Complexidade do processo de purificação
 80% do custo final do produto
A PURIFICAÇÃODEPENDE DO CUSTO
Variação do rendim ento total no processo de purif icação de um produto em função do núm ero de etapas do processo e do rendim ento de cada etapa 
Se o rendimento em produto for de 90% em cada operação unitária, a aplicação de 9 operações levará a um rendimento final de cerca de apenas 40% 
QUAL A LÓGICA A SEGUIR NUMPROCESSO DE PURIFICAÇÃO?
Etapas de diferentes passos envolvidos no isolam ento e purif icação 
Fermentação 
Separação das células do meio de fermentação (clarificação) 
Purificação inicial ou concentração 
Purificação específica do metabólito 
Purificação final 
 Formulação 
SEPARAÇÃO
• O seu produto está onde?
PROCESSO DE SEPARAÇÃOProcesso dow nst ream 
Meio de cult ivo com células ou m icrorganism os em suspensão 
Clarificação ( separação células/ m eio) 
Células ou m icrorganism os ( produtos intracelulares) Sobrenadante ( produtos ext racelulares) 
Rom pim ento de Células ou m icrorganism os 
Rem oção de fragm entos de Células ou m icrorganism os 
Fração sólida Sobrenadante 
separação/ concentração de m oléculas 
Purif icação 
Tratam entos finais 
Processo dow nst ream 
Meio de cult ivo com células ou m icrorganism os em suspensão 
Clarificação ( separação células/ m eio) 
Células ou m icrorganism os ( produtos intracelulares) Sobrenadante ( produtos ext racelulares) 
Rom pim ento de Células ou m icrorganism os 
Rem oção de fragm entos de Células ou m icrorganism os 
Fração sólida Sobrenadante 
separação/ concentração de m oléculas 
Purif icação 
Tratam entos finais 
FILTRAÇÃO X CENTRIFUGAÇÃO
FILTRAÇÃO
Aplica-se à:
Grandes volumes
Suspensão diluída de células
Produto extra-celular
Assepsia não é necessária
Fungo filamentoso: micélio com baixa densidade e 
difícil separação do meio por centrifugação
FILTRO ROTATIVO À VÁCUO
Utilizado com mais frequência na clarificação de 
grandes volumes de suspensão microbiana
Capacidade 0,1 – 0,2 m3/h-1
FILTRO ROTATIVO À VÁCUO
FILTRAÇÃO TANGENCIALPOR MEMBRANAS
Pressão 
Polar ização de concentração ( torta) 
Soluto Mater iais em suspensão 
Solvente 
Escoam ento Em para le lo À m em brana 
Perm eado transportado t ransversa lm ente 
Solução de a lim ent ação Pressão 
Polar ização de concentração ( torta) 
Soluto Mater iais em suspensão 
Solvente 
Escoam ento Em para le lo À m em brana 
Perm eado transportado t ransversa lm ente 
Solução de a lim ent ação 
Separar produtos de caldo fermentativo diluído
Promover concentração de compostos a baixa Temperatura e Pressão.Possibitar retirada moléculas pequenasMantém o PH constante
FILTRAÇÃO TANGENCIALPOR MEMBRANAS
Escala de laboratório Escala Industrial
FILTRAÇÃO TANGENCIAL PORMEMBRANAS
FILTRAÇÃO X CENTRIFUGAÇÃO
CENTRÍFUGA DE DISCO
• Remover células de caldo fermentado• Coletar precipitado
sobrenadante 
precipitado 
sobrenadante 
precipitado 
Quando as células ou caldo fermentado devem voltar ao biorretor ou quando o produto deve ser estéril pode-se usar centrífugas esterilizáveis por vapor!!!
