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FACULDADE LEÃO SAMPAIO – PROF. EDINARDO FAGNER F. MATIAS - DISCIPLINA: GENÉTICA E EVOLUÇÃO Terapia Gênica Por terapia gênica se entende a transferência de material genético com o propósito de prevenir ou curar uma enfermidade qualquer. No caso de enfermidades genéticas, nas quais um gene está defeituoso ou ausente, a terapia gênica consiste em transferir a versão funcional do gene para o organismo portador da doença, de modo a reparar o defeito. Se trata de uma idéia muito simples, mas como veremos sua realização prática apresenta vários obstáculos. Primeira etapa: o isolamento do gene. Um gene é uma porção de DNA que contém a informação necessária para sintetizar uma proteína. Transferir um gene é transferir um pedaço particular de DNA. Portanto, é necessário antes de tudo, possuir “em mãos” o pedaço correto. As enfermidades genéticas conhecidas estão ao redor de 5000, cada uma causada por uma alteração genética diferente. O primeiro passo para a terapia gênica é identificar o gene responsável pela enfermidade. Subsequentemente, pelas técnicas de biologia molecular é possível adquirir um pedaço de DNA que contém este gene. Esta primeira etapa é chamada de isolamento ou clonagem do gene. Qualquer enfermidade é candidata a terapia gênica, desde que o gene esteja isolado para a transferência. Graças ao progresso da biologia molecular esta primeira etapa é relativamente simples em comparação a alguns anos atrás. Tem sido possível isolar numerosos genes causadores de doenças genéticas e, se descobrem outros a cada semana. In vivo ou em ex-vivo? Estas condições mostram qual é o objetivo da transferência gênica. Os procedimentos da terapia gênica in vivo consistem em transferir o DNA diretamente para as células ou para os tecidos do paciente. Nos procedimentos ex-vivo, o DNA é primeiramente transferido para células isoladas de um organismo, previamente crescidas em laboratório. As células isoladas são assim modificadas e podem ser introduzidas no paciente. Este método é indireto e mais demorado, porém oferece a vantagem de uma eficiência melhor da transferência e a possibilidade de selecionar e ampliar as células modificadas antes da reintrodução. Como se transfere o DNA a célula hospedeira? Os procedimentos de transferência do DNA in vivo ou em ex-vivo têm o mesmo propósito: o gene deve ser transferido para dentro das células, e uma vez inserido tem que resistir bastante tempo. Neste tempo, o gene tem que produzir grandes quantidades de proteína para reparar o defeito genético. Essas características podem ser resumidas em um único conceito: o gene estranho precisa se expressar de modo efetivo no organismo que o receberá. O sistema mais simples seria, naturalmente, injetar o DNA diretamente nas células ou nos tecidos do organismo a ser tratado. Na prática, este sistema é extremamente ineficaz: o DNA desnudo quase não apresenta efeito nas células. Além disso, essa tentativa requer a injeção em uma única célula ou grupos de células do paciente. Por isto, quase todas as técnicas atuais para a transferência de material genético implicam o uso devetores, para transportar o DNA para as células hospedeiras. FACULDADE LEÃO SAMPAIO – PROF. EDINARDO FAGNER F. MATIAS - DISCIPLINA: GENÉTICA E EVOLUÇÃO Os vetores virais Os vetores virais são vírus manipulados geneticamente, de modo a reduzir a sua patogenicidade, sem anular totalmente o seu poder de infectar as células do hospedeiro (leia mais sobre isso no conteúdo de vírus) Com as técnicas da engenharia genética é possível somar ao DNA do vírus o gene que se quer transferir a determinada célula. Deste modo, o vírus infectando a célula, trará consigo uma ou mais cópias do gene desejado. Os retrovírus possuem a habilidade de integrar o seu DNA dentro dos cromossomos da célula infectada. Então, o gene será inserido no genoma das células hospedeiras e, podem assim ser transmitidos a todas as células-filhas das infectadas. Eles infectam somente as células que estão proliferando. Os lentivírus, como o HIV, permitem também transferir material genético para células que não proliferam (como os neurônios e células do fígado) ou para células refratárias para o retrovírus (como as células retiradas da medula óssea). Os adenoassociados de vírus também integram o seu DNA ao cromossomo da célula hospedeira. Eles têm a vantagem de serem inofensivos para a natureza em relação ao retrovírus, mas não são capazes de transportar genes de dimensões grandes. Os adenovírus não são capazes de integrar o seu DNA ao cromossomo da célula hospedeira. Eles podem transportar genes de grandes dimensões, mas a expressão deles não dura muito tempo. Os vetores não virais Os lipossomos são essencialmente os únicos vetores não virais utilizados frequentemente. As esferas de lipídeos podem ser um importante meio para a transferência gênica. Em comparação aos vírus, eles têm a vantagem de não introduzir algum risco em condições de segurança, mas eles não possuem grande eficiência e são muito seletivos. Os limites da terapia gênica As principais dificuldades enfrentadas por pesquisadores que lidam com terapia gênica são as seguintes: FACULDADE LEÃO SAMPAIO – PROF. EDINARDO FAGNER F. MATIAS - DISCIPLINA: GENÉTICA E EVOLUÇÃO A eficiência da transferência Um especialista em terapia gênica uma vez afirmou: “a terapia gênica” sofre de três problemas técnicos principais; a transferência, a transferência e a transferência”. Nos estudos de terapia gênica, a maior parte dos esforços é concentrada na procura de vetores que possam transferir o DNA de modo