Cromatografia: Purificação de Moléculas

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Cromatografia	
  
Biotecnologia	
  
Purificação	
  de	
  moléculas	
  
IBF-­‐020	
  
	
  
13/12/16	
  
Purificação 
            
 Proteína isolada proteína pura 
 
 
Características: solubilidade, tamanho, carga e capacidade de ligação a um dado 
ligante. 
 
 
 
Métodos de 
purificação proteína isolada 
Proteínas de uma célula 
Extração	
  -­‐Captura	
  
Purificação	
  intermediária	
  
Polimento	
  
Fluxograma das etapas de purificação 
ORGANELAS 
Lisossomos 
Mitocôndria 
Golgi 
Núcleo 
SOBRENADANTE 
F 1 F 2 F 3 F 4 
F 2 .1 F 2 .2 F 2 .3 
F 2 .3.1 F 2 .3.2 . . . . . . F 2. 3.N 
Centrifugação 
Cromatografia Troca Iônica 
F 2.3.2.X 
 
Uma única proteína purificada 
 
(0.001g) - 0.1 a 0.5% total 
MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g) 
Cromatografia de Gel Filtração 
Cromatografia de afinidade 
Precipitação com Sal/Solvente 
Михаил	
  Семенович	
  Цвет	
  
Mikhail	
  Semenovich	
  TsweO	
  	
  
1906=	
   separação	
   da	
   clorofila	
   de	
   uma	
   mistura	
   de	
  
pigmentos	
  de	
  plantas,	
  através	
  de	
  uma	
  coluna	
  cheia	
  
de	
  carbonato	
  de	
  cálcio!	
  
éter	
  de	
  
petróleo	
  
CaCO3	
  
mistura	
  de	
  
pigmentos	
  
pigmentos	
  
separados	
  
Cromatografia 
Do	
  grego:	
  	
  
	
  	
  	
  χρωµα:	
  chroma,	
  cor	
  	
  
	
  
	
  	
  γραϕειν,	
  grafein,	
  grafia	
  
	
  
escrita	
  	
  
em	
  cores	
  	
  
Ferramenta	
   analíOca	
   para	
   a	
   separação	
   de	
   misturas,	
  
combinada	
  com	
  análises	
  qualitaOvas	
  e	
  quanOtaOvas	
  das	
  
substâncias	
  separadas	
  
Consiste	
   em	
   série	
   de	
   processos	
   Rsico-­‐químicos	
   de	
  
separação	
   de	
   misturas	
   em	
   função	
   de	
   suas	
  
caracterísOcas	
  moleculares	
  
Cromatografia 
Separação	
  dos	
  consOtuintes	
  de	
  uma	
  mistura	
  devido	
  a	
  interação	
  
diferencial	
  do	
  soluto	
  entre	
  2	
  fases	
  imiscíveis,	
  a	
  fase	
  ESTACIONÁRIA	
  
(FE)	
  e	
  a	
  fase	
  MÓVEL	
  (FM)	
  
SOLUTO	
  
FASE	
  MÓVEL	
  	
  
FASE	
  ESTACIONÁRIA	
  	
  
DEVEM	
  SER	
  INERTES	
  
Príncipio básico 
	
  Os	
  componentes	
  das	
  amostras	
  são	
  distribuídos	
  entre	
  duas	
  fases,	
  uma	
  das	
  quais	
  
permanece	
  estacionária,	
  enquanto	
  a	
  outra	
  elui	
  entre	
  os	
  inters_cios	
  ou	
  sobre	
  a	
  
superRcie	
  da	
  fase	
  estacionária	
  (F.E.).	
  
O	
   movimento	
   da	
   fase	
   móvel	
   (F.M.)	
   resulta	
   numa	
   migração	
   diferencial	
   dos	
  
componentes	
  da	
  amostra.	
  O	
  mecanismo	
  envolvido	
  nesta	
  migração	
  diferencial	
  
vai	
  depender	
  do	
  Opo	
  uOlizado	
  de	
  fase	
  móvel	
  e	
  de	
  estacionária.	
  