CENTRÍFUGAS DE DISCO
CENTRÍFUGA TUBULAR
• Neutralização e lavagem nas indústrias:• óleos vegetais• purificação de óleos combustíveis, diesel e lubrificante• soda cáustica• têxtil, tinta, verniz e corante• Remoção de partículas de até 1,0 um de soluçõesaquosas• Separação de plasma e hemoglobina de sangueanimal• Obtenção de caldo de cultura em vacinas• Obtenção da globulina e albumina de sanguehumano
CENTRÍFUGA TUBULAR
TUBULAR X DISCO
• Processamentodescontínuo• Valores de Fc elevados (13.000 a 15.000 xg)• Limitação nacapacidade(dezenas de L)• Aplica-se suspensõescom no máximo30g/L de células
• Processamentocontínuo• Valores de Fc menores (5.000 a 15.000 xg)• Inclusão de disco aumenta área de sedimentação, reduzindo tempo• Aplica-se suspensõescom no máximo250g/L de células
FILTRAÇÃO X CENTRIFUGAÇÃO
• Células microbianas
• Para produtos intracelular
• Assepsia
• Mão de obra
QUAL A LÓGICA A SEGUIR NUM PROCESSO DE PURIFICAÇÃO
Etapas de diferentes passos envolvidos no isolam ento e purif icação 
Fermentação 
Separação das células do meio de fermentação (clarificação) 
Purificação inicial ou concentração 
Purificação específica do metabólito 
Purificação final 
 Formulação 
ROMPIMENTO CELULAR
• Mecânicos• Físicos• Químicos• Enzimáticos
Fungos filam entosos 
Mem brana citoplasm át ica 
Glicano 
Glicoproteína 
Quit ina/ m icrofibr ila 
Parede ce lular 
Bactér ias Gram - posit ivo 
Parede ce lula r ( Mure ína / pept ídeoglicano) 
Espaço per iplasm át ico 
Mem brana citoplasm át ica 
10-80 nm 
Bactér ias Gram - negat ivo Espaço per iplasm át ico Mem brana citoplasm át ica 
Mureína Mem brana externa Parede celular 8 nm 3 nm 
Leveduras 
Mem brana citoplasm át ica 
Lipídios Proteínas Manana Glicano 
Parede ce lular 
75 nm 
Fungos filam entosos 
Mem brana citoplasm át ica 
Glicano 
Glicoproteína 
Quit ina/ m icrofibr ila 
Parede ce lular 
Bactér ias Gram - posit ivo 
Parede ce lula r ( Mure ína / pept ídeoglicano) 
Espaço per iplasm át ico 
Mem brana citoplasm át ica 
10-80 nm 
Bactér ias Gram - negat ivo Espaço per iplasm át ico Mem brana citoplasm át ica 
Mureína Mem brana externa Parede celular 8 nm 3 nm 
Leveduras 
Mem brana citoplasm át ica 
Lipídios Proteínas Manana Glicano 
Parede ce lular 
75 nm 
ROMPIMENTO CELULAR
ROMPIMENTO MECÂNICO
• Um dos mais utilizados na indústria!• Homogeneizador de alta pressão
ROMPIMENTO MECÂNICO
• Força de cisalhamento aplicada pelas esferas de vidro contra a parede celular
CROMATOGRAFIA
MECANISMO
• A fase estacionária pode ser 
um sólido ou um líquido
• A fase móvel, que pode ser 
gasosa ou líquida, passa 
sobre a fase estacionária, 
arrastando consigo os 
diversos componentes da 
mistura.
MECANISMO
TEMPO DE RETENÇÃO, T
TempoSin
al d
e d
ete
cçã
o 1 2tR1 tR2
tM
tR1: tempo de retenção do composto 1tR2:tempo de retenção de composto 2tM: tempo morto da colunat´R1: tempo de retenção corrigido
t´R1
tM = tR1 – t´R1
HPLC
• High Performance Liquid Chromatography
Coluna
Gás Líquido
Sól ExclusãoFaseLigadaAfinidadeTrocaIônicaLíq
TIPOS DE FASE ESTACIONÁRIA
• Fase reversaFE apolar/hidrofóbicaC18, C8, C4, Phenylacoplados à um suporte de sílica gel
• Fase normal FE polar/hidrofílicaSilica (silanol), acoplado a um suporte polimérico (polistireno)
Qual a fase ideal para o estudo de ácidos orgânicos e os 
demais produtos de fermentação?
 Exclusão iônica
FE carregada
Suporte polimérico (polistireno) com Ca2+, Na2+, Pb3+, H+
FASE REVERSA
A separação ocorre por
diferença de hidrofobicidade
entre eluito e a fase ligada
(normalmente C4, C8 ou C18)
Eluição ocorre com o 
aumento da quantidade de 
solvente orgânico no tampão
de eluição em gradiente
FASE NORMAL – INTERAÇÃOHIDROFÍLICA
Partição das 
moléculas
hidrofílicas entre 
fase móvel
hidrofóbica e fase
estacionária
Maior Interação
Catiônicas eAniônicasFE altamente carregadaFlux
o da
 FM
A diferença de afinidade 
entre os íons da FM pode 
ser controlada por pH e 
força iônica
Fase Iônica
TROCA IÔNICA
EXCLUSÃO MOLECULAR
EXCLUSÃO MOLECULAR
AFINIDADE
A proteína de 
interesse interage
de forma 
específica com um 
ligante na fase
estacionária
SISTEMAS CROMATOGRÁFICOS INDUSTRIAIS
CROMATÓGRAFOS
CROMATÓGRAFO
Controlador de gradieante Bombas
Injetor
Coluna e pré-coluna
Detector
Dados
Coletor
PURIFICAÇÃO DE METABÓLITOS
COMO SEPARAR MOLÉCULAS ORGÂNICAS?
• Quais as moléculas 
que vocês querem 
separar?
• Quais são as propriedades 
físico-químicas delas?
TIPOS DE COLUNAS DISPONÍVEIS
• Dimensões de coluna
Analítica Semi-preparativa Preparativa
COMO DETECTÁ-LAS?
• UVQual o princípio?Seletividade?Sensibilidade?O que detecta?
• Importante:
Fase Móvel
Traços de impureza
Gradiente?
COMO DETECTÁ-LAS?
• Índice de refraçãoQual o princípio?Seletividade?Sensibilidade?O que detecta?
• Importante:
Fase Móvel
Gradiente?
UV OU IR?
DETECÇÃO
PARÂMETROS QUE INFLUENCIAM UMA SEPARAÇÃO
Temperatura Sovente
ÁCIDOS ORGÂNICOS
• Análise de ácidos orgânicos
CARBOIDRATOS
ÁLCOOIS
CALDO DE FERMENTAÇÃO 210 nmRI