Roteiro sobre o método de coloração de ziehl neelsen

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CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – CCS 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
Disciplina de Microbiologia Geral 
 
 
 
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Prof. Daniel Roulim Stainki 
UFSM 
AULA PRÁTICA 05 – COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN. 
 
 A) Material necessário: 
- Lâmina para microscopia; 
 - lápis para vidro; 
- alça e agulha de platina; 
- solução salina ou água destilada; 
- cultura de micobactérias; 
- óleo de imersão, papel absorvente; 
- suporte para lâminas; 
- lamparinas, bico de Bunsen e isqueiro; 
- Fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen. 
- Solução de álcool-ácido clorídrico 1%. 
- Azul de metileno. 
- Pote para descarte das lâminas 
 
B) Fundamentação teórica: 
 
Há bactérias que são resistentes à coloração, mas que uma vez coradas vão resistir 
fortemente à descoloração, mesmo por ácidos fortes diluídos e álcool absoluto. Às 
bactérias que possuem esta propriedade dizemos que são ácido-álcool resistentes (géneros 
Mycobacterium e Nocardia). Esta característica é devida ao elevado teor de lípidos 
estruturais (ex. ácido micólico) na parede celular destas bactérias, que provoca uma 
grande hidrofobicidade, dificultando a ação dos mordentes e diferenciadores de corantes 
aquosos. 
O gênero Mycobacterium constitui um grupo que causa doenças no homem e nos 
animais superiores. No homem essas doenças variam de infecções superficiais até a 
tuberculose. As micobactérias são microorganismos encontrados com facilidade no meio 
ambiente, com exceção do Mycobacterium tuberculosis e M. leprae. Podem sobreviver 
por longos períodos no solo, pois produzem esporos. Apresentam-se como bacilos 
longos, delgados, retos ou ligeiramente encurvados, imóveis e aeróbios estritos. 
Apresentam crescimento lento e alto conteúdo lipídico (ácidos micólicos) na parede 
celular. Esses lipídios são os responsáveis pela estabilidade ácida. 
A coloração de Zehl-Neelsen foi desenvolvida em 1882 por Franz Ziehl e 
Friedrich Neelsen. O método permite identificar os microorganismos que possuem 
paredes celulares, ricas em ácido micólico, capazes de resistir ao descoramento pela 
mistura álcool-ácido, depois de coradas a quente pela fucsina. Na prática, a coloração de 
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Ziehl-Neelsen é utilizada para diferenciar os dois grupos de bactérias: álcool-ácido 
resistentes (géneros Mycobacterium e Nocardia) e não álcool-ácido resistentes. 
 
C) Objetivos: 
1. Preparação de esfregaços para a observação de BAARs. 
 
D) Procedimento: 
 
MÉTODO DE COLORAÇÃO À QUENTE – MÉTODO DE ZIEHL-NEELSEN 
 
a. Preparar um esfregaço homogêneo, delgado e identificado em uma lâmina 
nova desengordurada, limpa e seca; 
b. Deixar secar a temperatura ambiente; 
c. Fixar o material do esfregaço passando 3 a 4 vezes pela chama do bico de 
Bunsen; 
d. Cobrir a totalidade da superfície do esfregaço com solução de fucsina de 
Ziehl concentrada; 
e. Deixar agir por cerca de 5 minutos, aquecendo brandamente utilizando 
lamparina ou com a chama do bico de Bunsen, passando lentamente por 
baixo da lâmina, até que se produza emissão de vapores e, quando estes são 
visíveis, cessar o aquecimento. Repetir essa operação até completar três 
emissões sucessivas. Evitar a fervura e secagem do corante (adicionar mais 
corante, caso necessário, dentro deste período para evitar que a lâmina seque 
porque o esfregaço precisa estar coberto permanentemente durante o 
aquecimento.). Este aquecimento deve ser intermitente, pois é importante 
manter a solução aquecida durante o tempo previsto; 
OBS: É importante queimar os lipídeos da parede, amolecendo-os, para facilitar a 
entrada do corante. 
f. Lavar em água corrente para eliminar a Fucsina. Toma-se a lâmina pela 
ponta marcada, inclinar para frente e lavar deixando cair um jato d’água de 
baixa pressão sobre a película corada, de maneira que essa não se desprenda; 
g. Cobrir toda a superfície do esfregaço com a solução de Álcool-ácido. Tomar 
a lâmina entre o polegar e o indicador e fazer um movimento de vai-e-vem, 
de modo que o Álcool-ácido vá descorando suavemente a Fucsina. Se o 
esfregaço estiver ainda com a cor vermelha ou rosada, descora-se 
novamente. Considera-se descorado o esfregaço, quando suas partes mais 
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grossas conservarem somente um ligeiro tom rosado. Essa operação dura, em 
geral, dois minutos; 
h. Terminada a fase de descoloração e eliminado o Álcool-ácido, lavar a 
lâmina da mesma forma como se procedeu depois da coloração com a 
Fucsina, com cuidado para não desprender a película; 
i. Cobrir toda a superfície do esfregaço com solução de Azul de metileno 
durante 30 segundos a 1 minuto; 
j. Lavar, da mesma forma como se indicou para a Fucsina, tanto o esfregaço 
como a parte inferior da lâmina; 
k. Colocar a lâmina com o esfregaço para cima, sobre o papel limpo, para secar 
a temperatura ambiente ou estufa a 35º C; 
l. Observar ao microscópio com objetiva de imersão (100 x). 
 
Resultado: 
Evidenciar as características morfotintoriais de M. tuberculosis e micobactérias 
em geral. 
No método de Ziehl-Neelsen as micobactérias permanecem coradas, por serem 
BAARs, com tonalidade vermelha, enquanto as outras bactérias se mostram azuis. 
 
- Desenhe e descreva o que foi observado. 
 
 
 
 
 
 
 
DESCRIÇÃO: