Dosagem de proteínas

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Introdução
Proteínas são o meio pelo qual a nossa informação genética é expressa. São macromoléculas responsáveis por definir do funcionamento do nosso organismo às nossas características fenotípicas, como na forma de enzimas, hormônios e anticorpos, por exemplo. Dessa foram é de suma importância a realização de métodos eficientes para a dosagem de proteínas em diferentes meios.. Na bioquímica a dosagem é fundamental para o acompanhamento dos processos de purificação, bem como no auxílio de análises posteriores das proteínas purificadas. 
A quantificação de proteínas engloba métodos tradicionais, como a absorbância de UV a 280 nm, o Método do Ácido Bicinconínico (BCA), o Método de Bradford, o Método do Biureto e o Método de Lowry. As quantificações podem ainda ser feitas para uma proteína específica por meio dos testes ELISA, Western Blot e Espectrometria de Massa 
 Objetivo
Determinar através dos métodos do Biureto, Bradford e BCA a quantidade de proteína em amostras desconhecidas e comparar os métodos e suas particularidades.
Métodos
A aula prática e seus experimentos foram seguidos de acordo com a metodologia estipulada no protocolo anexado a este trabalho.
ANEXO 1- Protocolo de Aula prática n° 5- Dosagem de proteínas.
As técnicas utilizadas na aula prática foram: Método de Bradford, Método do Biureto e Método de BCA.
Método do Biureto
O método se baseia na reação do reativo do biureto, que é constituído de uma mistura de cobre e hidróxido de sódio com um complexante que estabiliza o cobre em solução . O cobre, em meio alcalino, reage com proteínas formando um complexo quadrado planar com a ligação peptídica. O produto de reação apresenta duas bandas de absorção, uma em 270 nm e outra em 540 nm.
 Apesar de ser rápido, utilizar reagentes de baixo custo e não apresentar grande variação da absortividade específica para diferentes proteínas, este método não é muito sensível, como foi destacado por diversos autores, colocando-o em grande desvantagem, em relação a outras metodologias, e por isto tem sido, ao longo dos anos, substituído por métodos mais sensíveis.
Método de Bradford
Este método é baseado na interação entre o corante BG-250 e macromoléculas de proteínas que contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas. No pH de reação, a interação entre a proteína de alto peso molecular e o corante de comassie provoca o deslocamento do equilíbrio do corante para a forma aniônica, que absorve fortemente em 595 nm.
É rápido e compatível com agentes redutores, mas incompatível com detergentes.
Método de BCA 
O método proposto por Smith e colaboradores, também conhecido por método do ácido bicinchoninico (BCA 4,4'-dicarboxi-2,2'- biquinolina), se baseia na reação de cobre (II) com proteínas, em meio alcalino, produzindo cobre (I) e formando um complexo com o BCA, que absorve fortemente na região de 560 nm.
É muito sensível a proteínas e compatível com detergentes e agentes desnaturantes. No entanto, tem praticamente nenhuma compatibilidade com agentes redutores.
As placas foram preparadas para leitura em espectrofotometro conforme os procedimentos descritos no protocolo da aula prática. Após preparo as placas foram lidas em 595 nm para Bradford/Biureto e 562 nm para BCA.
Após a leitura, obtivemos as absorbâncias dos poços. Os valores de absorbância foram estabelecidos por uma média entre as duplicatas e desse valor foi descontado a absorbância do branco. A proteína utilizada para as curvas padrão foi Albumina 0,2 mg/ml.
	BRADFORD
	TUBOS
	ABS
	ABS MÉDIA
	ABS DESCONTADA
	1-Branco
	0,314/0,324
	0,31
	
	2
	0,406/0,420
	0,413
	0,094
	3
	0,482/0,523
	0,502
	0,183
	4
	0,659/0,730
	0,694
	0,375
	5
	0,897/0,935
	0,916
	0,597
	Amostra 1
	1,114/1,110
	1,112
	0,793
	Amostra 2
	0,494/0,518
	0,506
	0,187
	Amostra 3
	1,425/1,418
	1,421
	1,102
	Amostra 4
	0,587/0628
	0,604
	0,285
Quadro 1: Resultados das absorbâncias medidas por leitura em espectrofotometro, absorbância média e valor de absorbância com o branco descontado para método de Bradford.
	BIURETO
	TUBOS
	ABS
	ABS MÉDIA
	ABS DESCONTADA
	1-Branco
	0,066/0,088
	0,077
	
	2
	0,085/0,072
	0,078
	0,001
	3
	0,089/0,084
	0,086
	0,009
	4
	0,086/0,082
	0,084
	0,007
	5
	0,090/0,090
	0,090
	0,013
	Amostra 1
	0,089/0,098
	0,0935
	0,016
	Amostra 2
	0,166/0,197
	0,181
	0,104
	Amostra 3
	0,920/0,908
	0,914
	0,837
	Amostra 4
	0,077/0,081
	0,079
	0,002
Quadro 2: Resultados das absorbâncias medidas por leitura em espectrofotometro, absorbância média e valor de absorbância com o branco descontado para método do Biureto.
	BCA
	TUBOS
	ABS
	ABS MÉDIA
	ABS DESCONTADA
	Branco
	0,120/0,091
	0,105
	
