Relatório 4 e 5

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE AGRONOMIA
MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA AGRÍCOLA - AGR04005
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Bactérias: Técnicas de Exsudação e Isolamento
Relatório – Aulas práticas Bactérias
Nome:Ricardo Crapanzani França e Henri Afonso Neis Gais
Coordenador:Edson Bertolini
Porto Alegre, 14 de abril de 2018
1. Introdução
A atividade agrícola apresenta grande dependência das condiçõesatmosféricas e do espaço físico/substrato onde é executada. A distribuição da produção vegetal no mundo varia de acordo com a composição e características da superfície, bem como da interação entre os diferentes elementos do sistema. Os organismos vegetaissão continuamente expostos a inúmeros patógenos, o que os torna suscetíveis à doenças. Tendo isso, a realização de estudos sobre o comportamento de fitopatógenos pode resultar em técnicas mais eficientes de controle e manejo de doenças, evitando, assim,maiores perdas na produção.
As bactérias são microrganismos procariotos, unicelulares e com parede celular. São considerados microscópicos, medindo 0,5-1 µm de largura e 1-5 µm de comprimento. Apresentam grande importância no contexto agronômico, podendobeneficiar o crescimento das plantas, mas também, em outros casos, serem prejudiciais a ponto de destruí-las.
Doenças causadas por bactérias podem induzir o aparecimento de sintomas que são, muitas vezes, confundidos com outros agentes causais como vírus,fungos e nematoides, ou mesmo resultantes de distúrbios fisiológicos. Desse modo, a adoção de diferentes técnicas e métodos de detecção podem fornecer resultados rápidos e precisos sobre a etiologia bacteriana de uma enfermidade.
A exsudação de pus bacteriano pode ser observada na superfície de materiais lesionados, em folhas, caules e pecíolos. Quando os sinais não forem evidentes utiliza-se técnicas que auxiliam na observação da exsudação bacteriana. Os dois testes mais utilizados são:
-Exsudação em gota:Esse teste permite a detecção de bactérias em associação negativa com as plantas. Baseia-se no fato de que as células bacterianas são capazes de migrar do interior dos tecidos infectados para um meio exterior aquoso, basicamente por apresentarem afinidade por água. Sendo positivo o teste de exsudação em gota, ou seja, verificado em microscópio a presença de massas de células exsudando de tecido foliar, pode-se confirmar a etiologia bacteriana da doença. Logo, trata-se de um teste muito seguro, cujos resultados são bastante satisfatórios
2. Objetivos
Sujeitar material biológico aos procedimentos de exsudação bacteriana, realizar a detecção de fitobactérias e observar os sintomas provocados por esse agente.
3. Materiais e Métodos
Os materiaisdisponibilizados para a realização dos testes de exsudação em copo e em gota foram os seguintes: Material biológico possivelmente infectado, tesoura de poda, copo de becker, água, pipeta Pasteur, lâmina, lamínula e bisturi.
O teste da exsudação em gota representa outra forma de confirmar se determinada enfermidade é causada por fitobactérias. Sendo assim, forma utilizadas folhas frescas e outras dessecadas de maracujazeiro (Passiflora edulis),. Utilizando um bisturi, remover uma porção fina e pequena de material infectado. Nesse momento recomenda-se utilizar a região inicial de avanço da doença, evitando locais onde o tecido já está comprometido / estado avançado de decomposição. Em seguida, colocar sobre a lâmina uma gota de água e, sobre esta, depositar omaterial selecionado. Cobrir com a lamínula e certificar-se que não há bolhas de ar no preparado. Por fim, observar ao microscópio no menor aumento. Caso necessário, manusear o condensador do aparelho até obter maior nitidez das estruturas observadas. Oprocesso de elaboração da lâmina foi realizado três vezes, uma para cada material biológico disponibilizado.
4. Resultados e Discussões
A análise do material submetido ao teste de exsudação em gota permitiu a observação de nuvens compostas por células bacterianas, formadas na região limite de contato entre o fragmento vegetal e a água, comprovando assim a presença de bactérias. Por serem organismos essencialmente aquáticos acabam migrando do interior dos tecidos para o meio liquido. Os sinais descritos anteriormente não foram observados na lâmina elaborada a partir do tecido da laranja devido à dificuldade de preparo da mesma. O material mais grosseiro impossibilitou a colocação da lamínula, resultando na formação de bolhas de ar, o que comprometeu a visualização da exsudação bacteriana.