eficiente, principalmente para células desejadas. Nestes últimos anos foram inventados e testados uma grande variedade de vetores, alguns dos quais com chances de expressar o gene estranho em um tipo celular específico (como glóbulos brancos, células do músculo, das vias respiratórias, etc.). Alguns destes estão em vias de experimentação no homem e, a esperança é que apareçam resultados bons. A duração da expressão A terapia gênica é praticamente inútil se a expressão do gene estranho não é mantida por um bom período de tempo. As pesquisas estão orientadas de maneira a desenvolver sistemas que apresentem uma expressão duradoura, de modo a submeter o paciente a um único tratamento, ou a tratamentos repetidos em períodos maiores (anos). A segurança do procedimento Este é um problema particularmente evidente para os vetores virais. Alguns destes derivam de vírus perigosos como o HIV. É então necessário que antes do uso destes vetores sejam submetidos a critérios de segurança, particularmente no que concerne a presença de genes que podem determinar a patogenicidade do vírus utilizado para infectar (transferir o gene desejado) para as células do hospedeiro. A reação imunitária Como toda substância estranha, o produto do gene novo, o gene propriamente dito ou seu vetor podem instigar uma resposta imunitária no organismo sob tratamento. Isto pode causar a eliminação das células modificadas geneticamente, ou a inativação da proteína produzida pelo gene novo. No desenvolvimento de estratégias novas de terapia gênica procura-se evitar respostas imunitárias ao vetor ou ao produto do gene introduzido. Se trata de uma tarefa difícil e frequentemente empírica, mas isso é cada vez mais usado em inovações no campo da imunologia. Primeiros resultados Uma primeira tentativa foi realizada na cura da Síndrome da Imunodeficiência Severa em recém-nascidos, doença provocada pela ausência da enzima adenosina deaminase, o que provoca falhas na resposta imunitária, conduzindo à morte. O gene que codifica para essa enzima foi clonado e injetado com sucesso em leucócitos retirados de crianças afetadas. Em seguida, essas células brancas foram reinjetadasno organismo das crianças. Os resultados são encorajadores, esbarrando, porém, em uma particularidade – glóbulos brancos possuem vida curta e, por esse motivo, a terapia gênica precisa ser constantemente repetida. Terapia gênica é uma das esperanças dos cientistas em termos de cura e/ou tratamento para a AIDS, doença que , a exemplo da citada acima, incide no sistema imunitário dos pacientes afetados. Um exemplo de sucesso Cientistas americanos dizem estar mais próximos da cura do daltonismo usando terapia genética, de acordo com um estudo divulgado na revista científica "Nature" (09/2009). A equipe das Universidades de Washington e da Flórida conseguiu reparar a capacidade de perceber cores em macacos- de-cheiro (Saimiri sciureus) adultos. A espécie já nasce sem a habilidade de distinguir entre o vermelho e o verde porque a visão total depende de duas versões de um gene chamado opsina, carregado no cromossomo X - uma versão traz o fotorreceptor sensível ao vermelho e a outra ao verde. Como os macacos-de- cheiro machos nascem com apenas um cromossomo X, são daltônicos e incapazes de distinguir entre as duas cores. A equipe comandada pelo professor Jay Neitz conseguiu introduzir o gene da opsina humano que detecta a cor vermelha nas células receptoras de luz atrás da córnea de macacos FACULDADE LEÃO SAMPAIO – PROF. EDINARDO FAGNER F. MATIAS - DISCIPLINA: GENÉTICA E EVOLUÇÃO adultos. Para testar a eficiência da terapia genética, os cientistas testaram os macacos Dalton e Sam. Durante o teste, os animais tinham que identificar as cores em imagens computadorizadas e recebiam um prêmio - um copo de suco - quando acertavam. Os resultados indicam que o tratamento foi bem-sucedido. Os macacos que se submeteram ao processo possuem os fotopigmentos necessários para ver todas as cores e foram capazes de distinguir o verde e o vermelho. Segundo Neitz, as melhorias conquistadas pelo tratamento realizado há dois anos permanecem estáveis, mas os cientistas continuarão monitorando os efeitos do tratamento para avaliar o impacto a longo prazo. Humanos Embora ainda sejam necessários mais estudos, Neitz acredita que os resultados oferecem uma perspectiva positiva de que o mesmo tratamento possa ser aplicado em humanos daltônicos. Até agora, cientistas acreditavam que não seria possível manipular o cérebro de adultos desta forma. Acreditava-se que acrescentar receptores visuais necessários para uma visão perfeita poderia ser feito apenas nos primeiros anos de vida quando o cérebro ainda é considerado mais maleável. Winfried Amoaku, especialista em oftalmologia da Universidade de Nottingham, na Inglaterra, acredita que a pesquisa possa eventualmente beneficiar cerca de 7% dos homens e 1% das mulheres nascidas com deficiência genética na visualização das cores. A pesquisa parece ser a primeira em primatas a estudar a deficiência visual das cores e indica que é possível modificar as células em sua percepção da cor", afirmou. "Mais pesquisas são necessárias, no entanto, antes de serem iniciados os testes em humanos e os tratamentos clínicos", alertou o especialista. O que é clonagem? A Clonagem é um mecanismo comum de reprodução de espécies de plantas ou bactérias. Um clone pode ser definido como uma população de moléculas, células ou organismos que se originaram de uma única célula e que são idênticas à célula original. Em humanos, os clones naturais são os gêmeos idênticos que se originam da