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Atividade Enzimática - amilase

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INTRODUÇÃO
	A digestão dos alimentos é iniciada na boca, onde se verifica, essencialmente, a mastigação, havendo a quebra das grandes partículas alimentares em outras de menores dimensões que vão em seguida ser deglutidas. Ao mesmo tempo que o alimento é mastigado dá-se a mistura deste com a secreção enzimática proveniente na sua maior parte, dos três pares de glândulas salivares – parótidas, submaxilares ou mandibulares e sublinguais - embora haja ainda a contribuição de pequenas glândulas orais. 
	As enzimas são proteínas sólidas biodegradáveis altamente específicas com uma estrutura química especial, contendo um centro ativo, denominado apoenzima e muitas vezes um grupo não proteico, denominado coenzima, que pode ser um íon metálico ou uma molécula orgânica. Elas podem substituir muitos produtos químicos nocivos ou até perigosos a saúde e permitem uma produção segura e correta, são bastante solúveis em água e álcool diluído, podendo ser inativadas pelo calor ou precipitadas pelo pH. Devido ao seu grande poder de ativação específica e de conversão de substratos em produtos, elas atuam acelerando ou aumentado a velocidade das reações químicas como forma de atividade catalítica de determinadas moléculas, o catalisador é um composto que acelera uma reação química ao diminuir a energia de ativação. A sua principal característica é a especialidade com o substrato, cada substrato possui uma enzima especifica, que associados se encaixam como “chave e fechadura”. 
	A amílase salivar, também frequentemente designada por -amílase é a principal enzima secretada pelas glândulas salivares A amilase é uma hidrolase que tem a função de degradar carboidratos, portanto a digestão do amido tem início na boca por ação da enzima α-amilase salivar, conhecida também por ptialina, que hidrolisa as ligações (14) das cadeias do amido, produzindo glicose, maltose e oligossacarídeos. A α-amilase salivar é uma enzima unida ao cálcio que inicia a digestão do amido na cavidade oral. Os genes da α-amilase estão localizados em um cluster no cromossomo que inclui os genes da amilase salivar (AMY1), dois genes da α-amilase pancreática (AMY2A e AMY2B) e um pseudogene relacionado. Os genes AMY1 demonstram extensa variação do número de cópias que é diretamente proporcional ao teor da α-amilase salivar na saliva. A quantidade de α-amilase é também influenciada por outros fatores, tais como estado de hidratação, nível de estresse psicossocial e hábitos alimentares de curto prazo.
	 Além da função digestiva, a α-amilase salivar liga-se com alta afinidade a um grupo selecionados de estreptococos orais, uma função que pode contribuir para o clearance e nutrição bacteriana. O fato da α-amilase salivar também ser encontrada na película adquirida do esmalte sugere uma função na adesão das bactérias ligadas a α-amilase salivar. Todas estas atividades biológicas parecem ser dependentes de uma conformação enzimática intacta. A secreção da α-amilase salivar é influenciada pela regulação adrenérgica do sistema nervoso simpático e pelo eixo hipotálamo-pituitária-adrenal, por isso tem sido proposto como biomarcador de mudanças relacionados ao estresse no corpo, o qual reflete atividade do sistema nervoso simpático. Os níveis de α-amilase salivar também podem servir como um efetivo indicador para a avaliação não-invasiva do estresse físico.
	A principal função da amilase salivar, pesquisada nesse estudo, dentro do trato gastrointestinal é a quebra do amido. A amílase salivar apenas atua em situações de pH próximo da neutralidade, motivo pelo qual o pH da boca varia entre os 6 e os 7.4. A sua ação prolonga-se mesmo no decurso do processo de deglutição, até à chegada ao estômago, onde é inativada pelo pH ácido do suco gástrico. 
A ação enzimática na cavidade bucal tem pouca expressão no processo digestivo, devido ao pouco tempo de contato entre as enzimas presentes na saliva e o alimento neste local. 
Uma mastigação lenta e persistente permite uma degradação mais efetiva do amido na boca, permitindo um aproveitamento mais eficaz deste nutriente. O amido não digerido pela amílase salivar apenas será transformado, posteriormente, ao nível do duodeno, por ação da amílase pancreática. Esse processo pode ser observado em laboratório, assim como os fatores que o influenciam, como as variações em temperatura e pH. 