5. Conclusões
Esta aula possibilitou a observação de bactérias presentes em diferentes tecidos vegetais. A utilização de teste de exsudação compreende metodologia segura, simples e eficiente para a comprovação da etiologia bacteriana de uma doença. Bactérias são organismos capazes de provocar grandes perdas em culturas agrícolas, sendo que apresentam rápida disseminação pelo ambiente. Dado isso, as tentativas de controle de doenças resultantes de infecção bacteriana também se mostram pouco eficientes.
Feito esse procedimento pode-se utilizar técnicas de isolamento bacteriano a fim de identificar com maior detalhamento o agente causal da enfermidade. Tendo isso, a parte seguinte deste relatório pretende fornecer ao aluno o conhecimento básico para a realização da técnica, bem como as características e utilidades dessa prática.
1. Introdução
O isolamento bacteriano, é uma técnica que consiste em criar, em meio de cultura (ágar), um único agente, permitindo analisá-loisoladamente, oferecendo melhor definição e capacidade de observação de suas características, sendo de sumária importância ao diagnóstico (segundo passo dos postulados de Koch). Em situações menos usuais a coleta pode se dar em matérias que não necessáriamente a planta como em insetos, sementes, água, solo, entre outros. Após coletado, o material deve ser acondicionado em sacos de papel até análise. Não devem ser utilizados materiais plásticos, já que este impede a entrada de ar no sistema, gerando, após um tempo, um ambiente anaeróbico, que poderá prejudicar a colônia bacteriana, e consequentemente, as análises laboratoriais posteriores.
Este método tem como vantagem ser de simples execução e não necessitar de muitos materiais e tecnologias para ser realizado, com uma certa exceção ao autoclave, que já é um equipamento relativamente caro. Como desvantagens, tem-se a extrema facilidade com que o material pode ser contaminado por agentes externo, tendo que ter, por isso, extremo cuidado na limpeza e no manuseio dos materiais.
2. Objetivos
Elucidar questões acerca de aspectos teóricos e práticos do método de isolamento bacteriano, bem como suas peculiaridades, dificuldades e importância em sua realização. Bem como sobre a coleta e acondicionamento do materialaté o laboratório.
3. Materiais e métodos
Materiais: Álcool (50%), Hipoclorito (2%), Água destilada, Alça de Drigalski, Bisturi, Lamparina, Material Biológico, Meio de cultura, Pinça de ponta fina, Pipeta de Pasteur e Placas de Petry.
Métodos: Selecionamosum vegetal que apresente sintomas de infecção bacteriana, no caso desse experimento foram utilizadas folhas de couve. Com o auxílio de uma pinça de ponta fina e de um bisturi, retirar uma pequena porção do material biológico. Após, devemos realizar dois tratamentos com soluções diferentes. O primeiro tratamento é em álcool 50% (20 a 30 segundos) e tem a função de dissolver possíveis barreiras apolares que contenham na superfície foliar (normalmente cerídeos ou lipídeos). A partir dessa fase do método, devemos efetuar todos procedimentos junto a uma lamparina acessa, pois a chama ajuda a diminuir a contaminação de nosso material com organismos indesejáveis presentes no ar. O segundo tratamento dura entre 3 a 5 minutos e dá-se em uma solução de Hipoclorito desódio a 2%, coma função de esterilizar a superfície da folha, de modo que somente restem as bactérias fitoparasitas contidas no interior da folha. Após isso devemos lavar nosso material através de três banhos em água destilada, com a finalidade de remover totalmente os resquícios do hipoclorito e do álcool. Após a lavagem do material devemos depositá-lo sobre uma placa de Petry e gotejar, com o auxílio de uma pipeta de Pasteur, uma gota de água destilada sobre o material. Posteriormente, com o auxílio deum bisturi e de uma pinça de ponta fina, ambos flambados na chama da lamparina, devemos triturar o fragmento foliar e, em seguida, com o auxílio da pipeta de Pasteur esterilizada, coletar a água dessa gota, depositá-la sobre uma placa de Petry com meio decultura e espalhar a gota sobre o meio com o auxílio de uma Alça de Drigalski, também esterilizada. Finalmente podemos fechar nossa placa de Petry, colocar identificações e levá-la a estufa de incubação a uma temperatura entre 25º e 28 ºC.