Processo cromatográfico 
• 	
  Tipo	
  	
  	
  de	
  	
  	
  suporte	
  
• 	
  Modo	
  	
  de	
  	
  separação	
  
• 	
  Natureza	
  da	
  fase	
  móvel	
  
• 	
  Composição	
  da	
  fase	
  móvel	
  
• 	
  ObjeOvo	
  da	
  separação	
  
Coluna	
  
Planar	
  
Adsorção	
  
ParOção	
  
Troca	
  iônica	
  
Exclusão	
  de	
  tamanhos	
  
Afinidade	
  
Cromatografia	
  gasosa	
  
Cromatografia	
  líquida	
  
Cromatografia	
  supercríOca	
  
IsocráOca	
  
Gradiente	
  
AnalíOca	
  
PreparaOva	
  
Processo cromatográfico 
Resolução	
  
ü  Alta	
  pressão	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  da	
  CL	
  clássica	
  pressão	
  ambiente	
  
	
  
ü  	
  Influência	
  grande	
  da	
  FE	
  na	
  separação	
  sendo	
  que	
  as	
  propriedades	
  das	
  fases	
  
estacionárias	
  podem	
  estar	
  sujeitas	
  a	
  alterações	
  pela	
  FM	
  
ü  	
  Separação	
  de	
  moléculas	
  que	
  se	
  dissolvem	
  na	
  fase	
  móvel	
  (massa	
  molar	
  32	
  a	
  
4	
  milhões)	
  
ü  	
  Não	
  necessita	
  que	
  a	
  amostra	
  seja	
  voláOl	
  (requisito	
  da	
  CG)	
  
ü  	
   Além	
   do	
   reduzido	
   tempo	
   e	
   alta	
   resolução,	
   possui	
   boa	
   detectabilidade	
   e	
  
bons	
  resultados	
  quali	
  e	
  quanOtaOvos	
  
	
  
Cromatografia líquida de alta eficiência 
(CLAE /HPLC) 
Tempo	
  	
  	
  
Cromatografia líquida de alta eficiência 
(CLAE /HPLC) 
ü  Alto	
  custo	
  do	
  equipamento	
  e	
  das	
  colunas	
  e	
  acessórios	
  
	
  
	
  
	
  
ü  	
  Não	
  há	
  detector	
  universal	
  que	
  abrange	
  boa	
  detectabilidade	
  e	
  baixo	
  custo	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
C
on
ce
nt
ra
çã
o 
Tempo ou volume 
Coletor de 
frações 
Tempo 1 
Componentes da amostra se 
separam e saem da coluna 
com diferentes volumes de 
tampão 
Tempo n 
Amostra com 
diferentes 
componentes 
Resina 
embebida 
em tampão 
Tempo zero 
Cromatografia em coluna 
            
Tempo 2 
Bomba 
            •  Leva	
  a	
  fase	
  móvel	
  desde	
  o	
  reservatório	
  até	
  a	
  coluna	
  	
  
•  Vazão	
  na	
  faixa	
  0,1	
  ml/min	
  (constante	
  e	
  sem	
  pulsação)	
  
	
  
Bombeamento	
  isocráOco	
  ou	
  por	
  gradiente	
  
Bombeamento	
  isocrá^co	
   Bombeamento	
  por	
  gradiente	
  
Composição	
  da	
  fase	
  móvel	
  manOda	
  
constante	
  
Alterar	
  a	
  composição	
  da	
  fase	
  móvel	
  
Tempo	
   Resolução	
  
Detectores 
            
UNIVERSAIS: 
Geram sinal para qualquer 
substância eluída. 
SELETIVOS: 
Detectam apenas substâncias 
com determinada propriedade 
físico-química. 
DisposiOvos	
  que	
  geram	
  sinal	
  elétrico	
  que	
  é	
  registrado	
  na	
  forma	
  de	
  um	
  pico.	
  A	
  
area	
  desste	
  pico	
  é	
  	
  proporcional	
  á	
  quanOdade	
  do	
  analito	
  
	
  