divisão de um óvulo fertilizado. A grande revolução da Dolly, que abriu caminho para possibilidade de clonagem humana, foi a demonstração, pela primeira vez, de que era possível clonar um mamífero, isto é, produzir uma cópia geneticamente idêntica, a partir de uma célula somática diferenciada. Para entendermos porque esta experiência foi surpreendente, precisamos recordar um pouco de embriologia. Todos nós já fomos uma célula única, resultante da fusão de um óvulo e um espermatozoide. Esta primeira célula já tem no seu núcleo o DNA com toda a informação genética para gerar um novo ser. O DNA nas células fica extremamente condensado e organizado em cromossomos. Com exceção das nossas células sexuais, o óvulo e o espermatozoide que têm 23 cromossomos, todas as outras células do nosso corpo têm 46 cromossomos. Em cada célula, temos 22 pares que são iguais nos dois sexos, chamados autossomos e um par de cromossomos sexuais: O núcleo da célula contém os 23 pares de cromossomos. XX no sexo feminino e XY no sexo masculino. Estas células, com 46 cromossomos, são chamadas células somáticas. FACULDADE LEÃO SAMPAIO – PROF. EDINARDO FAGNER F. MATIAS - DISCIPLINA: GENÉTICA E EVOLUÇÃO Voltemos agora à nossa primeira célula resultante da fusão do óvulo e do espermatozoide. Logo após a fecundação, ela começa a se dividir: uma célula em duas, duas em quatro, quatro em oito e assim por diante. Pelo menos até a fase de oito células, cada uma delas é capaz de se desenvolver em um ser humano completo. São chamadas de totipotentes. Na fase de oito a dezesseis células, as células do embrião se diferenciam em dois grupos: um grupo de células externas que vão originar a placenta e os anexos embrionários, e uma massa de células internas que vai originar o embrião propriamente dito. Após 72 horas, este embrião, agora com cerca de cem células, é chamado de blastocisto. É nesta fase que ocorre a implantação do embrião na cavidade uterina. As células internas do blastocisto vão originar as centenas de tecidos que compõem o corpo humano. São chamadas de células tronco embrionárias pluripotentes. A partir de um determinado momento, estas células somáticas - que ainda são todas iguais - começam a diferenciar-se nos vários tecidos que vão compor o organismo: sangue, fígado, músculos, cérebro, ossos etc. Os genes que controlam esta diferenciação e o processo pelo qual isto ocorre ainda são um mistério. O que sabemos é que uma vez diferenciadas, as células somáticas perdem a capacidade de originar qualquer tecido. As células descendentes de uma célula diferenciada vão manter as mesmas características daquela que as originou, isto é, células de fígado vão originar células de fígado, células musculares vão originar células musculares e assim por diante. Apesar de o número de genes e de o DNA ser igual em todas as células do nosso corpo, os genes nas células somáticas diferenciadas se expressam de maneiras diferentes em cada tecido, isto é, a expressão gênica é específica para cada tecido. Com exceção dos genes responsáveis pela manutenção do metabolismo celular (housekeeping genes) que se mantêm ativos em todas as células do organismo, só irão funcionar em cada tecido ou órgão os genes importantes para a manutenção deste. Os outros se mantêm "silenciados" ou inativos. FACULDADE LEÃO SAMPAIO – PROF. EDINARDO FAGNER F. MATIAS - DISCIPLINA: GENÉTICA E EVOLUÇÃO Clonagem Reprodutiva A grande notícia da Dolly foi justamente a descoberta de que uma célula somática de mamífero, já diferenciada, como a célula da pele, a célula do coração, etc. poderia ser reprogramada ao estágio inicial e voltar a ser totipotente (isto é poder dar origem a qualquer tipo celular novamente). Isto foi conseguido através da transferência do núcleo de uma célula somática da glândula mamária da ovelha que originou a Dolly para um óvulo anucleado (óvulo sem núcleo).Surpreendentemente, este começou a comportar-se como um óvulo recém-fecundado por um espermatozoide. Isto provavelmente ocorreu porque o óvulo, quando fecundado, tem mecanismos, para nós ainda desconhecidos, para reprogramar o DNA de modo a tornar todos os seus genes novamente ativos, o que ocorre no processo normal de fertilização. Ilustraçãode como foi a clonagem da Dolly Para a obtenção de um clone, este óvulo anucleado, no qual foi transferido o núcleo da célula somática, foi inserido para o útero de uma outra ovelha. No caso da clonagem humana reprodutiva, a proposta seria retirar-se o núcleo de uma célula somática, que teoricamente poderia ser de qualquer tecido de uma criança ou adulto, inserir este núcleo em um óvulo e implantá-lo em um útero (que funcionaria como uma barriga de aluguel). Se este óvulo se FACULDADE LEÃO SAMPAIO – PROF. EDINARDO FAGNER F. MATIAS - DISCIPLINA: GENÉTICA E EVOLUÇÃO desenvolver teremos um novo ser com as mesmas características físicas da criança ou adulto de quem foi retirada a célula somática. Seria como um gêmeo idêntico nascido posteriormente. Ilustração de como seria a clonagem humana Dolly e a ovelha doadora do DNA Já sabemos que não é um processo fácil. Dolly só nasceu depois de 276 tentativas que fracassaram. Além disso, dentre as 277 células "da mãe de Dolly" que foram inseridas em um óvulo sem núcleo, 90% não alcançaram nem o estágio de blastocisto. A tentativa posterior de clonar outros mamíferos tais como camundongos, porcos, bezerros, um cavalo e um veado também tem mostrado uma eficiência muito baixa e uma proporção muito grande de abortos e embriões malformados. Penta, a primeira bezerra brasileira clonada a partir de uma célula somática morreu adulta, em 