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Introdução A espectroscopia é o termo utilizado para se referir a toda a técnica de levantamento de dados físico-químicos através de transmissão, absorção ou reflexão da energia radiante incidente em uma amostra. A partir da espectroscopia pode se compreender as interações da luz com a matéria de determinando o espectro de absorção de um composto é possível saber a sua concentração em uma amostra. A determinação da concentração de uma substância/soluto pode ser feita pela quantidade de luz que ela absorve em um determinado comprimento de onda do espectro. Essa determinação segue os príncipios da Lei de Lambert-Beer, em que uma certa solução absorve a luz proporcionalmente à concentração molecular do soluto que nela encontra, o que significa que “a intensidade de um feixe de luz monocromático decresce exponencialmente à medida que a concentração da substância absorvente aumenta aritmeticamente.” Objetivo O objetivo do presente trabalho foi realizar uma varredura em espectofotômetro de amostras contendo como soluto dois aminoácidos aromáticos: Triptofano e Tirosina, para visualizar a faixa de comprimento de onda que esses aminoácidos absorvem e qual o pico de absorção desses aminoácidos no espectro. Através da leitura das amostras Através da leitura, também foi verificado a relação absorvância/concentração para amostras com diferentes concentrações de soluto. Métodos Na preparação das amostras para a leitura, foram usadas duas soluções padrão de aminoácidos: S1= Tirosina 50mM e S2= Triptofano 10mM. Essas amostras foram inicialmente diluidas. As soluções foram diluídas segundo: S1- Diluição da solução padrão de 10x: 100uL de sol. padrão + 900uL de água; S2- Diluição da solução padrão de 20x: 50uL de sol. Padrão + 950uL de água. Após, foi preparado em uma placa de 96 poços as soluções que seriam lidas no espectofotômetro. As soluções na placa foram preparadas de acordo com a tabela: Tubos S1 diluída H2O destilada B - 200Ul 1 200uL - 2 100uL 100Ul 3 50uL 150Ul 4 25uL 175Ul Quadro 1: Preparação de soluções de diferentes concentrações S1 para leitura em espectofotômetro. Tubos S2 diluída H2O destilada B - 200Ul 1 200Ul - 2 100uL 100Ul 3 50uL 150Ul 4 25uL 175Ul Quadro 2: Preparação de soluções de diferentes concentrações S2 para leitura em espectofotômetro. No espectofotômetro, foram lidos os seguintes poços: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B 1 2 3 4 B B 1 2 3 4 C D E F G H Quadro 3: Poços usados para leitura em espectofotômetro. A solução S1 foi pipetada na linha A e a solução S2 foi pipetada na linha B. Resultados Após a varredura obtivemos através do software do leitor um gráfico de comprimento de onda por absorbância, para se analisar qual o comprimento a amostra absorvia. Além disso, calculamos as concentrações das amostras diluidas de S1- Tirosina e S2- Triptofano. São elas: Tubo Concentração S1 1 5 mM 2 2,5 mM 3 1,25 mM 4 0,625 mM Quadro 4: Concentrações das soluções S1 preparadas para leitura. Tubo Concentração S2 1 0,5 mM 2 0,25 mM 3 0,125 mM 4 0,0625 mM Quadro 5: Concentrações das soluções S2 preparadas para leitura. Figura 1: Varredura em espectofotômetro das soluções S1. O eixo x representa o comprimento de onda em nm e o eixo y representa a absorbância. Figura 2: Varredura em espectofotômetro das soluções S2. O eixo x representa o comprimento de onda em nm e o eixo y representa a absorbância. Figura 3: Gráfico de concentração de S1 ,expressa em mM, pela absorbância (Abs). Figura 3: Gráfico de concentração de S2 ,expressa em mM, pela absorbância (Abs). Discussão Após a análise dos dados, podemos concluir que o pico de maior absorção das amostras e por consequência de aminoácidos aromáticos é no comprimento de onde de 280nm. Uma explicação para essa observação poderia ser a de que os anéis aromáticos presentes em tirosina e triptofano precisam de uma maior energia para excitar seus eletrons quando comparados a outros aminoácidos que não possuem o grupamento aromático. Outra conclusão que podemos inferir é a de que quanto maior a concentração de soluto de uma amostra, maior será sua absorbância. Baseado na Lei de Lambert-Beer podemos dizer que a quantidade de soluto na solução interfere na luz que transpassa a amostra, absorvendo-a. Dessa forma cria-se uma diferença entra a luz emitida pelo aparelho e a luz captada após transpassar a amostra. Essa diferença representa a absorbância. Referências VOET, Donald; VOET, Judith G. Bioquímica. 4. ed. Porto Alegre, Artmed, 2013. Nelson, David L.; COX, Michael M. Princípios de bioquímica de Lehninger. Porto Alegre: Artmed, 2011. 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 2014. www.fcav.unesp.br/Home/.../fundamentos-de-espectrofotometria-uv-visivel-2012.pdf
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