	
  
Principias detectores 
            
ü  Índice	
  de	
  refração	
  	
  	
  	
  	
  	
  
(IR	
  analito	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  IR	
  da	
  fase	
  móvel),	
  baixa	
  sensibilidade,	
  detecção	
  de	
  carboidratos	
  
	
  
ü  Espectrofotometria	
  UV-­‐visível	
  
FM	
  não	
  pode	
  absorver	
  no	
  λ	
  indicado,	
  mais	
  comumente	
  aplicado,	
  compostos	
  aromáOcos	
  
ou	
  com	
  ligações	
  C	
  =O,	
  N=O	
  
	
  
ü  	
  Fluorescência	
  
	
  
ü  	
  Eletroquímico	
  
Aplica-­‐se	
   um	
  potencial	
   alto	
   no	
  par	
   de	
   eletrodos	
   na	
   cela	
   provocando	
   reação	
  de	
  oxido-­‐
redução	
  do	
  analito	
  que	
  gera	
  uma	
  corrente	
  elétrica.	
  Corrente	
  ∝	
  [analito]	
  
ü  	
  Espectrometria	
  de	
  massa	
  LC/MS	
  
Ao	
   ser	
   eluido,	
   o	
   analito	
   já	
   é	
   direcionado	
   ao	
   espectrômetro	
   com	
   a	
   fragmentação	
   da	
  
biomolécula	
   e	
   a	
   detecção	
   de	
   cada	
   fragmento.	
   Cada	
   molécula	
   tem	
   uma	
   perfil	
   de	
  
fragmentos	
  que	
  a	
  caracteriza	
  e	
  difere	
  das	
  demais	
  (banco	
  de	
  dados).	
  
	
  
	
  
	
  
18	
  
A separação baseia-se na migração 
diferencial entre a F.E. e F.M. 
F.E.- permanece fixa na coluna 
F.M.- Carrega a amostra 
pela F.E. 
Injector 
Detector 
Column 
Solvents 
Mixer 
Pumps 
Waste 
Injector 
Detector 
Column 
SolventsPumps 
Mixer 
Chromatogram 
Start Injection 
mAU 
time 
Paramêtros cromatográficos 
            
Avaliar	
   o	
   desempenho	
   cromatográfico	
   e	
   com	
   isso	
   auxiliar	
   na	
   oOmização	
   do	
  
processo	
  
	
  
•  	
  Tempo	
  de	
  retenção	
  
•  	
  Fator	
  de	
  retenção	
  
•  	
  Fator	
  de	
  separação	
  
•  	
  Número	
  de	
  pratos	
  
•  	
  Resolução	
  
Paramêtros cromatográficos 
            Tempo	
  de	
  retenção	
  =	
  Tr	
  
Fator	
  de	
  separação	
  =	
  α
Tempo	
  decorrido	
  da	
  injecção	
  da	
  
amostra	
  até	
  o	
  momento	
  máximo	
  do	
  
pico	
  
Relação	
  do	
  Tr	
  de	
  2	
  moléculas	
  
Temperatura	
  e	
  vazão	
  da	
  FM	
  
constante	
  =	
  Tr	
  tbm	
  constante	
  
Paramêtros cromatográficos 
            Número	
  de	
  pratos	
  
Tr	
  =	
  tempo	
  de	
  retenção	
  
W	
  =	
  Largura	
  do	
  pico	
  
É	
  uma	
  medida	
  do	
  tr	
  e	
  W	
  dos	
  picos	
  	
  
Paramêtro	
  mais	
  preciso	
  para	
  definir	
  a	
  qualidade	
  de	
  um	
  sistema	
  
cromatográfico	
  
Performace	
  da	
  cromatografia	
  
Paramêtros cromatográficos 
            Resolução	
   Fornece	
  uma	
  medida	
  quanOtaOva	
  da	
  capacidade	
  da	
  coluna	
  de	
  separar	
  2	
  
compostos	
  
Cromatografia de gel filtração ou de 
exclusão molecular 
            
Fase	
  estacionária	
  =	
  esferas	
  microscópicas	
  de	
  material	
  polimérico	
  hidratado	
  e	
  inerte	
  