OBJETIVO
Verificar como os fatores (PH, temperatura e concentração) podem interferir na atividade enzimática e determinar se houve ou não atividade enzimática através da cor da reação após cada experimento.
MATERIAL 
Cronômetro 
Béquer de Vidro de 50 ml
Água destilada
Gaze 
Funil de Vidro
Erlenmeyer 
Solução Tampão pH = 7 
Amido a 2%
Lugol 
Estufa de 37º C e 100º C. 
Tubos de ensaio
Estante para tubos de ensaio
Gelo
Saliva (4 ml)
MÉTODO
Inicialmente os alunos recolheram a saliva para realizar o experimento, foi necessário coletar de todos os integrantes do grupo para obter a quantidade necessária, cerca de 4ml. Para tal coleta os alunos cuspiram no béquer de vidro. 
Adicionou-se aproximadamente 10 ml de água destilada no béquer e, posteriormente realizou-se a filtração, utilizando o funil de vidro, a gaze e o Erlenmeyer. 
Após a filtração do fluído, foi necessário homogeneizar a solução, que agora estaria pronta para a realização dos procedimentos. 
Para verificar a influência da temperatura na atuação da enzima foi adicionado 1ml de solução tampão de pH 7 e 1 ml de amido a 2% em 3 tubos diferentes. Os tubos foram separados e colocados em banho maria nas temperaturas de 0º C, 37º C e 100º C, por 10 minutos. Sem retirar os tubos das temperaturas desejadas adicionou-se então 1ml de saliva em cada um, deixando em banho maria por mais 10 minutos. Após esse tempo, foram adicionadas 2 gotas de Lugol em cada um. Agitou-se o tubo de ensaio para obter a coloração. 
Para verificar a influência do pH na atuação da enzima foi adicionado 1ml de solução tampão de pH 2, 7 e 13 em três diferentes tubos, junto com 1ml de amido a 2% e 1ml de saliva. Os tubos foram colocados em banho maria na temperatura de 37º C, por 10 minutos. Após esse tempo, foram adicionadas 2 gotas de Lugol em cada um. Agitou-se o tubo de ensaio para obter a coloração. 
Para verificar a influência concentração na atuação da enzima foi adicionado 1ml de solução tampão de pH 7 e 1 ml de amido a 2% em 4 tubos diferentes. No tubo de número 1 não foi adicionado saliva, no tubo de número 2 adicionou-se 0,5ml de saliva, no tubo 3 1ml, e no tubo 4 2ml de saliva. Todos os tubos foram colocados em banho maria na temperatura de 37º C por 10 minutos. Após esse tempo, foram adicionadas 2 gotas de Lugol em cada um. Agitou-se o tubo de ensaio para obter a coloração. 
RESULTADOS
Influência da Temperatura 
	 Tubos
	 1
	 2
	 3
	Solução tampão pH 7
	 1ml
	 1ml
	 1ml
	Amido a 2%
	 1ml
	 1ml
	 1ml
	10' em banho maria
	 0°C
	 37°C
	 100°C
	Saliva
	 1ml 
	 1ml
	 1ml
	10' em banho maria
	 0°C
	 37°C
	 100°C
	Lugol
	 2 gotas
	 2 gotas
	 2 gotas
	Agitar e anotar a cor
	 Roxo escuro 
	 Translucido
	 Purpura
Influência do pH:
	 Tubos 
	 1
	 2
	 3
	1ml de solução tampão 
	 PH 2,0
	 PH 7,0
	 PH 13,0
	Amido a 2%
	 1ml
	 1ml
	 1ml
	Saliva
	 1ml
	 1ml
	 1ml
	Banho Maria 37°C
	 10'
	 10'
	 10'
	Lugol
	 2 gotas
	 2 gotas 
	 2 gotas 
	Agitar e anotar a cor 
	 Azul
	 Amarelo
	 Roxo claro
Influência da concentraçãode enzimas:
	 Tubos
	 1
	 2
	 3
	 4
	Solução tampão pH 7,0
	 1ml
	 1ml
	 1ml
	 1ml
	Amido a 2%
	 1ml
	 1ml
	 1ml
	 1ml
	Saliva
	 0ml
	 0,5ml
	 1ml
	 2ml
	Banho Maria 37°C
	 10'
	 10'
	 10'
	 10'
	Lugol 
	 2 gotas
	 2 gotas 
	 2 gotas
	 2 gotas
	Agitar e anotar a cor
	 Roxo escuro 
	 Roxo claro 
	 Translúcido 
	 Translúcido 
DISCUSSÃO
Os resultados obtidos encontram-se dentro da normalidade.
