Clonagem e Organismos transgênicos FINAL

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Brasília-DF. 
Clonagem e organismos TransgêniCos
Elaboração
Luis Fernando Reyes
Joci Neuby Alves Macedo
José Luiz Lopes de Souza
Assuero Faria Garcia
Julio Cesar Pissuti Damalio
Produção
Equipe Técnica de Avaliação, Revisão Linguística e Editoração
Sumário
APrESEntAção ................................................................................................................................. 4
orgAnizAção do CAdErno dE EStudoS E PESquiSA .................................................................... 5
introdução.................................................................................................................................... 7
unidAdE i
CLONAGEM MOLECULAR ...................................................................................................................... 9
CAPítulo 1
INtROdUçãO à pROdUçãO dE pROtEíNAs hEtERóLOGAs ..................................................... 9
CAPítulo 2
CLONAGEM MOLECULAR ...................................................................................................... 22
unidAdE ii
CLONAGEM REpROdUtIVA E tERApÊUtICA ........................................................................................... 31
CAPítulo 1
CLONAGEM REpROdUtIVA: O CAsO dA OVELhA dOLLy ........................................................ 31
CAPítulo 2
CLONAGEM tERApÊUtICA E As CéLULAs- tRONCO ................................................................ 34
unidAdE iii
tERApIA GÊNICA E ORGANIsMOs tRANsGÊNICOs ............................................................................... 40
CAPítulo 1
tERApIA GÊNICA .................................................................................................................... 40
CAPítulo 2
ORGANIsMOs tRANsGÊNICOs .............................................................................................. 43
PArA (não) FinAlizAr ..................................................................................................................... 50
rEFErênCiAS .................................................................................................................................. 51
4
Apresentação
Caro aluno
A proposta editorial deste Caderno de Estudos e Pesquisa reúne elementos que se entendem 
necessários para o desenvolvimento do estudo com segurança e qualidade. Caracteriza-se pela 
atualidade, dinâmica e pertinência de seu conteúdo, bem como pela interatividade e modernidade 
de sua estrutura formal, adequadas à metodologia da Educação a Distância – EaD.
Pretende-se, com este material, levá-lo à reflexão e à compreensão da pluralidade dos conhecimentos 
a serem oferecidos, possibilitando-lhe ampliar conceitos específicos da área e atuar de forma 
competente e conscienciosa, como convém ao profissional que busca a formação continuada para 
vencer os desafios que a evolução científico-tecnológica impõe ao mundo contemporâneo.
Elaborou-se a presente publicação com a intenção de torná-la subsídio valioso, de modo a facilitar 
sua caminhada na trajetória a ser percorrida tanto na vida pessoal quanto na profissional. Utilize-a 
como instrumento para seu sucesso na carreira.
Conselho Editorial
5
organização do Caderno 
de Estudos e Pesquisa
Para facilitar seu estudo, os conteúdos são organizados em unidades, subdivididas em capítulos, de 
forma didática, objetiva e coerente. Eles serão abordados por meio de textos básicos, com questões 
para reflexão, entre outros recursos editoriais que visam a tornar sua leitura mais agradável. Ao 
final, serão indicadas, também, fontes de consulta, para aprofundar os estudos com leituras e 
pesquisas complementares.
A seguir, uma breve descrição dos ícones utilizados na organização dos Cadernos de Estudos 
e Pesquisa.
Provocação
Textos que buscam instigar o aluno a refletir sobre determinado assunto antes 
mesmo de iniciar sua leitura ou após algum trecho pertinente para o autor 
conteudista.
Para refletir
Questões inseridas no decorrer do estudo a fim de que o aluno faça uma pausa e reflita 
sobre o conteúdo estudado ou temas que o ajudem em seu raciocínio. É importante 
que ele verifique seus conhecimentos, suas experiências e seus sentimentos. As 
reflexões são o ponto de partida para a construção de suas conclusões.
Sugestão de estudo complementar
Sugestões de leituras adicionais, filmes e sites para aprofundamento do estudo, 
discussões em fóruns ou encontros presenciais quando for o caso.
Praticando
Sugestão de atividades, no decorrer das leituras, com o objetivo didático de fortalecer 
o processo de aprendizagem do aluno.
Atenção
Chamadas para alertar detalhes/tópicos importantes que contribuam para a 
síntese/conclusão do assunto abordado.
6
Saiba mais
Informações complementares para elucidar a construção das sínteses/conclusões 
sobre o assunto abordado.