2002, com um pouco mais de um mês. Ainda em 2002, foi anunciada a clonagem do copycat o primeiro gato de estimação clonado a partir de uma célula somática adulta. Para isto foram utilizados 188 óvulos que geraram 87 embriões e apenas um animal vivo. Na realidade, experiências recentes, com diferentes tipos de animais, têm mostrado que esta reprogramação dos genes, para o estágio embrionário, o qual originou Dolly, é extremamente difícil. O grupo liderado por Ian Wilmut, o cientista escocês que se tornou famoso por esta experiência, afirma que praticamente todos os animais que foram clonados nos últimos anos a partir de células não embrionárias estão com problemas. Entre os diferentes defeitos observados nos pouquíssimos animais que nasceram vivos após inúmeras tentativas, observam- se: placentas anormais, gigantismo em ovelhas e gado, defeitos cardíacos em porcos, problemas pulmonares em vacas, ovelhas e porcos, problemas imunológicos, falha na produção de leucócitos, defeitos musculares em carneiros. Os avanços recentes em clonagem reprodutiva permitem quatro conclusões importantes: 1. a maioria dos clones morre no início da gestação; 2. os animais clonados têm defeitos e anormalidades semelhantes, independentemente da célula doadora ou da espécie; 3. essas anormalidades provavelmente ocorrem por falhas na reprogramação do genoma; 4. a eficiência da clonagem depende do estágio de diferenciação da célula doadora. De fato, a clonagem reprodutiva a partir de células embrionárias tem mostrado uma eficiência de FACULDADE LEÃO SAMPAIO – PROF. EDINARDO FAGNER F. MATIAS - DISCIPLINA: GENÉTICA E EVOLUÇÃO dez a vinte vezes maior, provavelmente porque os genes que são fundamentais no início da embriogênese estão ainda ativos no genoma da célula doadora. É interessante que, dentre todos os mamíferos que já foram clonados, a eficiência é um pouco maior em bezerros (cerca de 10% a 15%). Por outro lado, um fato intrigante é que ainda não se tem notícias de macaco ou cachorro que tenha sido clonado. Talvez seja por isso que a cientista inglesa Ann McLaren tenha afirmado que as falhas na reprogramação do núcleo somático possam se constituir em uma barreira intransponível para a clonagem humana. Mesmo assim, pessoas como o médico italiano Antinori ou a seita dos raelianos defendem a clonagem humana, um procedimento que tem sido proibido em todos os países. De fato, um documento assinado em 2003 pelas academias de ciências de 63 países, inclusive o Brasil, pedem o banimento da clonagem reprodutiva humana. O fato é que a simples possibilidade de clonar humanos tem suscitado discussões éticas em todos os segmentos da sociedade, tais como: Por que clonar? Quem deveria ser clonado? Quem iria decidir? Quem será o pai ou a mãe do clone? O que fazer com os clones que nascerem defeituosos? Na realidade, o maior problema ético atual é o enorme risco biológico associado à clonagem reprodutiva. No meu entender, seria a mesma coisa que discutir os prós e os contras em relação à liberação de uma medicação nova, cujos efeitos são devastadores e ainda totalmente incontroláveis. Apesar de todos estes argumentos contra a clonagem humana reprodutiva, experiências com animais clonados têm nos ensinado muito acerca do funcionamento celular. Por outro lado, a tecnologia de transferência de núcleo para fins terapêuticos, a chamada clonagem terapêutica, poderá ser extremamente útil para obtenção de células-tronco. Clonagem terapêutica para obtenção das células-tronco Se em vez de inserirmos em um útero o óvulo cujo núcleo foi substituído por um de uma célula somática deixarmos que ele se divida no laboratório teremos a possibilidade de usar estas células - que na fase de blastocisto são pluripotentes - para fabricar diferentes tecidos. Isto abrirá perspectivas fantásticas para futuros tratamentos, porque hoje só se consegue cultivar em laboratório células com as mesmas características do tecido do qual foram retiradas. É importante que as pessoas entendam que, na clonagem para fins terapêuticos, serão gerados só tecidos, em laboratório, sem implantação no útero.Não se trata de clonar um feto até alguns meses dentro do útero para depois lhe retirar os órgãos como alguns acreditam. Também não há porque chamar esse óvulo de embrião após a transferência de núcleo porque ele nunca terá esse destino. Uma pesquisa publicada na revista Science por um grupo de cientistas coreanos (Hwang e col., 2004) confirma a possibilidade de obter-se células-tronco pluripotentes a partir da técnica de clonagem terapêutica ou transferência de núcleos. O trabalho foi feito graças a participação de dezesseis mulheres voluntárias que doaram, ao todo, 242 óvulos e células "cumulus" (células que ficam ao redor dos óvulos) para contribuir com pesquisas visando à clonagem terapêutica. As células cumulus, que já são células diferenciadas, foram transferidas para os óvulos dos quais haviam sido retirados os próprios núcleos. Dentre esses, 25% conseguiram se dividir e chegar ao estágio de blastocisto, portanto, capazes de produzir linhagens de células-tronco pluripotentes. FACULDADE LEÃO SAMPAIO – PROF. EDINARDO FAGNER F. MATIAS - DISCIPLINA: GENÉTICA E EVOLUÇÃO A clonagem terapêutica teria a vantagem de evitar rejeição se o doador fosse a própria pessoa. Seria o caso, por exemplo, de reconstituir a medula em alguém que se tornou paraplégico após um acidente ou para substituir o tecido cardíaco em uma pessoa que sofreu um infarto. Entretanto, esta técnica tem suas limitações. O doador não poderia ser a própria pessoa quando se tratasse de alguém afetado por