Aula_on-line_2_-_proteinas_3D_e_forcas

Esta é uma pré-visualização de arquivo. Entre para ver o arquivo original

*
*
*
Proteínas: estrutura tridimensional e forças envolvidas 
BIO10-329 Biofísica de Proteínas
Regente: Célia R. Carlini
Atenção ! Use o modo “apresentação de slides” para ativar as animações
 Os assuntos abordados nessa aula são:
 Modelos de estrutura proteica
 Forças estabilizadoras da estrutura de proteínas
 Métodos de estudo da estrutura de proteínas
*
*
*
Iniciaremos essa aula relembrando os conceitos de níveis organizacionais da estrutura de uma proteína, como visto na aula anterior:
A Hemoglobina é um heterotetrâmero formada por 2 tipos de cadeias polipeptídicas
*
*
*
Para entender a estrutura 3D das proteínas, vamos “dissecá-la” em níveis organizacionais para facilitar o estudo:
. 
Para entender a estrutura 3D das proteínas, vamos “dissecá-la” em níveis organizacionais para facilitar o estudo:
*
*
*
*
*
*
Estrutura primária: é a sequência dos aminoácidos na cadeia polipeptídica.
 Para determinar a estrutura primária de uma proteína, é necessário primeiro conhecer a composição (número e tipos) de seus aminoácidos. 
*
*
*
Existem vários métodos para se determinar a sequência de aminoácidos de uma proteína. Aqui veremos como funcionam os dois métodos atualmente mais utilizados:
Método de Edman: reação do aminoácido N-terminal da proteína com fenil-isotiocianato . A proteína modificada é submetida a hidrólise ácida liberando o aminoácido N-terminal modificado, e este é identificado por cromatografia. Segue-se novo ciclo de reação com o próximo aminoácido na proteína, que se tornou o novo N-terminal. 
Espectrometria de massa: determinação das massas de fragmentos correspondendo a aminoácidos, retirados sequencialmente da proteína.
 Veremos mais sobre esse método na aula sobre eletroforese e proteômica. 
*
*
*
Método de Edman - sequenciamento de proteínas com PITC (fenil-isotiocianato)
Cada ciclo de reação compreende 3 etapas:
Reação da proteína com PITC, que se acopla ao grupo amino NH2- livre do aminoácido 1 (no exemplo, uma lisina, K);
Hidrólise ácida da proteína conjugada com PITC libera a feniltiohidantoína (PTH) do aminoácido 1 e o restante da proteína, tornando o aminoácido 2 o novo resíduo N-terminal (no exemplo uma serina, S);
Análise cromatrográfica do PTH-aminoácido e novo ciclo de reação com o novo N-terminal da proteína. 
Sequenciadores automatizados fazem todas as etapas, com capacidade para realizar 30 ciclos por dia, a partir de 100-200 picomoles de proteína. 
*
*
*
Quando uma proteína possui mais de 20-30 resíduos de aminoácidos, não é possível sequenciá-la diretamente pelo método de Edman. 
Para obter a sequência completa de uma proteína, é necessário sequenciar vários peptídeos da mesma proteína, obtidos por diferentes tipos de quebra da cadeia, até haver sobreposição de suas sequências.
Proteína
Total 150 a.a
*
*
*
Estudos da estrutura tridimensional de proteínas tiveram grande impulso na década de 1950 com Linus Pauling, e o uso de raios-X para analisar cristais de proteína.
Na queratina (proteína da lã de carneiro), Pauling viu um padrão repetitivo de zonas claras (eletrondensas) e escuras na difração de raios X. 
a-hélice
Para explicar esse padrão, foi proposto o modelo da a-hélice, com as seguintes caracterísiticas:
 esqueleto covalente C-C-N-C-C-N da proteína assume a forma de espiral ou mola, enrolada para a direita, com um espaçamento de 3,6 resíduos de aminoácido por volta;
 o enovelamento é estabilizado por pontes de hidrogênio entre átomos das ligações peptídicas de qualquer aminoácido, exceto prolina;
 as cadeias laterais dos aminoácidos voltam-se para fora da hélice.
*
*
*
Linus Pauling também propôs o modelo da folha pregueada ou estrutura b para explicar o padrão de difração de raios X pela b-queratina, proteína presente na unha, chifres e cascos de animais. 
Na folha pregueada as cadeias polipeptídicas dispõem-se lateralmente (em paralelo) e fazem pontes de H entre os átomos da ligação peptídica.
As cadeias laterais R dos aminoácidos voltam-se para cima ou para baixo do plano da folha
Vista lateral
*
*
*
Folhas b paralelas e antiparalelas podem se formar em uma proteína através de pequenas torções da cadeia polipeptídica.