Sintetizando
Trecho que busca resumir informações relevantes do conteúdo, facilitando o 
entendimento pelo aluno sobre trechos mais complexos.
Exercício de fixação
Atividades que buscam reforçar a assimilação e fixação dos períodos que o autor/
conteudista achar mais relevante em relação a aprendizagem de seu módulo (não 
há registro de menção).
Avaliação Final
Questionário com 10 questões objetivas, baseadas nos objetivos do curso, 
que visam verificar a aprendizagem do curso (há registro de menção). É a única 
atividade do curso que vale nota, ou seja, é a atividade que o aluno fará para saber 
se pode ou não receber a certificação.
Para (não) finalizar
Texto integrador, ao final do módulo, que motiva o aluno a continuar a aprendizagem 
ou estimula ponderações complementares sobre o módulo estudado.
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introdução
Nos módulos anteriores vocês aprenderam um pouco mais sobre origem, evolução e composição 
celular, incluindo sua estrutura e função. Também conheceram um pouco mais sobre os polímeros 
biológicos e sua importância para todos os organismos. E, por fim, foram apresentados ao universo 
da biologia molecular. 
Ao longo dessa apostila, vamos discutir sobre as metodologias utilizadas na clonagem molecular 
para a produção de proteínas heterólogas. Quando ouvimos falar em proteínas, qual a primeira ideia 
que nos vem à cabeça? Uma das rápidas associações que é feita é pensar em nutrientes encontrados 
em carnes, leites, vegetais e legumes; outra associação também ocorre ao pensar nas enzimas. Estas 
associações apesar de estarem corretas não definem o que é uma proteína em si, qual é sua estrutura, 
nem qual é a sua função? 
A grande revolução da ovelha Dolly– que abriu caminho para a possibilidade de clonagem humana– 
foi a demonstração, pela primeira vez, de que era possível clonar um mamífero, isto é, produzir 
uma cópia geneticamente idêntica, a partir de uma célula somática diferenciada. Por isto, também 
tocaremos uns dos temas mais atuais e polêmicos dentro da biotecnologia, ou seja, a clonagem 
terapêutica e as famosas células-tronco por um lado, e os organismos transgênicos por outro. 
Desta maneira,por meioesperamos que vocês utilizem esta apostila e esse curso para aprofundarem 
mais no seu conhecimento sobre a grande área da biotecnologia.
Bons estudos!
objetivos
 » Consolidar as informações sobre as técnicas apresentando um roteiro para clonagem.
 » Introduzir os conceitos de clonagem reprodutiva e terapêutica e terapia gênica.
 » Discutir temas polêmicos e atuais: clonagem reprodutiva e terapêutica, terapia 
gênica e organismos transgênicos.
 » Conhecer o principal organismo procariótico utilizado para a produção de proteínas 
heterólogas.
 » Estudar a constituição básica de um vetor de expressão bacteriano.
 » Compreender quais são os fatores limitantes para a expressão heterólogas em 
Escherichia coli(E. Coli).
 » Entender quais são as limitações dos sistemas expressão bacterianos e quais são as 
soluções disponíveis para romper algumas destas limitações.
 » Introduzir os diferentes sistemas de expressão utilizados para produção de proteínas 
heterólogas.
 » Discutir a principais vantagens dos sistemas de expressão eucarióticos.
 » Relacionar a produção de proteínas heterólogas e sua utilização como um agente 
terapêutico.
 » Discutir a estreita relação entre a estrutura e a função de uma proteína.
9
unidAdE iClonAgEM 
MolECulAr
CAPítulo 1
introdução à produção de proteínas 
heterólogas
As eras das “ômicas” e a geração de 
informações em grande escala
O advento do sequênciamento automático e o desenvolvimento da bioinformática deram origem 
à era da genômica, na qual milhões e milhões de dados de sequências de DNA foram gerados 
oferecendo informações que abriram expectativas para várias outras áreas da ciência. Sendo assim, 
a genômica foi a primogênita das eras “ômicas”, ou análises em grande escala.
Com a Genômica passamos a entender os milhões de pares de bases que compõem os genomas de 
diversos organismos. O que aprendemos com o projeto genoma humano:
1. O genoma humano é composto de aproximadamente 3,1 bilhões de pares de bases.
2. O genoma é aproximadamente 99,9% o mesmo entre indivíduos de todas as 
nacionalidades.