doença genética, pois a mutação patogênica causadora da doença estaria presente em todas as células. No caso de usar-se linhagens de células-tronco embrionárias de outra pessoa, ter-se-ia também o problema da compatibilidade entre o doador e o receptor. Seria o caso, por exemplo, de alguém afetado por distrofia muscular progressiva, pois haveria necessidade de se substituir seu tecido muscular. Ele não poderia utilizar-se de suas próprias células-tronco, mas de um doador compatível que poderia, eventualmente, ser um parente próximo. Além disso, não sabemos se, no caso de células obtidas de uma pessoa idosa afetada pelo mal de Alzheimer, por exemplo, se as células clonadas teriam a mesma idade do doador ou se seriam células jovens. Uma outra questão emaberto diz respeito à reprogramação dos genes que poderiam inviabilizar o processo dependendo do tecido ou do órgão a ser substituído. Em resumo, por mais que sejamos favoráveis à clonagem terapêutica, trata-se de uma tecnologia que necessita de muita pesquisa antes de ser aplicada no tratamento clínico. Por este motivo, a grande esperança, a curto prazo, para terapia celular, vem da utilização de células-tronco de outras fontes. Terapia celular com outras fontes de células-tronco Indivíduos adultos Existem células-tronco em vários tecidos (como medula óssea, sangue, fígado) de crianças e adultos. Entretanto, a quantidade é pequena e não sabemos ainda em que tecidos são capazes de se diferenciar. Pesquisas recentes mostraram que células-tronco retiradas da medula de indivíduos com problemas cardíacos foram capazes de reconstituir o músculo do seu coração, o que abre perspectivas fantásticas de tratamento para pessoas com problemas cardíacos. Mas a maior limitação da técnica, do autotransplante é que ela não serviria para portadores de doenças genéticas. É importante lembrar que as doenças genéticas afetam 3-4% das crianças que nascem. Ou seja, mais de cinco milhões de brasileiros para uma população atual de 170 milhões de pessoas. É verdade que nem todas as doenças genéticas poderiam ser tratadas com células-tronco, mas se pensarmos somente nas doenças neuromusculares degenerativas, que afetam uma em cada mil pessoas, estamos falando de quase duzentas mil pessoas. Cordão umbilical e placenta Pesquisas recentes vêm mostrando que o sangue do cordão umbilical e da placenta são ricos em células-tronco. Entretanto, também não sabemos ainda qual é o potencial de diferenciação dessas células em diferentes tecidos. Se as pesquisas com células-tronco de FACULDADE LEÃO SAMPAIO – PROF. EDINARDO FAGNER F. MATIAS - DISCIPLINA: GENÉTICA E EVOLUÇÃO cordão umbilical proporcionarem os resultados esperados, isto é, se forem realmente capazes de regenerar tecidos ou órgãos, esta será certamente uma notícia fantástica, porque não envolveria questões éticas. Teríamos que resolver então o problema de compatibilidade entre as células- tronco do cordão doador e do receptor. Para isto será necessário criar, com a maior urgência, bancos de cordão públicos, à semelhança dos bancos de sangue. Isto porque sabe-se que, quanto maior o número de amostras de cordão em um banco, maior a chance de se encontrar um compatível. Experiências recentes já demonstraram que o sangue do cordão umbilical é o melhor material para substituir a medula em casos de leucemia. Por isso, a criação de bancos de cordão é uma prioridade que já se justifica somente para o tratamento de doenças sangüíneas, mesmo antes de confirmarmos o resultado de outras pesquisas. Células embrionárias Se as células-tronco de cordão tiverem a potencialidade desejada, a alternativa será o uso de células-tronco embrionárias obtidas de embriões não utilizados que são descartados em clínicas de fertilização. Os opositores ao uso de células embrionárias para fins terapêuticos argumentam que isto poderia gerar um comércio de óvulos ou que haveria destruição de "embriões humanos" e não é ético destruir uma vida para salvar outra. Vitória para a Ciência: Aprovada a utilização de células-tronco embrionárias em pesquisas O STF (Supremo Tribunal Federal) aprovou dia 29/05/2008 as pesquisas com células- tronco embrionárias no país. O Supremo rejeitou uma ação direta de inconstitucionalidade contra o artigo 5º artigo da Lei de Biossegurança que permite a utilização, em pesquisas, dessas células fertilizadas in vitro e não utilizadas. Segundo a norma, podem ser utilizados apenas os embriões que estejam congelados há três anos ou mais, mediante autorização do casal. O artigo também veta a comercialização do material biológico. Transgênicos: vilões ou mocinhos? Melhoramento genético e seleção artificial Há séculos o homem utiliza a prática de melhoramento genético para aperfeiçoar espécies animais e vegetais de interesse. Tudo começou quando o homem passou a realizar cruzamentos, seguidos de seleção artificial, das variedades que mais lhe interessavam. Esse procedimento originou inúmeras raças de animais e variedades vegetais que, hoje, fazem parte de nosso dia- a-dia. Cavalos e jumentos são cruzados para produzir híbridos – mulas e burros – utilizados para serviços de tração; o gado leiteiro e o de corte são hoje muito mais produtivos que os de antigamente; plantas como milho, feijão e soja produzem atualmente grãos de excelente valor nutritivo. Para preservar as qualidades das inúmeras variedades vegetais obtidas em cruzamentos, o homem aprendeu a fazer a propagação vegetativa, processo executado principalmente pelo plantio de pedaços de caule (estaquia) ou de enxertos(enxertia) das plantas de boa qualidade. FACULDADE LEÃO SAMPAIO – PROF. EDINARDO FAGNER F. MATIAS - DISCIPLINA: GENÉTICA E EVOLUÇÃO Esse tipo de reprodução assexuada forma clones das plantas com melhores características. Bons exemplos desse processo são a estaquia, atualmente praticada pelo Instituto Florestal de São Paulo, de pedaços de galho de eucalipto na propagação de variedades produtoras de madeira de excelente qualidade para a construção de casas, e a enxertia de inúmeras variedades de laranja, entre elas a laranja-da-baía, também conhecida como laranja-de- umbigo. Vimos que, desde os tempos antigos, o homem aprendeu, por meio da observação e da experimentação, a praticar o melhoramento de espécies animais e vegetais que apresentam algum interesse econômico, alimentar ou medicinal. Essas bases deram início a uma tecnologia conhecida como biotecnologia, que pode ser definida como um conjunto de técnicas que utilizam organismos vivos ou partes deles para a produção de produtos ou processos para usos específicos. Analisando a definição, podemos pensar que a biotecnologia já é praticada pelo homem a milhares de anos, quando ele aprendeu a utilizar, por exemplo, microorganismos fermentadores para a produção de pães, iogurtes e vinhos. Depois do conhecimento da estrutura do DNA, na década de 1950, e do entendimento do seu processo de duplicação e da sua participação na produção de proteínas, surgiu uma vertente da biotecnologia conhecida como engenharia genética, que, por meio de técnicas de manipulação do DNA, permite a seleção e modificação de organismos vivos, com a finalidade de obter produtos úteis ao homem e ao meio ambiente. A manipulação dos genes Com a elucidação da estrutura da molécula de DNA por Watson e Crick, em 1953, e o reconhecimento de que ela era o principal constituinte dos genes, o grande desafio para os cientistas consistia em fazer uma análise detalhada da sua composição nos diversos seres vivos. Sabia-se, também, que as bases nitrogenadas adenina, timina, citosina e guanina, componentes dos nucleotídeos, guardavam relação com o processo do código genético que comandava a produção de proteínas. Mas, várias dúvidas ainda perturbavam os cientistas: onde começa e onde termina um gene? Qual a sua seqüência de nucleotídeos? Quantos genes existem em cada espécie de ser vivo? A procura por respostas a essas perguntas gerou um intenso trabalho de pesquisa e originou um dos ramos mais promissores e espetaculares da biologia atual: a engenharia genética. A manipulação dos genes decorrente das pesquisas, conduziu à necessidade de compreender o significado de novos conceitos relacionados a essa área. Entre esses conceitos estão os de enzima de restrição, sítios alvo, eletroforense em gel, tecnologia do DNA recombinante, técnica do PCR, biblioteca de DNA, sondas, fingerprint etc. Uma pergunta que você poderia fazer é: porque devo conhecer todos esses conceitos e qual a utilidade delespara a minha vida? Porque para você ter uma opinião sobre transgênicos, pesquisa de paternidade, produção de medicamentos e vacinas e terapia gênica, deve saber sobre o que está falando. Todos nós esperamos que as pesquisas contribuam para a melhoria do bem estar da humanidade e por isso temos que conhecer a principais técnica utilizadas por ela para poder julgá-las justamente. Transgênicos podem ser benéficos Os alimentos transgênicos trazem benefícios à saúde humana e ao ambiente. Quem afirma é o biólogo e professor do Departamento de Genética e pesquisador do Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética da Universidade de Campinas (Unicamp), Marcelo Menossi, que participou em Curitiba, do lançamento da revista Nutrição e Saúde. A publicação vai levar a discussão para outros seis estados. Segundo Menossi, o melhoramento genético já é FACULDADE LEÃO SAMPAIO – PROF. EDINARDO FAGNER F. MATIAS - DISCIPLINA: GENÉTICA E EVOLUÇÃO desenvolvido há muitos anos em todo o mundo e surgiu com o cruzamento de espécies para a obtenção de plantas mais produtivas e resistentes a doenças. O que se faz com os alimentos transgênicos, explica o pesquisador, é manipular o gene de determinadas culturas para se obter resultados parecidos e até melhores que os cruzamentos. Segundo ele, as afirmações de que os alimentos geneticamente modificados causam danos à saúde não procedem, "pois eles são igualmente seguros como os alimentos convencionais". Ele garantiu que a rejeição na Europa surgiu quando os organismos de segurança daquele país não conseguiam explicar o aparecimento da doença que atingiu os rebanhos, chamada de vaca-louca, e a explosão de casos de HIV/aids. "Mas nos EUA os produtos transgênicos são consumidos desde 1994 e até hoje não há registro de casos de alergia ou qualquer outra doença", afirmou. Ele disse ainda que setores de peso na comunidade científica, como a Organização Mundial da Saúde (OMS) e a Organização Mundial da Saúde para a Agricultura e Alimentação (FAO) tem manifestado apoio ao uso racional dos transgênicos. Até mesmo os projetos como o da soja Roundup ready – que é obtida com um gene de bactéria resistente ao herbicida Roundup –, desenvolvida pela multinacional Monsanto, também não apresentaram danos à saúde dos consumidores. "O que existe é uma desinformação à população, e por isso essa resistência", disse. O pesquisador afirma que os produtos transgênicos podem diminuir impactos negativos no ambiente, principalmente no tocante ao uso de produtos químicos. Na China, citou Menossi, a utilização de algodão resistente reduziu, nos anos de 1999 a 2000, em 125 mil toneladas o uso de inseticidas. Porém o pesquisador alerta que antes de adotar a tecnologia