	1
	1,123/1,113
	1,118
	1,013
	0,5
	0,621/0,625
	0,623
	0,518
	0,25
	0,376/0,339
	0,357
	0,252
	0,125
	0,254/0,216
	0,235
	0,130
	0,0625
	0,167/0,150
	0,158
	0,053
	Amostra 1
	1,986/1,665
	1,825
	1,720
	Amostra 2
	0,804/0,917
	0,860
	0,755
	Amostra 3
	1,643/1,601
	1,622
	1,517
	Amostra 4
	0,388/0,318
	0,353
	0,248
Quadro 3: Resultados das absorbâncias medidas por leitura em espectrofotometro, absorbância média e valor de absorbância com o branco descontado para método do BCA.
 
Utlizamos essas absorbâncias para determinar o fator de calibração parcial (FCP) e o fator de calibração médio (FCM). Com o FCP e o FCM podemos calcular a quantidade de proteína naquele volume de amostra pipetado e fazendo uma conversão, podemos medir a concentração dessa proteína em mg/ml.
F.C.P= Quantidade/ Absorbância
F.C.M= Ʃ F.C.P / Numeros de pontos na curva
Quantidade de proteína= Abs x FCM
Quantidade de proteína ------ Volume pipetado (μL)
 X ------ 1000 μL
		
Resultados
Com os valores de absorbância obtidos da leitura, fizemos uma curva padrão para cada método, relacionando absorbância com quantidade de proteína. 
Gráfico 1: Curva padrão do método de Bradford. Curva expressa em Absorbância por Quantidade de proteína em mg.
Gráfico 2: Curva padrão do método do Biureto. Curva expressa em Absorbância por Quantidade de proteína em mg.
Gráfico 3: Curva padrão do método do BCA. Curva expressa em Absorbância por Quantidade de proteína em mg.
	Após os cálculos dos fatores de calibração e quantidade de proteínas, obtivemos os seguintes valores de quantidade de proteína para cada método:
	BRADFORD
	Amostras
	Quantidade (mg)
	Quantidade expressa em mg/ mL
	Amostra 1
	0,009 mg
	0,9 mg/ mL
	Amostra 2
	0,0021 mg
	0,21 mg/ mL
	Amostra 3
	0,0124 mg
	1,24 mg/ mL
	Amostra 4
	0,0032 mg
	0,32 mg/ mL
Quadro 4: Quantidade de proteína nas amostras detectadas pelo método de Bradford.
	BIURETO
	Amostras
	Quantidade (mg)
	Quantidade expressa em mg/ mL
	Amostra 1
	0,0096 mg
	0,96 mg/mL
	Amostra 2
	0,0624 mg
	6,24 mg/ mL
	Amostra 3
	0,502 mg
	50,2 mg/ mL
	Amostra 4
	0,0012 mg
	0,12 mg/ mL
Quadro 5: Quantidade de proteína nas amostras detectadas pelo método do Biureto.
	BCA
	Amostras
	Quantidade (mg)
	Quantidade expressa em mg/ mL
	Amostra 1
	0,043 mg
	1,72 mg/mL
	Amostra 2
	0,019 mg
	0,76 mg/ mL
	Amostra 3
	0,038 mg
	1,52 mg/ mL
	Amostra 4
	0,0062 mg
	0,248 mg/ mL
Quadro 6: Quantidade de proteína nas amostras detectadas pelo método do BCA.
Discussão
Na aula prática testamos três diferentes métodos para dosagem de proteínas. Fizemos esses testes para quatro amostras diferentes: a Amostra 1 e Amostra 4 tinham como solvente a água, enquanto que a Amostra 2 e Amostra 3 tinham detergente em sua composição. 
A Amostra 1 apresentou valores semelhantes nos testes de Bradford e Biureto com valores de 0,9 mg/mL e 0,96 mg/mL respectivamente; porém no método do BCA apresentou como quantidade expressa em mg/mL um valor de 1,72 mg/mL. Esse resultado pode ser explicado pela maior sensibilidade do método do BCA, que foi capaz de detectar maior quantidadede proteína na amostra. Nos três testes a Amostra 1 se mostrou dentro das curvas padrão dos três métodos.
Nos testes com a Amostra 2 os resultados mostraram que a amostra teve valores fora da curva para o método do Biureto. Com o Bradfor e o BCA obtivemos valores respectivos de 0,21 mg/mL e 0,76 mg/mL. Mais uma vez o método do BCA se mostrou mais eficaz para essa amostra, pois a amostra continha detergente SDS 5%, que é incompatível com o método de Bradford, modificando o resultado.
Assim como a Amostra 2, a Amostra 3 tinha um detergente em sua composição (Triton X-100) e mostrou quantidade de proteína fora da curva padrão para o teste do biureto. Já nos testes de Bradford e BCA a quantidade de proteína se mostrou semelhante. O método do BCA é indicado para amostra que contenham detergente, enquanto no método de Bradford, achados na literatura indicam que algumas concentrações do detergente presente nesa amostra pode aumentar a sensibilidade do teste.
Nos testes com a amostra 4 observamos similaridade nos resultados dos três métodos, pois a amostra estava em água. O método de BCA não foi tão sensível pela amostra não estar diluida em detergente.
Com esses resultados, podemos concluir que o método do BCA é o mais indicado para quantificação de proteínas quando as amostras estão diluídas em detergentes. Enquanto os métodos de Bradford e do Biureto são indicados para amostras diluídas em água e sem a presença de detergentes.
 