3. Menos de 2% do genoma codifica genes.
4. Aproximadamente 50% do nosso DNA que não codifica proteína correspondem a 
sequências repetitivas.
5. O genoma possui aproximadamente 20.000 a 25.000 genes.
6. Muitos genes podem gerar mais de uma proteína, permitindo que as células 
humanas possam produzir até 100.000 proteínas.
7. A função de aproximadamente metade dos genes humanos não é conhecida.
A importância da rapidez e da quantidade de dados que foram gerados serviu para que novas ômicas 
surgissem, pois se podíamos obter tanta informação do DNA, porque não desenvolver ferramentas 
para gerarmos informações em grande escala também de outras biomoléculas? Com a genômica, 
deixamos de pensar em um único gene, agora se pensa nesse gene, mas dentro do genoma. 
10
UNIDADE I │ CLONAGEM MOLECULAR 
Desta forma, surgiram as “ômicas” que vão além da dupla hélice, transcriptômica, proteômica, 
metabolômica e fluxômica.
As “ômicas” vão ao encontro do complexo sistema que é o ser vivo, pois os organismos não 
funcionam como um conjunto de pequenas peças que não interagem si, ao contrário disso, essas 
pequenas peças montam uma engrenagem que funciona em harmonia. A única forma de realmente 
entender os organismos vivos é montar esse quebra-cabeça formado pelas pequenas peças. Com 
este propósito surgiram as ômicas.
A transcriptômica nos permite avaliar apenas as informações dentro do DNA que são transcritas, 
seguindo o fluxo da informação genética. O microarray foi a grande inovação biotecnológica desta 
área.
A proteômica analisa o produto final da transmissão da informação gênica, a coleção de proteínas 
de um determinado organismo. Analisamos com a proteômica o nível de expressão das proteínas, 
mudanças pós-traducionais, padrões de interação e localização celular. As proteínas também estão 
ganhando caras com a cristalografia.
A metabolômica é dedicada aos metabólitos celulares. Vamos agora entender como atuam os 
substratos, os produtos enzimáticos, metabólitos intermediários e secundários, hormônios e 
moléculas sinalizadoras. Já a fluxômica é a análise do fluxo dos metabólitos dentro da célula.
<http://www.scielo.br/pdf/cr/v40n3/a479cr1680.pdf>
<http://www.gmbahia.ufba.br/index.php/gmbahia/article/viewFile/257/248>
<http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio32/omicas_32.pdf>
Biotecnologia
Por mais difícil que seja definir biotecnologia, sempre virá algum fato, alguma informação que 
nos conduza a uma definição para biotecnologia. Palavras simples estão diretamente associadas 
a possíveis definições por nós elaboradas, como, clonagem, melhorias na qualidade de alimentos, 
fermentação e antibióticos(exemplos clássicos de biotecnologia), plantas e animais transgênicos, 
bioremediação, biosensores, vacinas, biomatérias, biocombustíveis. 
Definam biotecnologia utilizando algumas das palavras citadas acima.
Uma definição formal para biotecnologia foi dada na conversão de diversidade biológica (Convention 
on Biological Diversity (CDB): “qualquer tecnologia que é aplicada a organismos vivos para torná-
los mais valiosos para as pessoas” (“any technology that is applied to living organisms to make 
them more valuable to people”).
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CLONAGEM MOLECULAR │ UNIDADE I
A biotecnologia é uma ciência multidisciplinar e é impossível estudar biotecnologia sem a necessidade 
de agregar informações de diferentes áreas das ciências. Apesar de o enfoque inicial, da biotecnologia 
ter sido a biologia molecular em aplicações genéticas, hoje a biotecnologia necessita de todas as áreas 
das ciências, como biologia, química, matémática, ciências computacionais, engenharia, filosofia e 
economia. Economia parece um termo estranho, mas a biotecnologia corresponde a um dos campos 
da ciência que mais gera capital.
Vamos, rapidamente, exemplificar a interdisciplinaridade da biotecnologia:
1. Pesquisadores das ciências básicas descobrem um gene em bactéria que é promissor 
como agente para tratamento de uma doença em humano.
2. Biologistas moleculares, bioquímicos, biofísicos utilizam diversas técnicas para 
caracterizar o produto gênico e melhor conhecer as funções deste gene.
3. Os cientistas da bioinformática retiram informações a partir da sequência do gene e 
analisam a estrutura da proteína.