Foi feito um experimento que visou analisar a atividade enzimática da amilase salivar (ptialina), através da: temperatura, do pH e da concentração enzimática, que são os fatores que influenciam a atividade enzimática.
A temperatura ideal para que ocorra a atividade da ptialina é 37°C.Contudo entre 35°C a 40°C ela ainda realiza sua atividade enzimática, de forma que abaixo de 35°C a enzima deixa de realizar sua atividade enzimática, assim como acima de 40°C a enzima desnatura perdendo sua atividade.
O pH ideal para a atividade enzimática da amilase salivar (ptialina) é o mais próximo da neutralidade, sendo o pH 7,0 o ideal. Motivo pelo qual a enzima atua na boca, a qual possui um pH que varia entre 6 a 7,4. De forma que a enzima não consegue fazer a digestão ideal do amido em pH alcalino e pH ácido.
A concentração da enzima atua de forma que, quanto maior a concentração da enzima maior a sua atividade enzimática. Assim como, quanto menor a concentração da enzima menor a sua função.
Ao realizar a alteração de algum desse fatores, nota-se a redução gradativa da atividade enzimática até seu cessamento. Para analisar a influência desses fatores, foram adicionados em frascos: amido a 2%, o qual é quebrado em maltose pela ptialina; saliva, a qual possui a enzima ptialina; assim como foi adicionado o lugol, que é um indicador para testar a presença de amido na solução. O corante (lugol) irá colorir o amido à medida que interage com a estrutura enrolada (forma helicoidal) do polissacarídeo, produzindo uma cor azul escura/ roxo escuro. Ao colorir com a cor roxo escuro/ azul escuro indica que ainda está presente o amido, ou seja, significa que não ocorreu a quebra do amido em maltose. O lugol ao colorir em amarelo/ translucido significa que o amido foi quebrado em maltose, não restando amido para reagir com o mesmo.
Temperatura: para analisar a temperatura, foram separados 3 frascos, cada um com solução tampão com pH 7.0, amido a 2%, saliva e o lugol. Cada frasco foi adicionado ao banho maria por 10 minutos antes de acrescentar o lugol, após acrescentar-se o lugol novamente, o frasco 1 foi colocado a uma temperatura de 0°C por 10', o frasco 2 foi colocado a uma temperatura de 37°C por 10' e o frasco 2 foi colocado a uma temperatura de 100°C por 10'. O frasco 1, após a adição do lugol obteve-se uma coloração roxo escuro, a qual já era esperada visto que a enzima ptialina mesmo estando em um pH ideal, e em uma concentração adequada, não conseguiu realizar sua atividade enzimática, pois ela não degrada o amido em maltose em uma temperatura muito abaixo de sua temperatura ótima.
O frasco 2, após a adição do lugol, foi obtida uma coloração translucida, ou seja, a qual já era esperada, pois a ptialina estava em um pH ideal, com uma concentração adequada, e em sua temperatura ótima para a ação enzimática, ou seja, o amido que estava presente na solução foi degradado em maltose. 
O frasco 3, após a adição do lugol, foi obtida uma coloração purpura, ou seja, a qual já era esperada, pois a ptialina mesmo estando em um pH ideal, com uma concentração adequada, a temperatura estava muito acima da temperatura ideal para que ocorresse a ação enzimática, de forma que a ptialina desnaturou não sendo possível então converter o amido em maltose.
PH: para analisar o pH, foram separados 3 frascos, cada um com amido a 2%, saliva contendo 1 ml e colocados em banho maria 37°C por 10'. No frasco 1 foi acrescentado 1ml de solução tampão com pH 2.0 que significa uma solução acida, seguido da adição de duas gotas de lugol, obtendo-se coloração azul, a qual era esperado, pois a ptialina não consegue fazer a quebra do amido.
