Aula 1 Espetrofotometria atualizado

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UNIVERSIDADE DO ESTADO DA BAHIA 
Departamento de Ciências da Vida (DCV) 
Disciplina: CCS018 - BIOQUÍMICA 
Docentes: Erika Ribeiro, Monica Rapold e Polyanna Carôzo 
 
 
AULA PRÁTICA 1. ESPETROFOTOMETRIA 
 
 
1. INTRODUÇÃO 
A maioria das análises efetuadas em Bioquímica Clínica finaliza com a medida da 
quantidade de energia absorvida por uma solução colorida, obtida pela reação entre o composto 
a ser analisado e o reagente (reagente cromogênico), e isto nos obriga a conhecer as teorias e 
os instrumentos empregados para execução dessas medidas. A espectrofotometria pode ser 
definida como toda técnica analítica que usa a luz para medir as concentrações das soluções, 
através da interação da luz com a matéria. Os métodos que se baseiam nesse princípio são 
denominados “colorimétricos”. A grande vantagem em utilizar compostos coloridos deve-se ao 
fato de eles absorverem luz visível (região visível do espectro eletromagnético). Esse espectro 
visível limita-se na região de pequenos comprimentos com o ultravioleta e na região de grandes 
comprimentos com o infravermelho e pode ser dividido nas seis cores fundamentais, com suas 
respectivas faixas de comprimento de onda: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Quando um feixe de luz monocromática atravessa uma solução com moléculas 
absorventes, parte da luz é absorvida pela solução e o restante é transmitido. A absorção de luz 
depende basicamente da concentração das moléculas absorventes e da espessura da solução 
– caminho óptico. Quando uma solução de um dado composto é submetida a leituras de 
absorbância ao longo de uma faixa de comprimentos de onda eletromagnética, passamos a ter 
informações referentes à capacidade do composto em absorver luz. A representação gráfica dos 
valores de comprimento de onda ( ) versus absorbância é denominada espectro de absorção. 
Como a interação da luz com a matéria depende da estrutura química dos compostos, o 
espectro de absorção é uma forma de caracterização que permite verificar qual a faixa de 
comprimento de onda em que um dado composto apresenta sua maior afinidade de absorção. 
 
 
 
 
Cor Fundamental Comprimento de Onda 
Ultravioleta 180 - 400 (invisível) 
Violeta 400 - 450 
Azul 450 - 500 
Verde 500 - 570 
Amarelo 570 590 
Alaranjado 590 - 620 
Vermelho 620 - 750 
Infravermelho 750 – (invisível) 
 EXPERIMENTO 1: DETERMINAÇÃO DE ESPECTRO DE ABSORBÂNCIA DE CORANTES E 
CONSTRUÇÃO DA CURVA PADRÃO 
 
1. MATERIAIS E EQUIPAMENTOS 
Solução de azul de metileno 0,01 mg/mL (AM) 
Solução de vermelho de metila 0,01 mg/mL (VM) 
Solução de Dicromato de Potássio 0,01 mg/mL (DP) 
Tubos de ensaio 
Estante para tubos de ensaio 
Pipetas de 5 mL 
Espectrofotômetro 
 
2. OBJETIVOS 
• Determinar o espectro de absorção das soluções de AM, VM e DP; 
• Caracterizar o comprimento de onda onde ocorre a absorção máxima; 
• Construir uma curva padrão para um dos corantes. 
 
 
3. PROCEDIMENTOS 
A. Ligar o espectrofotômetro segundo as instruções constantes do manual do aparelho. 
B. Coletar os dados para a construção do espectro de absorção das soluções coloridas. 
- Usando água destilada como referência para cada λ, efetuar as leituras de absorbância 
das soluções nos comprimentos de onda descritos na tabela abaixo. 
- Anote os resultados no quadro abaixo. 
- Utilizando os dados coletados, prepare um gráfico (x = comprimento de onda em nm) e 
(y = leitura em absorbância), encontrando qual o comprimento de onda de máxima 
absorção para cada corante usado. 
 
 
Corante: Azul de Metileno Concentração: 0,01 mg/mL 
λ (nm) Absorbância λ (nm) Absorbância 
415 535 
445 550 
460 580 
490 610 
520 640 
 
 
 Corante: Vermelho de Metila Concentração: 0,01 mg/mL 
λ (nm) Absorbância λ (nm) Absorbância 
415 535 
445 550 
460 580 
490 610 
520 640 
 
 Corante: Dicromato de Potássio Concentração: 0,01 mg/mL 
λ (nm) Absorbância λ (nm) Absorbância 
415 535 
445 550 
460 580 
490 610 
520 640 
 
C. Demonstração da Lei de Lambert-Beer 
- Ajuste o aparelho para o comprimento de onda mais adequado à sua solução; 
- Determine os valores das absorbâncias das soluções-padrão preparadas pelo seu 
grupo de acordo com o quadro abaixo. 
- Ajuste o aparelho para o comprimento de onda mais adequado à sua solução. 
- Determine os valores das absorbâncias das soluções-padrão preparadas pelo seu 
grupo, de acordo com o quadro abaixo. 
 
Tubo (n°) Água (mL) AM (mL) Concentração Absorbância 
0 5 0 
1 4 1 
2 3 2 
3 2 3 
4 1 4 
5 0 5 
 
 
Tubo (n°) Água (mL) VM (mL) Concentração Absorbância 
0 5 0 
1 4 1 
2 3 2 
3 2 3 
4 1 4 
5 0 5 
 
 
Tubo (n°) Água (mL) DP (mL) Concentração Absorbância 
0 5 0 
1 4 1 
2 3 2 
3 2 3 
4 1 4 
5 0 5 
 
 - Construa os gráficos relacionando as concentrações das amostras com os valores de 
absorbância. 
Discussão: 
 
a) Por que ao se variar o comprimento de onda incidido sobre a amostra têm-se uma 
variação no valor da absorvância? 
b) O que foi possível identificar com os resultados obtidos no gráfico 1/Procedimento B? 
Explique. 
c) Que informação nos fornece uma curva padrão de determinada substância e como 
aplicar essa técnica na bioquímica? 
 
 
 
Bom Trabalho!