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Roteiro de aulas práticas Citologia Professora: Marina Nogueira dos Santos Rodrigues Aluno:_____________________________________________ Ibirité 2015 2 01- NORMAS DE UTILIZAÇÃO DO LABORATÓRIO I. Introdução O Laboratório é um espaço da Faculdade Ciências da Vida destinado ao estudo integrado das diferentes áreas do conhecimento. Este laboratório está disponível para os acadêmicos da área da saúde da Faculdade Ciências da Vida. O objetivo geral desse laboratório é que sirva de local para a aquisição do conhecimento relacionado à área morfofuncional citológica e histológica da Biologia, mediante a aplicação de novas metodologias de ensino-aprendizagem, aprimorando a formação básica do acadêmico. Neste ambiente será incentivado o uso de práticas e métodos que elevem a qualidade de ensino e estimulem o raciocínio criativo dos seus usuários. II. Funcionamento O Laboratório é um espaço de ensino-aprendizagem destinado exclusivamente para grupos de até 40 alunos utilizando: 18 microscópios, um projetor multimídia e material didático. Está prevista a colocação de modelos, coleção de lâminas histológicas permanentes, videodiscos digitais, livros, etc. III. Normas gerais de uso do Laboratório. A falta de observação das normas abaixo relacionadas implicará na restrição do acesso ou a retirada do usuário das dependências do Laboratório. 01. A permanência no Laboratório exige postura e responsabilidade, observando-se o silêncio necessário para o estudo e a obrigatoriedade do uso do avental e sapato fechado. Não será permitido assistir aula sem o avental. 02. As bolsas e mochilas devem ser guardadas nas prateleiras do fundo do laboratório, não podendo ficar sobre as bancadas. 03. Não é permitido introduzir alimentos e bebidas nas dependências do Laboratório. 04. Os celulares deverão ser mantidos desligados durante o período de utilização do Laboratório. 05. Caso o equipamento (microscópio) não ligue ou apresente qualquer defeito, comunicar imediatamente ao responsável, que anotará o problema no livro de registros. 06. Todo o material fornecido durante as aulas é de total responsabilidade do aluno, devendo o mesmo zelar por ele. 07. Não é permitida a presença de alunos ou de qualquer pessoa sem vínculo com a Instituição, nas dependências do Laboratório, sem a presença de um responsável. 08. O material danificado ou extraviado será reposto pelo usuário responsável. IV. Caberá ao(s) professor(es) responsável(is) pelas atividades observar(em) as seguintes normas adicionais: 01. O professor requisitará a chave do Laboratório junto aos responsáveis pelos laboratórios. Após trancá-lo devolverá a chave aos mesmos. 02. Ao término das atividades o professor verificará: a. Se as janelas do Laboratório permanecem fechadas. b. Se todos os equipamentos estão corretamente desligados. c. Se todos os equipamentos de mídia estão desligados. d. Se o laboratório está em perfeitas condições de uso recolhendo todo o material didático utilizado. 3 e. Se as laminas histológicas estão em perfeito estado. f. Registras no livro de ocorrências qualquer irregularidade que ocorra durante a aula. V- CUIDADOS COM O MICROSCÓPIO DE LUZ 01. Nunca desloque o microscópio e movimente-o o mínimo possível. 02. Quando preparar seu material biológico entre lâmina e lamínula, assegure-se SEMPRE que as mesmas estejam perfeitamente limpas. Caso estejam sujas e empoeiradas, limpe-as cuidadosamente com água e/ou álcool e papel macio. 03. Comece a focalizar sua lâmina SEMPRE pela objetiva de menor aumento, usando o macrométrico para obter o foco grosseiro e o micrométrico para o ajuste fino do foco. 04. Nunca forçá-lo. Todas as conexões devem funcionar suavemente. Caso contrário, chame o professor ou o técnico. 05. As lentes da objetiva nunca devem tocar a lâmina. Portanto, nunca focalizar baixando a platina com o parafuso macrométrico olhando pela ocular. 