No frasco 2 foi acrescentado 1ml de solução tampão com pH 7.0, seguido da adição de duas gotas de lugol, de forma que a solução obteve coloração amarelada, a qual era esperada pois indica que o amido foi quebrado em glicol. No frasco 3 foi acrescentado 1 ml de solução tampão com pH 13.0, que significa uma solução alcalina, seguido da adição de duas gotas de lugol, obtendo-se coloração roxo claro, o que está dentro do esperado, já que o amido não foi quebrado.
Enzima: para analisar a concentração enzimática foram separados 4 frascos, cada um com amido a 2% e foram colocados em banho maria a 37°C. No frasco 1 não foi adicionado saliva, após ser adicionado 2 gotas de lugol, a solução obteve a cor roxo escuro, a qual está dentro do esperado, visto que a ausência da enzima ptialina evidencia que não foi possível a quebra do amido, já que é necessário a presença da mesma para que ocorra a ação enzimática.
No frasco 2, foi adicionado 0,5 ml de saliva, após a adição de 2 gotas de lugol a solução obteve coloração roxo claro, o que significa que ocorreu uma pequena ação enzimática, devido à pouca quantidade da ptialina em relação com a quantidade de amido que deveria ser quebrado em maltose.
No frasco 3, foi acrescentado 1 ml de saliva e duas gotas de lugol, e a solução obteve coloração translucida, o que significa que em uma maior concentração a ptialina é capaz de degradar uma maior quantidade de amido.
No frasco 4, foi acrescentado 2ml de saliva e duas gotas de lugol, e a solução obteve coloração translucida, concluindo-se então que quanto maior a concentração da enzima ptialina, maior a sua ação enzimática.
CONCLUSÃO
A partir da análise do experimento, foi possível concluir que, a Hidrolise enzimática permite avaliar os diferentes fatores que interferem na atividade enzimática, o qual foi dividia em influência da temperatura, influência do PH e a influência da concentração de enzima.
Após o teste de influência da temperatura foi verificado que, a temperatura é um fator muito importante na atividade das enzimas, pois dentro de certos limites, a velocidade da reação aumenta com o aumento da temperatura, mas a partir de certa temperatura a velocidade e a ação das enzimas diminuem bruscamente.
Outro fator que visto, é a influência do PH na atividade enzimática, onde assim como no caso da temperatura, existe um valor ideal para a atividade enzimática, onde em um PH ácido (PH 2,0) não houve a quebra do amido em carboidrato, já em um PH neutro (PH 7,0) houve o resultado esperado, onde o amido foi quebrado em maltose, indicado pela coloração amarelada após a reação, já com uma solução alcalina (PH 13,0) foi obtido um resultado dentro do esperado também, onde o amido não foi quebrado em maltose.
Com esses dois fatores, foi concluído que no caso da temperatura e do PH, existe um valor ótimo para ocorrer a quebra do amido.
Em relação à concentração de enzima foi concluído que quanto maior a concentração de enzima, maior será sua atividade enzimática.
REFERÊNCIAS
GUYTON, A. C. & HALL, J. E.; 2010. Trata-o de Fisiologia Médica. 10 ed. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro.
COSTANZO, Linda S. Fisiologia. 5. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2014.
Descritores em Ciências da Saúde: DeCS 2017 ed. re. E ampl. Sâo Paulo: BIREME / OPAS / OMS, 2017. Disponível em: <http://decs.bvsalud.org>. Acesso em 17 mar. 2018. 
MORITA, T; ASSUMPÇÃO, R.M.V. Manual de soluções, reagentes e solventes. 2. ed., São Paulo: Edgard Blücher, 1986.
LEHNINGER, A.L.; NELSON, D.L.; COX, M.M. Princípios de Bioquímica. 2. ed. São Paulo: Sarvier, 2000. 839p.
GRANGER, Kivlighan KT, el-Sheikh M, Gordis EB, Stroud LR. Salivary alpha-amylasein biobehavioral research: recent developments and applications. Ann N Y Acad Sci. 2007 Disponível em: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17332070 Acesso em 19 mar 2018. 
HUMPREYy SP, Williamson RT. A review of saliva: normal composition, flow, and function. J Prosthet Dent. 2001; Disponível em: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11208206 Acesso em 19 mar 2018.
KOIBUCHI E, Suzuki Y. Exercise upregulates salivary amylase in humans (Review). Exp Ther Med. 2014 Disponível em: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24669232 Acesso em 19 mar 2018. 
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