Cromatografia de gel filtração ou de 
exclusão molecular 
            .	
  Cada	
  resina/matrizes	
  (Géis	
  hidroRlicos	
  reOculados)	
  terá	
  sua	
  faixa	
  de	
  fracionamento	
  
.	
  100	
  a	
  80	
  milhões	
  de	
  Da	
  
Podem	
  ser	
  biodegradáveis	
  =	
  uso	
  agentes	
  anOmicrobianos	
  como	
  Azida	
  de	
  sódio	
  
	
  	
  Resinas	
  para	
  Gel-­‐Filtração	
  	
  
Sephadex G - 10 Dextrana 0.05 - 0.70 
Sephadex G - 25 Dextrana 1 - 5 
Sephadex G - 50 Dextrana 1 - 30 
Sephadex G - 100 Dextrana 4 - 150 
Sephadex G - 200 Dextrana 5 - 600 
Bio - Gel P - 2 Policrilamida 0.1 - 1.8 
Bio - Gel P - 6 Policrilamida 1 - 6 
Bio - Gel P - 10 Policrilamida 1.5 - 20 
Bio - Gel P - 30 Policrilamida 2.4 - 40 
Bio - Gel P - 100 Policrilamida 5 - 100 
Bio - Gel P - 300 Policrilamida 60 - 400 
Sepharose 6B Agarose 10 - 4.000 
Sepharose 4B Agarose 60 - 20.000 
Sepharose 2B Agarose 70 - 40.000 
NOME	
   	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  TIPO	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  FAIXA	
  DE	
  RESOLUÇÃO	
  
(kD) 
*Sephadex e Sepharose: Amersham Pharmacia Biotech; Bio - Gel: Bio - Rad Laboratories 
Moléculas	
  pequenas	
  
Moléculas	
  pequenas	
  
Proteínas	
  
Proteínas	
  
Células,	
  par_culas	
  sub-­‐celulares	
  
Existem	
  diferentes	
  ^pos	
  de	
  resinas	
  para	
  gel-­‐filtração	
  
indica	
  quais	
  os	
  tamanhos	
  das	
  
par_culas	
  que	
  podem	
  entrar	
  	
  
nos	
  poros	
  da	
  resina	
  e	
  serem	
  
fracionados.	
  Acima	
  ou	
  abaixo	
  da	
  
faixa,	
  não	
  há	
  separação.	
  
Cromatografia de gel filtração ou de 
exclusão molecular 
            .	
  Cada	
  resina/matrizes	
  (Géis	
  hidroRlicos	
  reOculados)	
  terá	
  sua	
  faixa	
  de	
  fracionamento	
  
.	
  100	
  a	
  80	
  milhões	
  de	
  Da	
  
-­‐  Fracionamento	
  de	
  alta	
  resolução	
  	
  
-­‐  Separação	
  de	
  biomoléculas	
  em	
  grupos	
  como	
  para	
  
dessalinização	
  da	
  amostra	
  	
  
Determinação	
  de	
  massa	
  molecular	
  
Volume	
  de	
  eluição	
  de	
  um	
  soluto	
  desconhecido	
  pode	
  ser	
  relacionado	
  aos	
  volumes	
  
de	
  eluição	
  de	
  outras	
  moléculas	
  com	
  massa	
  molar	
  conhecida!	
  