06. Quando mudar a lâmina, antes de tirá-la, volte SEMPRE para a objetiva de menor aumento. 07. NUNCA use a objetiva de imersão (100x) sem o óleo de imersão. 08. Após usar a objetiva de imersão, limpe-a com a solução que será fornecida pelo professor ou pelo monitor. 09. Quando o material biológico estiver corado, use o condensador alto e o diafragma aberto. Com o material não corado (espécimes a fresco ou vivos), use o condensador baixo ou o diafragma fechado. 10. Não esquecer a lâmina no microscópio após o uso. 11. Quando terminar sua observação ao microscópio, volte SEMPRE para a objetiva de menor aumento. 12. Quando o microscópio não estiver em uso, deverá ser guardado coberto. 13. Habitue-se a não deixar a fonte de luz acesa quando não estiver utilizando o microscópio. 4 02 - MICROSCÓPIO DE LUZ - Ampliação = aumento da objetiva X aumento da ocular BASE DO MICROSCÓPIO 1 – Ocular 2 – Revólver 3 – Objetiva 4 – Platina 5 – Charriot 6 – Condensador 7 – diafragma do condensador 8 – botão para regular a altura do condensador 9 – Macrométrico 10 – Micrométrico 11 – botão liga/desliga fonte de luz 12 – controle de intensidade da iluminação Partes componentes do microscópio óptico e suas funções: Base ou Pé: é o suporte do microscópio, peça que sustenta todas as outras. 5 Braço ou Coluna: é a peça que liga a base até a parte superior do microscópio e onde se deve segurar o microscópio para ser transportado. Mesa ou platina: é uma placa de metal com um orifício no centro, por onde passam os raios luminosos. O objeto que vai ser observado é colocado sobre uma lâmina de vidro e esta, sobre a platina, exatamente em cima do orifício. Peça circular, quadrada ou retangular, paralela à base. Possibilita a passagem dos raios luminosos concentrados no condensador. Charriot: localizado acessória e superficialmente à platina, é formado por uma presilha, dois botões giratórios e dois trilhos que têm a função de movimentar a lâmina no plano horizontal (da frente para trás e da esquerda para a direita, ou vice-versa) e assim permitir a observação de toda a sua área. Tubo ou Canhão: cilindro que suporta os sistemas de lentes, localizando-se na extremidade inferior à ocular e superior ao revólver com objetivas. A distância interpupilar, ou seja, a distância entre as oculares, pode ser regulada por um mecanismo existente no canhão. Revólver: peça encontrada abaixo do canhão na qual se inserem várias lentes objetivas. É dotado de um movimento de rotação que permite posicionar a objetiva desejada para a observação do material a ser analisado. Fonte de luz: normalmente uma lâmpada ou, em modelos mais antigos, um espelho, que se apóia na base do microscópio. No caso da fonte de luz ser uma lâmpada, pode-se observar, ao lado da base do microscópio, o interruptor da lâmpada e o regulador da intensidade luminosa. Condensador: de forma circular e situado entre a platina e a base, o condensador converge os raios luminosos provindos da lâmpada e projeta-os como um cone de luz sobre o material que está sendo examinado. Receptáculo do filtro: peça de forma circular, presa ao condensador, destinada à recepção de um filtro. Este é uma placa de vidro colorida (azul, verde, etc.) que torna a luz adequada ao uso. Diafragma ou íris: fica acima do receptáculo do filtro e se liga a uma alavanca que permite sua abertura ou fechamento, levando ao controle da passagem total ou parcial da luz. Objetivas: são lentes que projetam uma imagem aumentada e invertida do objeto nas oculares e inserem-se ao revólver, através de rosca. Toda objetiva traz gravado o número do aumento que proporciona. A objetiva de 100x é também chamada objetiva de imersão eé somente utilizada com óleo especial, o qual permite maior refração da luz para dentro da objetiva, corrigindo a pouca luminosidade nas observações feitas em grandes aumentos. Ocular: aumenta a imagem do objeto após o aumento já proporcionado pela objetiva. É através