4. Resultados ediscussões
Após uma incubação de 7 dias, foi notada a presença do crescimento de colônias de bactérias (de aspecto mais pastoso) e de alguns fungos (com aspeto mais aveludado). As colônias de bactérias provavelmente originaram-se dos fitoparasitas presentes na folha de maracujazeiro. Possivelmente os fungos tenham se originado por contaminação da amostra ou da umidade do material/ambiente. A obtenção de uma população pura, ou seja, que contenha apenas um tipo de microrganismo, é conseguida com a utilizaçãode um meio de cultivo seletivo. Este contém substâncias que inibem o desenvolvimento de determinados grupos de microrganismos, o quepoderia ter evitado o aparecimento de estruturas fúngicas na placa de isolamento bacteriano elaborada em laboratório. O uso de técnicas assépticas como a esterilização dos materiais utilizados,; desinfecção do local de trabalho e anti-sepsia das mãos; executar os procedimentos de isolamento a cerca de 10 cm de uma chama do bico de Bunsen, além de flambar a boca dos frascos antes e depois das inoculações são algumas das medidas empregadas para evitar a presença de microrganismos indesejados.
5. Conclusões
Nesta aula observou-se os critérios e cuidados que devem ser tomados desde o momento da coleta até a realização do métodode isolamento para a identificação de bactérias, evidenciando questões sobre contaminação, representatividade da amostra, acondicionamento dos materiais coletados, passo a passo do método, a importância de cada fluido de embebição das tiras amostrais, bemcomo do uso da chama para descontaminação e flambagem. Demonstrando todas as peculiaridades, vantagens, desvantagens e importância do método.
1. Introdução
teste do hidróxido de potássio (KOH). Em uma lâmina de microscopia adicionam-se duas gotas de uma solução de KOH a 3%. Com o auxílio de uma alça de semeadura coleta-se uma colônia isolada da bactéria a ser testada e mistura-se com a solução de KOH na lâmina por 30 segundos. Durante a mistura deve-se erguer a alça de semeadura cerca de 1 a 2 cm da superfície da lâmina observando-se se há fios de material viscoso pendentes. Se a bactéria for verdadeiramente Gram-negativa, o KOH irá romper sua parede celular e liberar seu DNA que será observado como fios viscosos. Se a bactéria for Gram-positiva não haveráa formação de fios.
2. Objetivos
Desenvolver habilidades para executar a técnica de preparação de esfregaço e para o método de hidróxido de potássio (KOH), sabendo diferenciar e classificar as bactérias de acordo com composição química da parede celular.Gram positivas e Gram negativas através do teste de lise por KOH.
3. matérias e métodos
Em uma lâmina adicionou-se duas gotas de uma solução de KOH 3%. Com o auxílio de uma alça coletou-se uma colônia isolada da bactéria a ser testada e misturou-secom a solução de KOHna lâmina por 30 segundos. Durante a mistura, fazendo movimentos circulares, erguia-se a alça da superfície da lâmina observando-se se havia formação de fios de material viscoso.
4. Resultados e discussão
Após o procedimento, notou-seque não ocorreu a produção de fios, onde esperaríamos que haveria a produção, pois a maioria das bactérias fitopatogênicas são gram negativas.
5. conclusões
Obtido o resultado das práticas aqui descritas foi obtido como resposta que se tratava de uma bactéria gram-positiva, uma vez que em 20 segundos não ocorreu a produção de fios, assim caracterizando a maior resistência pelo extravasamento de DNA do interios da célula bacteriana.
6. Referências bibliográficas
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ZAMBOLIM, L. JESUS JUNIOR, W.C., PEREIRA, O.L. O Essencial da Fitopatologia. Agentes Causais, 1.ed. v.2, Viçosa: Departamento de Fitopatologia, 2012.
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http://www.pontociencia.org.br/experimentos/visualizar/teste-de-gram/390
https://www.portalsaofrancisco.com.br/biologia/coloracao-de-gram