Referências
VOET, Donald; VOET, Judith G. Bioquímica. 4. ed. Porto Alegre, Artmed, 2013.
Nelson, David L.; COX, Michael M. Princípios de bioquímica de Lehninger. Porto Alegre: Artmed, 2011. 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 2014.
Departamento de Tecnologia de Alimentos- Uiversidade Federal de Viçosa- Propriedades funcionais e nutricionais das proteínas do soro de leite.
Friedenauer S, Berlet HH; Sensitivity and variability of the Bradford protein assay in the presence of detergents. Anal Biochem. 1989 May 1;178(2):263-8.
Dimas A. M. Zaia, Cássia Thaïs B. V. Zaia, Jaim Lichtig; Determinação de proteínas totais via espectrofometria: vantagens e desvantagens dos 
Anexos
ANEXO 1- Protocolo de Aula prática n° 5- Dosagem de proteínas
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
CURSO DE BIOMEDICINA
QUÍMICA DE PROTEÍNAS
Aula prática nº 4 – Dosagem de proteínas
Método de Bradford / Biureto
	TUBOS
	PADRÃO
(L)
	AMOSTRAS
(L)
	ÁGUA (L)
	COMASSIE
BIURETO
(L)
	ABS
	
1 (Branco)
	----------
	--------------
	
50
	
200
	
	
2
	
5
	---------------
	
45
	
200
	
	
3
	
10
	---------------
	
40
	
200
	
	
4
	
20
	---------------
	
30
	
200
	
	
5
	
40
	----------------
	
10
	
200
	
	
6
	----------
	
10
	
40
	
200
	
	
7
	----------
	
10
	
40
	
200
	
	
8
	----------
	
10
	
40
	
200
	
	
9
	-----------
	
10
	
40
	
200
	
Esperar 10 minutos. Fazer a leitura das amostras dentro de 1 hora a 595 nm.
Colocar 200 L do conteúdo dos tubos na placa de 96 poços para fazer a leitura. Albumina: 1 mg/mL
Cálculo que deve ser feito para todos os testes.
Considerar a concentração da solução padrão de albumina. Para o Biureto e Comassie a solução é 1mg/mL = 1 (g/L). Para o BCA a solução padrão é 4 g/L.
Fator de calibração parcial (FCP): absorbância/ quantidade de proteína
Fator de calibração médio (FCM): ∑ FCP / nº de pontos da curva
Cálculo da quantidade de proteína da amostra: Absorbância X FCM = mg
Conversão em mg/mL = quantidade encontrada ________ volume pipetado
					X		_________ 1000 L (1 mL)
						X = mg/ mL				
Método do ácido bicinchonínico - BCA
Adicionar 100 uL de água previamente nos tubos 1 a 0,0625.
	TUBOS
	PADRÃO
(L)
	AMOSTRAS
(L)
	ÁGUA (L)
	BCA
(L)
	ABS
	
 (Branco)
	----------
	---------
	
50
	
200 
	
	
1
	
25
	-----------
	
25
	
200
	
	
0,5
	
25
	----------
	
25
	
200
	
	
0,25
	
25
	-----------
	
25
	
200
	
	
0,125
	
25
	-----------
	
25
	
200
	
	
0,0625
	
25
	-----------
	
25
	
200
	
	
5
	
	
25
	
25
	
200
	
	
6
	
	
25
	
25
	
200
	
	
7
	
	
25
	
25
	
200
	
	
8
	
	
25
	
25
	
200
	
Após adicionar as amostras da curva padrão de albumina, as amostras a serem testadas e a água, adicionar 200 uL do reagente de BCA. Incubar a placa de 96 poços a 37 ºC durante 30 minutos. Fazer a leitura a 562 nm. 
Diluição do reagente de BCA - 50: 1 (Reagente B/reagente A).
Calcular o fator de calibração médio: (absorbância/quantidade de proteina) / nº de pontos da curva.
Calcular a quantidade de proteína nas amostras expressando em mg/mL. Discutir as diferenças encontradas entre os métodos.