é preciso avaliar o contexto de cada país. "Existem espécies que podem sofrer alterações com o cruzamento, e por isso é importante continuar investindo em pesquisas", finalizou. ONU respalda uso de transgênicos no combate à fome A biotecnologia representa grande esperança para agricultores de países em desenvolvimento, mas, até agora, apenas algumas dessas nações estão desfrutando de seus benefícios A análise está no relatório anual da Organização para Agricultura e Alimentação (FAO, na sigla em inglês) da ONU, divulgado nesta segunda-feira. Numa clara defesa da adoção de alimentos transgênicos como uma das formas de combate à fome mundial, a FAO alerta para o fato de que cultivos considerados essenciais sobretudo nos países mais pobres - como mandioca, batata e trigo - vêm sendo negligenciados por cientistas. O documento lembra que o mundo terá 2 bilhões de pessoas a mais para alimentar até 2030 e que a biotecnologia pode ajudar a enfrentar tal desafio. 'Nem o setor público nem o privado investem significativamente em novas tecnologias genéticas para os chamados 'cultivares órfãos', como o sorgo e o painço, essenciais para os povos mais pobres do planeta', afirmou o diretor-geral da FAO, Jacques Diouf. 'Transgênicos são seguros', diz documento A posição da FAO vai de encontro às teses mais difundidas, segundo as quais o problema da fome não está relacionado à escassez de alimentos, mas sim à má distribuição. O documento frisa que o grande desafio da biotecnologia é desenvolver técnicas que combinem o aumento da produção, a redução dos custos, a proteção do meio ambiente e, ainda, garantam a segurança alimentar. Embora o documento sustente que a biotecnologia não se restringe aos transgênicos, o texto cita o que considera organismos geneticamente modificados bem-sucedidos: 'Exemplos são encontrados em variedades de arroz e canola que contêm consideráveis quantidades de betacaroteno. Esse precursor da vitamina A está presente em poucos itens da dieta de muitas pessoas, particularmente nos países em desenvolvimento, onde poderia ajudar a reduzir deficiências crônicas de vitamina A.' Segundo o texto, a pesquisa agrícola pode tirar pessoas da pobreza, ao aumentar os lucros e reduzir o preço dos alimentos. Dados da FAO revelam que mais de 70% das pessoas mais pobres do mundo vivem em áreas rurais e dependem diretamente da agricultura para sua sobrevivência. O relatório foi divulgado menos de uma semana depois de a Monsanto ter desistido do lançamento de um trigo transgênico, sob a alegação de que não havia aceitação por parte dos consumidores. Mas o documento da FAO sustenta que, embora muitos europeus se oponham aos organismos geneticamente modificados, o mesmo não corre entre os consumidores dos países em desenvolvimento.Embora frise que pouco se conhece sobre os efeitos a longo-prazo da ingestão de transgênicos, o texto sustenta que 'os cientistas em geral concordam que os atuais FACULDADE LEÃO SAMPAIO – PROF. EDINARDO FAGNER F. MATIAS - DISCIPLINA: GENÉTICA E EVOLUÇÃO cultivos transgênicos e os alimentos derivados deles são seguros para comer'. Vantagens e perigos Benefícios potenciais dos transgênicos O aumento da produtividade é um dos maiores benefícios já constatados dos transgênicos. Cultivos modificados geneticamente para serem resistentes a herbicidas e pragas já estão sendo plantados em diversos países. A redução do impacto ambiental de plantios que demandam menos agrotóxicos também é apontada como uma grande vantagem, bem como a adaptação de cultivos a diferentes condições ambientais.Para os especialistas, um dos maiores benefícios dos transgênicos seria o aumento dos valores nutricionais de diversos alimentos, caso do arroz enriquecido com vitamina A. Riscos em potencial O controle dos cultivos transgênicos ainda não é totalmente eficiente, segundo a ONU. Um milho geneticamente modificado destinado a consumo animal, por exemplo, foi encontrado em alimentos para humanos em 2000. A transferência de substâncias passíveis de causar alergias em humanos é outra preocupação dos cientistas. Plantas geneticamente modificadas podem ter efeitos não desejados também para o produtor, como retirar mais recursos do solo do que o normal ou demandar mais água. Teme-se ainda que organismos transgênicos possam levar à redução de populações naturais, causando desequilíbrio. Vegetais com ômega 3 e 6 Cientistas da Universidade de Bristol, Grã-Bretanha, desenvolveram planta transgênica capaz de produzir os óleos ômega 3 e 6, considerados benéficos ao coração e normalmente encontrados apenas em peixes de águas mais frias, como o salmão e o atum. Para os pesquisadores, o estudo pode levar a uma nova geração de alimentos especialmente criados para reduzir o risco de doenças cardíacas, entre outros problemas de saúde. O estudo, publicado na 'Nature Biotechnology', lembra ainda que, com a redução dos estoques naturais de peixes, a produção desses óleos em outros organismos pode ser essencial para a alimentação humana. Segundo os cientistas, os genes utilizados para induzir a produçãodos óleos podem, em tese, ser usados em diversos vegetais, normalmente consumidos pelo homem. (O Globo, 18/5/2004) Enzimas de restrição: As tesouras moleculares A partir da década de 1970, ficou mais fácil analisar a molécula de DNA com o isolamento da enzimas de restrição. Estas enzimas são endonucleases, ou seja, no interior (daí o prefixo endo- dentro) das moléculas de DNA, cortando-as em locais bem definidos. São enzimas produzidas normalmente por bactérias e que possuem a propriedade de defendê-las de vírus invasores. Essas