desta lente que o observador vê a imagem do objeto (daí o nome ocular, uma vez que o olho do observador está colocado à frente dela) como se ela estivesse situada a 25 cm da ocular. Toda ocular traz gravado o número de aumentos que proporciona. Par saber-se em que aumento se está observando um objeto ao microscópio, basta multiplicar o número do aumento dado pela objetiva pelo número do aumento dado pela ocular. Por exemplo, se a objetiva usada aumenta 5 vezes e a ocular aumenta 10 vezes, o objeto está sendo observado com um aumento total de 50 vezes. Em microscópios binoculares, normalmente há, na base de uma ou de ambas oculares, um anel de ajuste de dioptria para equalizar possíveis diferenças no ponto de foco entre os olhos. Parafusos macrométrico e micrométrico: na parte lateral da coluna existem 2 parafusos encaixados um no outro. O maior deles é o macrométrico, que permite grandes avanços ou recuos da platina em direção à objetiva, enquanto o parafuso micrométrico permite pequenos avanços ou recuos. Esse movimento da platina leva à focalização do material observado em diferentes aumentos. 6 03 - MANUSEIO DO MICROSCÓPIO ÓPTICO (DE LUZ) MICROSCÓPIO DE LUZ (ML) - Não arraste o microscópio na bancada. - Quando necessário movimentar o aparelho, carregue-o com as duas mãos. - Evite deixar a luz do microscópio acesa quando não estiver utilizando. - Antes de desligar o aparelho, apague a luz, e volte para a menor objetiva de uso. - O microscópio é um aparelho sensível, formado por um conjunto de lentes e espelhos, por isso tenha o maior cuidado ao manuseá-lo! - Objetivas: pequena: 4X, média: 10X, grande: 40X, imersão: 100X. - Aumento total: 40X, 100X, 400X, 1000X. - NA DÚVIDA, PERGUNTE!!!!!!!!!! MANUSEIO DO MICROSCÓPIO ÓPTICO (MO): 1. Posicione a objetiva de menor aumento (4X) na posição de uso. 2. Diminua a intensidade da luz utilizando o botão apropriado. 3. Ligue o microscópio, ajuste a distância entre as oculares e a intensidade da luz. 4. Limpe a lâmina a ser examinada e coloque-a sobre a platina com a lamínula voltada para cima. 5. Utilizando o charriot, centralize o corte no meio do campo. 6. Focalize o corte com a objetiva 4X, utilizando o parafuso macrométrico (foco grosseiro). Para facilitar a focalização, pode-se afastar a platina até o ponto máximo e depois ir aproximando-a, girando o macrométrico lentamente até se obter o foco. 7. Melhore o foco usando o parafuso micrométrico (foco fino). 8. Gire o revólver e mude para a objetiva de médio aumento (10X). Acerte o foco com o parafuso micrométrico. De modo geral, as objetivas secas são parafocais, isto é, se o objeto está bem focalizado em um aumento, estará muito próximo do foco nos outros aumentos, sendo necessário apenas o uso do micrométrico para acertar o foco. 9. Utilizando o charriot, escolha a área a ser estudada e centralize-a no campo. 10. Gire o revólver e mude para a objetiva de maior aumento (40X), com cuidado para que a mesma não atinja a lâmina ou quebre a lamínula. No foco, a objetiva de 40X deverá ficar muito próxima da lamínula, mas sem tocar na mesma. Se a imagem estiver muito distante do foco, recomenda-se recomeçar a focalização com a objetiva de menor aumento (volte ao item 6). 11. Afaste ou aproxime o condensador para que o material fique bem iluminado. 7 12. Volte à objetiva 4X para mudar a lâmina ou guardar o microscópio. 13. Utilize uma gaze para limpar periodicamente as lentes do microscópio e a lâmina a ser examinada. GUARDANDO O MICROSCÓPIO ÓPTICO (MO) Para guardar o microscópio siga as seguintes etapas: 1. Utilizando o macrométrico, abaixe a platina até o final; 2. Gire o revolver, para posicionar a objetiva de menor aumento; 3. Retire a lamina; 4. Abaixe o intensidade luminosa; 5. Desligue o botão da luz; 6. Desligue a tomada e a enrole na base do microscópio; 7. Cubra o microscópio com a capa. 8 04 – ROTEIROS DE AULA PRÁTICA PRÁTICA: INTRODUÇÃO À MICROSCOPIA ÓPTICA Materiais: Microscópio, lâminas (25un.), lamínulas (25un.) e água destilada, pipeta de Pasteur (10un.). 