4. Conhecida as características do gene, ele então pode ser usado no desenvolvimento 
de fármacos, na agricultura, pode ser aplicado ao meio ambiente etc. Porém 
profissionais experientes de cada área estarão envolvidos na produção dos produtos 
biotecnológicos provindos do estudo deste gene.
5. Finalizando, os produtos serão comercializados.
Vamos discutir agora sobre algumas das aplicações da biotecnologia no mundo.
Bioprocessamento
A mais antiga das biotecnologias utiliza células vivas ou componentes moleculares das células 
para produzir o produto desejado. As células mais utilizadas são micro-organismos unicelulares 
como leveduras, bactérias e os componentes biomoleculares mais utilizados são enzimas, que são 
proteínas que catalizam reações químicas. 
A fermentação é o processo biotecnológico mais antigo que se tem conhecimento, lembrando que 
muito antes de Cristo, na Grécia antiga, já se tomava vinho e se comia pão. Podemos dizer que estes 
dois produtos, que hoje têm sua produção comandada pela biotecnologia, são os mais antigos relatos 
de produtos biotecnológicos. Enzimas produzidas por fermentação microbiana têm papel essencial 
na indústria de alimentos. Na atualidade, boa parte das enzimas envolvidas em fermentação durante 
a fabricação de alimentos é produzida em bactérias.
O primeiro produto alimentar que foi produzido por biotecnológica é uma enzima usada na 
fabricação de queijo. Esta enzima é a quimosina que inicialmente era purificada de bezerro, cabra 
e cordeiros, mas agora 80% da produção desta enzima são produzidas por micro-organismos 
geneticamente modificados. Outros exemplos de produtos em que a fermentação faz parte de seu 
processo de fabricação: cerveja, cidra, vinagre, iogurte e tofu.
12
UNIDADE I │ CLONAGEM MOLECULAR 
O bioprocessamento também está presente dentro do seu guarda-roupa. Por mais de um século, 
enzimas são usadas nas fases de fiação, tingimento e acabamento dos tecidos, tais como o 
clareamento e o amaciamento. Enzimas como celúlases e amilases tornam os tecidos mais limpos e 
macios, auxiliam em processos de desbotamento e retiram a goma dos tecidos.
Enzimas também atuamna limpeza da sua casa, quando são adicionadas em detergentes aumentando 
o poder de limpeza destes e os tornando mais biodegradáveis. Nos detergentes, são adicionados 
proteases, amilases e lipases para eliminar proteínas, amido e gordura, respectivamente. Celúlases 
são adicionadas em detergentes para remover manchas.
Hoje, produzem-se em grandes quantidades muitos produtos de valor– entre os quais as enzimas–
pela cultura de micro-organismos específicos, sob condições limpas e altamente controladas em 
recipientes chamados fermentadores. 
Por que a levedura é importante na produção de pão? E por que a massa do pão 
cresce?
A biotecnologia na produção de anticorpos 
monoclonais
Os anticorpos são proteínas produzidas pelo organismo como resposta às infecções. Uma das 
características mais importantes dos anticorpos é a sua alta especificidade. 
Os anticorpos monoclonais são produzidos em células do sistema imunológico e correspondem a 
um grande avanço no tratamento de cânceres (Figura 1).
As células possuem marcadores de proteína na sua superfície conhecidos como antígenos. Os 
anticorpos monoclonais são produzidos em laboratório para reconhecer marcadores proteicos 
específicos de células cancerosas. Ao reconhecer estes marcadores, os anticorpos ficam sobre essas 
proteínas e essa ação desencadeia um processo de autodestruição da célula, ou então comunica o 
sistema imune do corpo para destruir a célula cancerosa.
Estes anticorpos geralmente aumentam a eficácia de outros tratamentos, como a quimioterapia. 
Os anticorpos monoclonais também são usados para detectar poluentes ambientais e micro-
organismos nocivos em alimentos; para distinguir células cancerosas de células normais, para 
diagnosticar doenças infecciosas em seres humanos, animais e plantas, e, por fim, são usados em 
testes de gravidez. É a biotecnologia de mãos dadas com a busca da cura para as mais diversas 
enfermidades.
13
CLONAGEM MOLECULAR │ UNIDADE I
Figura 1. produção de anticorpos monoclonais.
Rato imunizado com antigênio X.
Linfócitos B
provenientes do rato.
Cultura celular de mielomas.
Hibridomas resultantes da fusão de 
linfócitos B com mielomas.