	
  
Definições	
  
Cromatografia de gel filtração ou de 
exclusão molecular 
            
Cromatografia de gel filtração ou de 
exclusão molecular 
            
Blue	
  Dextran	
  	
  (MM=	
  2.000.000)	
  
Cromatografia de gel filtração ou de 
exclusão molecular 
            
Cromatografia de gel filtração ou de 
exclusão molecular 
            
A	
  eluiçao	
  de	
  uma	
  molécula	
  é	
  dada	
  pelo	
  seu	
  coeficiente	
  de	
  	
  distribuição	
  (Kav)	
  
Kav	
  =	
  
Ve	
  -­‐	
  Vo	
  
Vt	
  -­‐	
  Vo	
  
Ve	
  –	
  volume	
  de	
  eluição	
  de	
  uma	
  certa	
  proteína	
  
Vt	
  –	
  volume	
  total	
  da	
  coluna	
  
Vo	
  –	
  volume	
  morto	
  da	
  coluna,	
  em	
  que	
  saem	
  
moléculas	
  com	
  	
  massa	
  acima	
  da	
  resolução	
  da	
  
resina	
  	
  
A	
  eluiçao	
  de	
  uma	
  molécula	
  é	
  dada	
  pelo	
  seu	
  coeficiente	
  de	
  	
  distribuição	
  (Kav)	
  
Kav	
  =	
  a.log	
  M	
  +	
  b	
  
a	
  e	
  b	
  =	
  constantes	
  
log	
  M	
  =	
  massa	
  molar	
  da	
  biomolécula	
  
Kav	
  
Log	
  M	
  
Kav	
  =	
  
Ve	
  -­‐	
  Vo	
  
Vt	
  -­‐	
  Vo	
  
Tipos de Resina de troca Iônica 
Perfil do cromatograma             
Cromatografia de troca iônica 
            
•  Matriz da coluna = polímero sintético contando grupos carregados que se 
mantém em um ampla faixa de pH. 
Trocadoras cátiônicas 
Trocadoras aniônicas 
Trocadora de ânions Trocadora de cátions 
DEAE CM 
Adsorção 
Eluição 
+
+
+
+
+
+
+
+
Moléculas com a mesma carga, 
ou sem carga, não interagem com a resina, 
sendo as primeiras a sair da coluna 
Adição de sal ao tampão resulta em 
competição entre os íons em solução e 
as moléculas adsorvidas na resina. 
Dividida em duas etapas: 
 
1)  adsorção das proteínas com carga contrária à 
resina, e saída da coluna das proteínas com a 
mesma carga; 
2)  Eluição das proteínas adsorvidas. 
+
+
+
+
+
+
+
+
+ 
+ + 
Exemplo de uma resina catiônica ou trocadora de ânions, como 
o DEAE-celulose): 
Para a eluição, as condições de adsorção da coluna 
(pH ou força iônica) são alteradas para neutralizar a 
interação entre as proteínas e a resina. 
 
Mais frequentemente utiliza-se um aumento da 
concentração do sal no tampão, pois alterações de pH 
podem desnaturar proteínas, levando-as a precipitar 
dentro da coluna. 
 
Cromatografia de troca iônica 
            
PI ácido 
+ 
básico 
- neutro 
-COOH -COO 
-NH3 
H + 
+ 
 - 
H + 
-NH2 
O processo da cromatografia de troca iônica depende da diferença de ponto isoelétrico 
das proteínas na amostra e das condições escolhidas de pH e de força iônica. 
Proteína P.I. 
Pepsina <1,0 
Ovalbumina galinha 4,6 
Albumina sérica humana 4,9 
Tropomiosina 5,1 
Insulina bovina 5,4 
Fibrinogênio humano 5,8 
Gama-globulina 6,6 
Colágeno 6,6 
Mioglobina equina 7,0 
Hemoglobina humana 7,1 
Ribonuclease A bovina 7,8 
Citocromo C equino 10,6 
Histona bovina 10,8 
Lisozima, galinha 11,0 
Salmina, salmão 12,1 
 
Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas 
Proteínas apresentam carga + quando em meio ácido em 
relação ao seu PI, e carga - quando em meio alcalino em 
relação ao seu pI. 
Nesse caso, a referência para se dizer que o meio é ácido 
ou básico é o PI da proteína, e não o pH do meio. 
A carga das proteínas varia em função do pH do meio, pois o 
pH influencia o estado de dissociação das cadeias laterais dos 
aminoácidos ácidose básicos. 
Para	
  realizar	
  uma	
  troca	
  iônica	
  preciso	
  	
  
Conhecer	
  o	
  pI	
  da(s)	
  proteína(s)	
  de	
  interesse	
   ?	
  