1. Considerações Iniciais A microscopia óptica ou de luz possibilita o aumento de imagens através da luz que, após incidir sobre determinada amostra, passa por um conjunto de lentes. O avanço deste tipo de microscopia ocorreu atrelado ao desenvolvimento da óptica, ou seja, o ramo da Física que estuda a luz e sua interação com distintos meios e materiais. Os primeiros microscópios foram criados a partir de 1590 e seus fabricantes foram Zacarias e Francis Janssen (que fabricavam óculos na Holanda). Vários cientistas contribuíram para o desenvolvimento desta área, dentre eles Galileu Galilei, Marcello Malpighi, Antoine van Leeuwenhoek e Robert Hooke. Este último popularizou o uso do microscópio entre os biologistas e foi o primeiro a usar o termo célula no estudo dos seres vivos. Além de ampliar a imagem de um objeto, o microscópio serve para aumentar o poder de resolução do olho humano. Poder de resolução é a capacidade de distinguir dois pontos muito próximos um do outro. Limite de resolução do olho humano – LR = 0,1 a 0,2 mm micrômetro (µm) = 0,001 mm nanômetro (nm) = 0,000001 mm angström (Å) = 0,0000001 mm Os microscópios ópticos têm um limite de resolução da ordem de 0,2 µm, ou seja, as lentes destes microscópios conseguem mostrar dois pontos distintos se estes estiverem separados por distâncias de pelo menos 0,2 µm. É importante lembrar que para uma estrutura ser observada através de um microscópio óptico, é necessário que ela seja suficientemente fina para deixar que os raios luminosos a atravessem, além de ter índices de refração ou coloração diferentes do meio que a circundam. 9 2. Procedimento da aula prática a) Identifique as partes componentes do microscópio disposto sobre a bancada, a partir das explicações dadas e da descrição acima, e complete o esquema abaixo. b) Numere as partes do microscópio óptico e relacione cada parte componente do microscópio com suas respectivas funções. 1. ____________________________________________________________________ 2.____________________________________________________________________ 3. ____________________________________________________________________ 4.____________________________________________________________________ 5.____________________________________________________________________ 6.____________________________________________________________________ 7.____________________________________________________________________ 8.____________________________________________________________________ 9.____________________________________________________________________ 10.___________________________________________________________________ 10 c) Coloque no Microscópio a lâmina com a letra a (da caixa de lâminas). Siga as normas de focalização de imagens para proceder à observação em aumentos de 40, 100 e 400 X. Faça desenhos esquemáticos do que foi observado em cada aumento. A: 40X A: 100X A: 400X d) Como fica a imagem de um material ao microscópio quando comparada com a disposição do mesmo nalâmina? Explique. ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ e) O que acontece com o campo de visão quando se aumenta o tamanho da imagem? Explique. ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ f) O que acontece com a imagem quando você movimenta a lamina para direta? ___________________________________________________________________________ g) O que acontece com a imagem quando você movimenta a lamina em sua direção? ___________________________________________________________________________ h) Complete a tabela abaixo com os dados observados no microscópio. Características Objetivas Ampliação da objetiva 4x 10x 40x 100x Ampliação da ocular Ampliação total 11 PRÁTICA: OBSERVAÇÃO DE MICROORGANISMOS EM CULTURA MISTA ( PARTE I ) Objetivos gerais Após esta atividade prática você poderá ser