Desenvolvimento de
hibridomas em meios de cultura.
Seleção de hibridomas
produtoras de anticorpos X.
Clonagem de hibridomas
Isolamento de anticorpos monoclonais.
Hibridomas clonados são mantidos
em culturas permanentes
Figura retirada do site: <http://apuradabiologia.blogspot.com/2011/04/anticorpos-monoclonais.html>, retirada em: 17/9/2011.
A biotecnologia e as proteínas
A insulina recombinante foi o primeiro produto biotecnológico para benefício do homem. Este foi o 
primeiro grande passo da biotecnologia, a produção de uma proteína recombinante essencial para 
o tratamento de uma doença, a diabetes.
Antes da tecnologia do DNA recombinante, a insulina usada no tratamento de diabetes era purificada 
de pâncreas de porcos e vacas, e então injetada em diabéticos. O processo de purificação era lento, 
difícil, caro e geralmente a insulina continha impurezas. Além disso, a insulina purificada não era 
eficaz em todos os pacientes e, em alguns, provocava reações alérgicas. Em 1978, o gene da insulina 
humana foi clonado em plasmídeo, expresso em bactéria e então a proteína foi purificada. Em 1982, 
a insulina humana produzida em bactérias foi aprovada para uso em humanos.
Logo após a insulina, o hormônio do crescimento usado para tratamento de crianças com problemas 
de crescimento específicos foi também expresso em bactéria e purificado, tornando-se disponível 
para o uso no homem. Em pouco tempo, uma grande variedade de proteínas recombinantes para uso 
terapêutico foram disponibilizadas como resultado da tecnologia do DNA recombinante (Quadro 1).
14
UNIDADE I │ CLONAGEM MOLECULAR 
Quadro 1. proteínas recombinantes para uso terapêutico produzidas em bactérias
Proteína Hospedeiro para produção Aplicação médica
Eritropoietina Estimula a produção de células vermelhas do sangue. Tratamento de pessoas com anemia.
Fator VIII Fator de coagulação sanguínea. Tratamento de certos tipos de hemofilia.
Hormônio de crescimento 
humano (HGH)
Estimula o crescimento ósseo e muscular. Usado no tratamento de pessoas com alguns 
tipos de nanismo.
Insulina Hormônio necessário para absorção de glicose pelas 
células do corpo.
Tratamento de pessoas com diabetes.
Interferons e interleucinas Fatores de crescimento que estimulam o crescimento e 
produção de células sanguíneas.
Usado no tratamento de cânceres de células 
sanguíneas, como leucemia.
Vacinas Estimula o sistema imune para prevenir de infecções 
virais e bacterianas.
Usado para imunizar humanos e animais contra 
o ataque de patógenos.
Atualmente, a maior parte da insulina humana recombinante consumida por 
diabéticos é produzida por bactérias. Lembrando que o genoma humano contém 
íntrons e que as bactérias não são capazes de removê-los, qual o procedimento 
necessário para que a insulina possa ser produzida em bactéria?
<http://www.biotecnologia.com.br/>
<http://www.sbbiotec.org.br/portal/>
<http://www.freebooks4doctors.com/fb/BIOTE.HTM>
<http://learn.genetics.utah.edu/>
Primeiramente, o que seria a produção de proteínas heterólogas? Bom, o termo 
produção ou expressão de proteínas heterólogas se refere à síntese de uma 
determinada proteína de um organismo X, em um organismo de espécie diferente. 
Pode-se dizer que a produção de proteínas heterólogas envolve duas etapas: 
 » A primeira, que é a introdução de um DNA exógeno em uma célula hospedeira, ou 
seja, realizar a clonagem molecular, procedimento abordado com ênfase no curso 
anterior de Técnicas de Biologia Molecular e Clonagem. Com o DNA recombinante 
(rDNA) propagado por uma célula hospedeira, o próximo passo é identificar o 
sistemas de expressão adequado para receber o rDNA; 
 » A segunda é determinar os fatores que afetam a expressão do DNA exógeno para a 
síntese protéica no sistema de expressão escolhido.
Agora você pode estar se perguntando: “o que vem a ser um sistema de expressão?” Um sistema 
de expressão combina genes estruturais, sequências controladoras, marcadores e indutores. 