*
*
*
Dobra b
A a-hélice e a folha b são os tipos de estrutura secundária mais comum entre as proteínas, por que não dependem da composição e sequência de aminoácidos, sendo estabilizadas apenas por pontes de H dos átomos da ligação peptídica. 
Entre os 20 aminoácidos, apenas a prolina não pode fazer nenhuma das duas estruturas, por formar uma ligação peptídica mais rígida em torno do Ca.
Existem outros tipos de estruturas secundárias conhecidas, como a dobra b ou “alças” (domínios) de ligação a íons, como Ca2+ ou Zn2+. 
hélice-dobra-hélice
“Zinc-finger”
*
*
*
Alguns modelos de organização estrutural, como os barris b e ab, aparecem em vários tipos de proteínas, às vezes não relacionadas.
A estrutura terciária descreve a forma tridimensional final de uma cadeia polipeptídica, resultando da associação de partes organizadas da molécula, chamadas de “domínios” ou “motivos” proteicos.
*
*
*
Proteínas com estrutura quartenária são composta de mais de uma cadeia polipeptídica, que podem estar associadas covalentemente (pontes dissulfeto) ou não. 
*
*
*
Algumas definições importantes:
- Por serem conceitos didáticos, frequentemente é difícil distinguir em uma proteína os níveis secundário e terciário de organização estrutural.
 Para evitar tais ambiguidades utiliza-se o termo conformação proteica, que se refere aos aspectos da estrutura tridimensional de uma proteína acima de sua sequência de aminoácidos.
 Os termos conformação e configuração não são sinônimos. 	
 Configuração refere-se à estrutura tridimensional de uma molécula determinada por ligações covalentes, como por exemplo, as formas L- e D- de um aminoácido. 	
 Conformação refere-se à estrutura tridimensional de uma molécula decorrente da somatória de ligações fracas, não covalentes.
Conformação nativa de uma proteína refere-se à estrutura tridimensional em que a molécula apresenta suas propriedades biológicas naturais. 
Desnaturação refere-se a alterações da conformação nativa de uma proteína, podendo resultar em perda parcial ou total, reversível ou irreversível, de sua atividade biológica. 
*
*
*
FORÇAS NÃO COVALENTES
Pontes de H
Aminoácidos polares
Ligações iônicas
 Aminoácidos carregados
Interações hidrofóbicas
Aminoácidos apolares
Forças de Van der Waals
Qualquer aminoácido
Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de uma proteína ? 
Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de uma proteína ? 
*
*
*
Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de uma proteína ? 
Pontes de H ocorrem:
 entre os átomos da ligação peptídica (por exemplo, a a-hélice e a folha b);
 entre cadeias laterais de aminoácidos polares, carregados ou não;
 para os grupos –NH3+ e –COO- dos aminoácidos N- e C-terminal, respectivamente.
Ponte de Hidrogênio
*
*
*
Ligações iônicas:
 ocorrem entre as cadeias laterais de aminoácidos com cargas contrárias;
 dependem do estado de ionização dos aminoácidos e do pH do meio;
 são menos frequentes do que as pontes de H.
Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de uma proteína ? 
Ligação Iônica 
*
*
*
Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de uma proteína ? 
Interações hidrofóbicas:
 ocorrem entre as cadeias laterais de aminoácidos apolares;
 radicais apolares são repelidos pela água, aproximando-se uns dos outros; 
 não é uma força de atração real, resultando da repulsão pela água;
 como consequência, em meio aquoso o interior de proteínas globulares
é hidrofóbico.
Interações hidrofóbicas 
*
*
*
Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de uma proteína ? 
Forças de Van der Waals
 é uma força eletrostática que ocorre entre dipolos temporários; 
 dipolos temporários (duração de nanosegundos) são criados devido à órbita errática dos elétrons;
 pode envolver qualquer tipo de aminoácido;
 geralmente coincidem com as regiões da proteína onde ocorrem as interações hidrofóbicas, pois a aproximação dos radicais apolares facilita a interação entre os dipolos.
e Forças de van der Waals 
*
*
*
Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de uma proteína ? 
Além dos laços não covelentes, uma proteína pode ter pontes dissulfeto formada a partir de dois resíduos do aminoácido Cys (cisteína).
Pontes dissulfeto são covalentes e só podem ser rompidas por agentes redutores, como 2-mercapto-etanol. 
*
*
*
A ligação peptídica é muito forte e só se rompe em condições químicas drásticas, como 6N HCl a 100ºC. 
A tabela mostra que a força das ligações entre os átomos do esqueleto covalente de uma proteína C-C-N-C-C-N é da ordem de 70 a 80 kcal/mol. (Não esquecer que a ligação C-N tem carácter parcial de dupla ligação C=N, por causa da ressonância da ligação peptídica.)