capaz de: 1. Montar lâminas de microscopia e focalizá-las ao Microscópio Óptico (M. O.) 2. Identificar, pela observação, alguns tipos de microorganismos através do M.O. 3. Desenhar e descrever os microorganismos e as células observadas ao M.O. Material • 12 Frascos de boca larga (ou Becker de 500 ml) • 50 Lâminas e lamínulas • 17 Microscópios • 3 litros de Água estabilizada • 10 Pipeta ou conta-gotas • 17 Cotonetes ou colher de café • 4 frascos com solução diluída de Corante azul de metileno ou iodo • Placas de vidro ou faixa de gase para cobrir os frascos • 1 elásticos de escritório (gominha) • Folhas de alface • Folhas secas de capim com terra • Arroz com casca Procedimentos (A) 1. Separe 4 frascos ou beckers , numere-os e faça o seguinte: no 1º coloque 4 folhas de alface sem lavar picada , no 2º folhas secas de capim e terra mais ou menos até atingir a metade do frasco, no 3º um colher de sopa de arroz com casca e no 4º não coloque. 2. Encha agora os 4 frascos, até a metade, com água de torneira previamente estabilizada e cubra-os com placas de vidro ou gase e gominha. 3. Identifique os 4 frascos com o nome do seu grupo e distribua-os em locais de diferentes temperaturas e luminosidade. 4. Deixe este material em repouso até a próxima aula de biologia (próxima semana) Organismos Microscópicos em Cultura Mista ( Parte II ) 12 Objetivo Continuar a aula anterior verificando organismos unicelulares em uma infusão preparada com antecedência. Material Frascos com as infusões previamente preparadas, microscópio, lâminas e lamínulas, algodão, pipeta. Procedimentos (B) 1. Reúna-se com o mesmo grupo da semana anterior. 2. Separe 4 lamínulas, 4 lâminas e o material dos frascos contendo as infusões preparada com + ou - 5 dias de antecedência. 3. Retire gotas da água da superfície do 1º frasco com a pipeta: conforme orientação da professora, prepare a lâmina, coloque a lâmina pronta na mesa de platina do M.O. e ajuste o microscópio, focalizando a imagem. 4. Observe em aumento menor e médio. Em seguida, faça o mesmo com os outros frascos, retirando gotas de água de diversas partes de cada infusão: do meio e das camadas do fundo e prepare outras lâminas. 5. Regule a iluminação com maior cuidado; tente luz menos intensa, ou luz menos brilhante. 6. Quanto à objetiva, use, primeiro, a de menor aumento, em seguida, a de médio aumento. 7. Observe o número diferente de espécies de microorganismos, o tamanho e a forma dos indivíduos em cada lâmina. Resultado ⇒ Desenhe as diferentes formas que você encontrou no frasco. Aumento: Aumento: Aumento: Aumento: Discussão: 13 a. Quais as estruturas celulares você identificou? Faça um desenho, indicando-as. Aumento: b. A célula pode ser considerada como um ser vivo. Por que? ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ c. Para pensar e pesquisar: As células observadas são procariontes ou eucariontes? Explique. ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ 14 PRÁTICA: TRANSPORTE DE SUBSTANCIAS ATRAVÉS DA MEMBRANA CELULAR Introdução Toda célula possui uma membrana que seleciona a entrada e saída de substâncias da célula. Esta membrana é a membrana plasmática, de constituição lipoprotéica. A entrada e saída de substâncias podem ser feitas com ou sem gasto de energia (ATP), sendo este transporte denominado transporte ativo e transporte passivo, respectivamente. Objetivos: Observar o comportamento da célula em soluções de diferentes concentrações; Entender o transporte passivo; Diferenciar osmose e difusão Material: Cebola Azul de metileno Lâmina e lamínula Microscópio Placa de Petri Solução salina a 10% Papel de filtro ou absorvente Água de torneira Procedimento: A - Retire um pedaço da película interna da cebola. B - Coloque a película de cebola em uma lâmina, pingue uma gota de água de torneira e cubra-a com lamínula C - Leve ao microscópio. Observe. Desenhe. D – Sem retirar a lamínula e com ajuda do papel de filtro enxugue a água, pingue uma gota de azul de metileno e faça-a escorrer para o espaço compreendido entre a lâmina e a lamínula. E - Observe ao microscópio. Desenhe. 