Carboximetil~celulose 
(trocadora de cátions) 
Dietilaminoetil~celulose 
(trocadora de ânions) 
 Gradientes de sal podem fracionar as proteínas adsorvidas na resina de acordo 
com a intensidade de suas cargas, que é dada pela diferença entre seus PIs e o pH do 
tampão de eluição. 
 As proteínas não retidas (com a mesma carga da resina) não são separadas, 
sendo simplesmente “arrastadas” pelo tampão (ou seja, não são repelidas pela resina). 
_ 
= 
= 
_ 
+ 
+ + 
+ + 
(+) 
(+) 
(+) 
(+) 
0. 10 M 
0. 15 M 
0. 20 M 
Eluição NaCl 
Não retidas 
DEAE	
  
+ + 
0. 10 M 
0. 15 M 
0. 20 M 
Eluição NaCl 
+ 
(-) 
(-) 
(-) 
+ + + 
_ = 
= _ (-) 
Não retidas 
CM	
  
Cromatografia de troca iônica 
            
Tipos de Resina de troca Iônica 
Existem vários tipos de resinas de troca iônica disponíveis no mercado. 
NOME TIPO GRUPO IONIZÁVEL OBSERVAÇÕES 
Dowex 1 Fortemente básica Ø - CH 2 N+(CH 3 ) 3 Troca aniônica 
resina de polistireno 
Dowex 50 Fortemente básica Ø - SO 3 -H Troca Catiônica 
resina de polistireno 
DEAE - celulose Básica Dietilaminoetil Fracionamento de proteínas 
- CH 2 CH 2 N+(C 2 H 5 ) 2 ácidas e neutras 
CM - celulose Ácida Carboximetil Fracionamento de proteínas 
- CH 2 COOH básicas e neutras 
DEAE - Sephadex Gel de dextrano Dietilaminoetil Combinação de gel filtração 
básico - CH 2 CH 2 N+(C 2 H 5 ) 2 e troca iônica de proteínas 
ácidas e neutras 
CM - Sephadex Gel de dextrano Carboximetil Combinação de gel filtração 
ácido - CH 2 COOH e troca iônica de proteínas 
básicas e neutras 
* Dowex: Dow Chemical Co.; Sephadex: Amersham Pharmacia Biotech; Bio - Gel: Bio Rad Laboratories 
Tipos de resina de troca iônica 
            
Tipos de Resina de troca Iônica 
Perfil do cromatograma             
Cromatografia de afinidade 
Resina	
  sólida	
  
	
  
Ligação	
  
especíica	
  da	
  
proteína	
  ao	
  
ligante	
  da	
  
matriz	
  
Ligante	
  	
  
imobilizado	
  na	
  
matriz	
  
Proteínas	
  com	
  
diferentes	
  síOos	
  
de	
  ligação	
  
	
  
Proteínas	
  com	
  diferentes	
  sí^os	
  
de	
  ligação	
  
	
  
Ligante	
  	
  imobilizado	
  na	
  
matriz	
  
Proteína	
  de	
  interesse	
  
•  Fase estacionária= ligante ligado 
covalentemnte ao suporte 
•  Fase móvel = solvente aquoso 
•  Interações não covalentes 
•  Eluição 
Rendimento	
  
Eluição:	
  condições	
  que	
  interferem	
  na	
  ligação	
  da	
  proteína	
  ao	
  ligante,	
  como	
  mudanças	
  no	
  pH	
  e/ou	
  	
  
força	
  iônica,	
  ou	
  por	
  compeOção	
  com	
  o	
  ligante	
  livre	
  (imidazol)	
  
IMAC	
  -­‐	
  Cromatografia	
  de	
  afinidade	
  com	
  metal	
  imobilizado	
  
• interação	
  entre	
  as	
  proteínas	
  e	
  os	
  ions	
  metálicos	
  imobilizados	
  num	
  suporte	
  sólido.	
  	