substâncias “picotam” a molécula de DNA sempre em determinados pontos, levando a produção de fragmentos contendo pontas adesivas, que podem se ligar a outras pontas de moléculas de DNA que tenham sido cortadas com a mesma enzima. Em Engenharia Genética, a obtenção dos fragmentos de DNA serve para criar, in vitro (em tubo de ensaio ou no laboratório), novas moléculas, recortando e colando vários pedaços de informações. FACULDADE LEÃO SAMPAIO – PROF. EDINARDO FAGNER F. MATIAS - DISCIPLINA: GENÉTICA E EVOLUÇÃO Uma das primeiras enzimas de restrição a ser isolada foi a EcoRI, produzida pela bactéria Escherichia coli. Essa enzima reconhece apenas a sequência GAATTC e atua sempre entre o G e o primeiro A. O local do “corte”, o local de uma enzima, é conhecido como sítio alvo. Você pode perguntar por que essa enzima não atua no DNA da própria bactéria? Isso não ocorre devido à existência de outras enzimas protetoras, que impedem a ação das enzimas de restrição no material genético da bactéria. As enzimas de restrição reconhecem e atuam sobre sequências específicas de DNA, catalisando a destruição de uma ligação fosfodiéster entre dois nucleotídeos consecutivos ligados a determinadas bases. Os nucleotídeos entre os quais a enzima corta, ou seja, entre os quais promove a hidrólise, encontram-se no interior dessas mesmas sequências específicas de reconhecimento (ver imagem). Cada molécula de DNA pode ser composta de várias repetições da sequência GAATTC ao longo de toda sua extensão. Portanto ao contato com a enzima EcoRI a fita de DNA pode ser clivada "cortada" em diversos lugares, gerando vários pedaços, de tamanhos diferentes. A multiplicação dos fragmentos de DNA Ocorrendo a fragmentação das moléculas de DNA, com o uso das enzimas de restrição, e o seu reconhecimento pela técnica de eletroforese em gel, o próximo passo é multiplicar (clonar) o fragmento obtido e submetê-los à tecnologia do DNA recombinante. A técnica de multiplicação da fita de DNA é chamada de PCR (reação em cadeia da polimerase). Na década de 1980, passou-se a utilizar a técnica do PCR para fazer milhares de cópias de um único pedaço de DNA. Essa técnica é usada em tubos de ensaio contendo o DNA e mais FACULDADE LEÃO SAMPAIO – PROF. EDINARDO FAGNER F. MATIAS - DISCIPLINA: GENÉTICA E EVOLUÇÃO alguns compostos necessários, como primers (DNAs iniciadores) e a enzima DNA polimerase (enzima que faz a replicação do DNA). Os primers são fitas de DNA, com mais ou menos 20 bases (A, T, C, G) complementares, isto é se ligam por complementaridade ao início da sequência de DNA que se quer multiplicar. Quando uma molécula de DNA vai ser multiplicada deve-se separar a dupla fita, formando assim duas fitas diferentes mas complementares entre si. Cada fita servirá de molde para a duplicação, por isso, precisamos de dois tipos de primers diferentes (veja a figura) Cada fragmento de DNA, que foi clivado e separado do resto do material genético, contém um ou mais genes. Lembre-se que cada gene origina uma proteína, portanto ao estudarmos o gene estamos estudando a proteína que ele codifica. Mas o que devemos fazer para estudar o gene? Devemos introduzi-lo no material genético (no DNA) de um hospedeiro para que ocorra a transcrição do gene, em mRNA, e a tradução em proteína. O hospedeiro é um organismo que se multiplica (se reproduz) rapidamente, como por exemplo, as bactérias. Quando as bactérias se reproduzem por bipartição elas transmitem ao seus “filhos” o seu material genético, portanto se neste material conter o fragmento de DNA de estudo, em pouco tempo teremos milhões de bactérias com o gene. FACULDADE LEÃO SAMPAIO – PROF. EDINARDO FAGNER F. MATIAS - DISCIPLINA: GENÉTICA E EVOLUÇÃO O plasmídio é o material genético circular não ligado ao cromossomo que fica espalhado pelo hialoplasma das bactérias. Ele sofre o mesmo processo do DNA cromossomal de transcrição e tradução, além de, se multiplicar a cada divisão celular, passando uma cópia para cada célula “filha”. O plasmídio é retirado das células bacterianas para que se possa inserir o gene de estudo, para depois recolocá-lo na bactéria. Para entendermos melhor vamos conhecer esse processo passo a passo (acompanhe na figura): 1. Os pesquisadores querem estudar um gene humano que produz uma proteína que não se sabe a função. 2. Os pesquisadores “recortam” (utilizando enzimas de restrição), do DNA humano, o gene de interesse. 3. Esse fragmento de DNA contendo o gene é multiplicado por PCR para obtermos várias cópias do mesmo fragmento (ou da mesma informação). FACULDADE LEÃO SAMPAIO – PROF. EDINARDO FAGNER F. MATIAS - DISCIPLINA: GENÉTICA E EVOLUÇÃO 4. A mesma enzima que clivou o gene do DNA humano é utilizada para clivar o plasmídio bacteriano. Lembre-se que o fragmento de DNA, ao ser clivado, gera pontas adesivas que são complementares ao plasmídio se este for clivado com a mesma enzima. 5. A seguir o plasmídio clivado é misturado com os fragmentos de DNA (contendo o gene) e uma enzima chamada ligase “cola” os fragmentos ao plasmídio, produzindo o chamado DNA recombinante. Isso feito, o DNA recombinante é introduzido em uma bactéria hospedeira. 6. A bactéria hospedeira é colocada em um meio nutritivo seletivo, apenas aquelas que possuem o DNA recombinante crescem, formando colônias. Após muitas gerações de bactérias, o produto da expressão dos genes, as proteínas humanas, são purificadas das bactérias (são separadas das proteínas das bactérias). Esse método produz uma grande quantidade de proteínas humanas possibilitando assim, seu estudo.
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