15 O que aconteceu com as células? Explique. _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ F - Sem retirar a lamínula e, enxugando o excesso com papel de filtro, retire o azul de metileno, pingue várias gotas de solução salina a 10% e faça-as escorrerem para o espaço compreendido entre a lâmina e a lamínula. G - Observe ao microscópio. Desenhe H- Compare as células com as do item E. Qual a diferença entre elas? Explique _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ I - Responda. Quais as diferenças entre Osmose e a Difusão? _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ J – Pingue, novamente, gotas de água pura sob a lamínula enxugando o excesso com papel absorvente. Observe e desenhe. Explique o que aconteceu: _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________16 PRÁTICA: OBSERVAÇÃO DE NÚCLEO, CITOPLASMA E MEMBRANA CELULAR DAS CELULAS DA BOCHECHA Observação de células Eucariotas Objetivos: Preparar lâminas de microscopia Observar células humanas e vegetais ao microscópio óptico. Diferenciar células vegetais de células animais. Material: Azul de metileno Lâmina e lamínula Microscópio Papel de filtro ou absorvente Cotonete ou palito de picolé Planta aquática – Elodea sp. Procedimentos 1 Raspe a mucosa bucal de um dos componentes do seu grupo com um cotonete ou palito de picolé. Coloque o material sobre a lâmina, pingue uma gota de solução de azul de metileno diluída sobre ele, cubra com a lamínula e leve a lâmina preparada ao M.O. Focalize em aumento menor e médio. Resultado 1 ⇒ Desenhe e descreva o que você observou. Aumento: Procedimentos 2 17 Retire um pedaço do folíolo da Elodea sp. e coloque-o sobre a lâmina. Pingue uma gota de água sobre o folíolo e cubra o preparado com lamínula. Leve a lâmina preparada ao M.O. Focalize em aumento menor e médio. Resultado 2 ⇒ Desenhe e descreva o que você observou. Aumento: Discussão a. Por que algumas células da mucosa bucal estão soltas e outras em grupos? ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ b. Quais as diferenças observadas entre as células da mucosa bucal e da Elodea? O que faz com que elas apresentem essas diferenças? ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ c. Qual a capacidade fisiológica presente nas células da Elodea sp.e ausente na célula da bochecha e que nos faz dependentes dos seres autótrofos? Explique. ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ 18 PRÁTICA: NÚCLEO INTERFÁSICO E EM DIVISÃO Material: caixa de lâminas fixadas e microscópio LÂMINA 06 e 07: corte de raiz de cebola Coloração: HE (lâmina 06) e Feulgen (lâmina 07) Em pequeno aumento, observe que a lâmina apresenta vários cortes de raiz de cebola. Em médio e grande aumento escolha um corte preservado (mais corado), focalize a extremidade do corte da raiz e procure núcleos interfásicos e em divisão. Identifique e desenhe todas as fases da divisão celular. - Núcleos interfásicos - cromatina organizada em finos grânulos basófilos e nucléolo evidente. - Divisão celular: Didaticamente é dividida nas seguintes fases: prófase, metáfase, anáfase e telófase. • Prófase - núcleos arredondados (inicio da prófase), ausência de nucléolo, presença de filamentos de cromatina que gradativamente se condensam organizados em forma de um emaranhado ou como pontos mais grosseiros. • Metáfase – Grau máximo de condensação dos cromossomas dispostos na placa equatorial da célula. • Anáfase - Cromátides separadas (pólos opostos da célula). Às vezes são visíveis os fusos mitóticos. • Telófase – Descondensação dos cromossomas, reorganização do núcleo. Processo de citocinese. Obs.: Como o processo é contínuo, existem fases intermediárias que não precisam ser identificadas. A:______
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