A conformação proteica depende basicamente de forças fracas, como a ponte de H e interações hidrofóbicas. 
A ponte dissulfeto (-S-S-) é relativa- mente rara entre as proteínas. Por ser um laço covalente, não se rompe quando uma proteína desnatura em meio ácido ou por calor.
Proteínas são moléculas frágeis e podem ser desnaturadas, com perda de suas propriedades biológicas, por pequenas variações do pH ou da temperatura do meio. A ponte de H é uma das principais forças envolvidas na estabilidade da conformação nativa. 
*
*
*
As interações que as proteínas estabelecem com o meio são importantes na determinação de sua conformação. 
A bacteriorhodopsina é formada por 7 segmentos de a-hélices apolares, que delimitam um canal interno de natureza polar.
*
*
*
O índice hidropático dos aminoácidos reflete a tendência que as suas cadeias laterais têm para interagir com o meio aquoso. 
Quanto mais negativo esse índice, mais polar é o aminoácido.
 O perfil hidropático de uma proteína é calculado como a soma dos índices hidropáticos a cada 9 resíduos de aminoácidos na cadeia polipeptídica.
 Permite prever regiões da proteína que interagem com a membrana plasmática ou com os meios interno/externo.
 O perfil hidropático da bacteriorhodopsina prevê 7 regiões hidrofóbicas e 3 regiões hidrofílicas.
*
*
*
A bacteriorhodopsina (bR) da arqueobactéria Halobacterium salinarum, é o sistema fotossintético mais simples conhecido, permitindo a sobrevivência do organismo em situações de baixo O2, ao converter luz solar em energia química. Quando a molécula de bR absorve um fóton, ela se torna uma bomba de prótons, bombeando H+ do meio intracelular para o exterior da célula. A energia do gradiente eletroquímico formado é então utilizada para síntese de ATP por uma ATP sintase. 
Bacteriorhodopsina inserida em uma porção da membrana
Para ter esse tipo de estrutura, a proteína apresenta as cadeias laterais de seus aminoácidos apolares voltadas para “fora”, em contacto com os lipídeos da membrana da célula. Aminoácidos polares estão voltados para “dentro”, delimitando o canal de prótons da molécula.
*
*
*
 O pesquisador sueco Cristian Anfisen foi um pioneiro no estudo da estrutura 3D de proteínas, e recebeu o Prêmio Nobel (1972) por suas descobertas.
Anfisen estudou a Ribunuclease (14.000d), proteína com 8 cisteínas formando 4 pontes dissulfeto.
 Ele demonstrou que era possível fazer uma desnaturação reversível da proteína, adicionando uréia e 2-mercaptoetanol para abrir as suas 4 pontes dissulfeto. Ao retirar lentamente (por diálise), esses reagentes, a proteína volta a ter atividade biológica, mostrando que voltou à sua conformação nativa.
 Esse fato é surpreendente pois as 8 cisteínas, combinadas 2 a 2, dariam 28 = 256 possibilidades, de formar diferentes pontes dissulfeto, mas apenas o arranjo original de pontes se forma. 
 A conclusão de Anfisen foi a de que a sequência dos aminoácidos (não alterada na desnaturação) é o que determina a estrutura 3D das proteínas.
 
Por que diferentes moléculas de uma proteína apresentam sempre a mesma estrutura 3D ? 
De onde vem a informação para a estrutura tridimensional de uma proteína ?
*
*
*
 A conformação nativa de uma proteína representa o estado de menor energia do sistema.
 A energia que estabiliza a estrutura 3D de uma proteína vem do aumento da entropia da água, representando “desorganização” da água à medida que interagem com a proteína.
In vivo conformações intermediárias das proteínas são estabilizadas por chaperonas durante o processo de síntese proteica.
Como é possível termodinamicamente que as proteínas tenham estruturas tão altamente organizadas ? 
De onde vem a energia que estabiliza a estrutura 3D das proteínas ? 
*
*
*
Utilize o programa RasMol para explorar a estrutura tridimensional de proteínas:
Clique aqui para fazer o download do arquivo rw32b2a.exe. Salve-o numa pasta em seu computador.
Faça o download dos arquivos .pdb da quimotripsina e da pepsina.
Execute o RasMol (clique 2X no arquivo rw32b2a.exe) e abra os arquivos .pdb
Explore as várias formas de visualização das proteínas.
*
*
*
Encerramos aqui a segunda aula da disciplina Biofísica de Proteínas.
No ED 2 aplicaremos vários dos conceitos aprendidos hoje. 
 Níveis de organização estrutural das proteínas
 Modelos de estrutura proteica
 Métodos de estudo da estrutura primária de proteínas
 Forças estabilizadoras da estrutura de proteínas