  
• suportes	
   contendo	
   ions	
   de	
   Cu2+	
   ,Ni2+	
   ,	
   Zn2+	
   ou	
   Co2+	
   são	
   apropriados	
   para	
   o	
  
fracionamento	
  de	
  proteínas	
  com	
  base	
  no	
  seu	
  conteúdo	
  relaOvo	
  de	
  resíduos	
  de	
  hisOdina,	
  
cisteína,	
  cadeias	
   laterais	
  aromáOcas	
  de	
  aminoácidos	
  e	
  de	
  grupos	
  N-­‐terminal	
  acessíveis	
  
de	
  aminoácidos.	
  	
  
• 	
  cauda	
  de	
  his	
  
Cromatografia de afinidade 
Ligante 
grupo-específico 
Especificidade 
Concanavalina A Grupos glicosil- ou manosil- 
Cibacron Blue Várias enzimas, albumina 
lisina Plasminogênio, RNA ribossomal 
arginina proteinases tipo tripsina 
benzamidina proteinases tipo tripsina 
calmodulina Proteínas reguladas por calmodulina 
heparina Fatores de coagulação, lipases, 
hormônios, receptores estoróides, etc 
Metais de transição Proteínas e peptídeos com resíduos 
de His expostos 
1.	
  Mono-­‐específicos	
  -­‐	
  ligação	
  específica	
  da	
  molécula-­‐alvo	
  
	
  -­‐	
  análogos	
  de	
  substratos	
  ou	
  inibidores	
  de	
  enzimas	
  
	
  -­‐	
  agonistas	
  ou	
  antagonistas	
  de	
  receptores	
  
	
  -­‐	
  haptenos	
  ou	
  determinantes	
  anOgênicos	
  de	
  anOcorpos	
  
	
  -­‐	
  ligantes	
  com	
  “tag”	
  ou	
  “marcação”	
  
	
   	
  -­‐	
  glutaOona-­‐S-­‐transferase	
  
	
   	
  -­‐	
  poli-­‐HisOdina	
  
	
  
2.	
  	
  Grupo-­‐específico:	
  ligantes	
  para	
  separação	
  de	
  grupos:	
  
Cromatografia de afinidade 
3 passos cromatográficos 
consecutivos usados para 
purificar uma proteína. Em A, 
resultados de uma coluna de 
troca iônica; B, Filtração em gel 
e C, Cromatografia de 
afinidade. 
Cromatografia multimodal 
•  Ligantes interagem com as moléculas fixadas na resina por 2 ou mais 
modos de ação!! Grau de complexidade maior, maior seletividade 
•  Condições de grande desafio para os métodos tradicionais 
Cromatografia multimodal 
Lembrando... 
Apresentações	
  20/12	
  
	
  
Paper	
  1	
  (plant-­‐based)	
  -­‐	
  Grupo	
  trio:	
  Luiz,	
  Rafael	
  e	
  Anny	
  
	
  
Paper	
  2	
  (EVs)-­‐	
  Dupla:	
  Maria	
  Clara	
  e	
  Wlademir	
  
	
  
Paper	
  3	
  (VLPs	
  purificaOon)	
  -­‐	
  Dupla:	
  Amanda	
  e	
  Ingrid	
  
	
  
	
  
Apresentações	
  03/01	
  
	
  
Paper	
  4(HPLC	
  sOgmasterol)	
  -­‐	
  Dupla:	
  	
  Quézia	
  e	
  Gabriely	
  
	
  
Paper	
  5-­‐	
  (polyG)	
  -­‐Dupla:	
  Pamela	
  e	
  Lucas	
  
	
  
Paper	
  6	
  (Enzyme-­‐assisted)	
  -­‐Dupla:	
  Giovanna	
  e	
  Anderson	
  
Atividade avaliativa