Assim, pode-se dizer que o DNA exógeno deve ser clonado em um plasmídeo de expressão, 
também chamado de vetor de expressão, que apresente uma compatibilidade genética com a célula 
15
CLONAGEM MOLECULAR │ UNIDADE I
hospedeira. Basicamente, todos os métodos existentes para produção de proteínas heterólogas 
seguem as mesmas etapas: um gene (DNA exógeno) a ser expresso é introduzido em um vetor de 
expressão, e este vetor recombinante é inserido em uma célula hospedeira. Como já mencionado 
no curso anterior de Técnicas de Biologia Molecular e Clonagem, os vetores de expressão além de 
apresentam os elementos que estão presentes nos vetores de clonagem, possuem ainda elementos 
adicionais. Sendo estes: promotores (região promotora), responsáveis por direcionar a síntese de 
grandes quantidades de mRNA (RNA mensageiro) correspondente ao gene de interesse (DNA 
exógeno); pequenas sequências que permitem uma replicação autônoma dentro do organismo 
hospedeiro (origem de replicação, ori); sequências que codificam para características que permitem 
que as células hospedeiras, contendo o vetor recombinante, sejam selecionadas (marcador de 
seleção); sequências que determinam o início e o término do processo de traduçãoe sequências que 
aumentam a eficiência com a qual o mRNA é traduzido. 
Atualmente, há uma grande variedade de células hospedeiras disponíveis para produção de proteínas 
recombinantes, desde células procariotas (bactérias) até células eucariotas (fungo, inseto, vegetal, 
e mamífero). Para a escolha das células hospedeiras na produção heteróloga de uma determinada 
proteína, é necessárioter em mente a resposta para duas questões simples:
 » Para qual a finalidade esta proteína será produzida? 
 » Quais as propriedades desta proteína recombinante? 
As respostas destas perguntas levam a uma análise mais cuidadosa durante a escolha de um sistema 
de expressão, pois a produção de proteínas recombinantes depende de muitos fatores. Tais como 
as características de crescimento celular, níveis de expressão, expressão intracelular e extracelular, 
modificações pós-traducionais e atividade biológica da proteína de interesse. Além disso, para a 
seleção de um determinado sistema de expressão uma questão tão relevante quanto as anteriores é 
a relação custo benefício.
Bactérias como Escherichia coli (E. coli), frequentemente são o ponto de partida para a produção de 
proteínas recombinantes. São de fácil cultivo, capazes de se multiplicarem rapidamente atingindo 
uma alta densidade celular em meios de cultura relativamente baratos, sua genética e fisiologia são 
bem conhecidas e também existe uma grande disponibilidade de diferentes sistemas de expressão. 
Apesar de estas características tornarem E. coli um organismos atrativo para a produção de proteínas 
heterólogas, há também algumas desvantagens associadas: a falta de capacidade em realizar 
modificações pós-traducionais; frequentemente a expressão de grandes quantidades de proteínas 
podem induzir a formação de precipitados proteicos (“corpos de inclusão”); não possui um sistema 
de secreção eficiente e também há uma certa dificuldade para formação de ligação dissulfeto. Dessa 
forma, pode-se dizer que não há um determinado tipo célula hospedeira universal, que funcionará 
perfeitamente para todas as proteínas. Outro extremo são células de mamíferos, uma das células 
hospedeiras mais complexas e caras. Normalmente, elas são a opção de escolha para a produção de 
proteínas grandes e que necessitam de extensivas modificações pós-traducionais. Entre estas duas 
opções, existem outros sistemas que apresentam um custo de produção intermediário e a capacidade 
de realizar algumas modificações pós-traducionais. A Figura 2 traz uma representação esquemática 
dos diferentes organismos que podem ser utilizados na obtenção de uma proteína recombinante.
16
UNIDADE I │ CLONAGEM MOLECULAR 
Figura 2. Características dos diferentes sistemas disponíveis para produção de proteínas heterólogas, comparando 
velocidade de produção da proteína recombinante, o custo total para obtenção da proteína de interesse, escala 
entre o nível de complexidade exigido pelo tempo gasto, e o controle do produto recombinante acumulado.
Levedura PlantasCélulas de
mamíferos
Fungo
Filamentoso
Bactéria Animais
Legenda:
Pior Melhor
Velocidade
Custo/g
Modificações
Pós-tradicionais
Escala
Controle
Figura extraída e modificada do artigo Making recombinant proteins in animals – different systems, different applications, 
TRENDS in Biotechnology, 21: 394-399/ <http://www.cell.com/trends/biotechnology/abstract/s0167-7799%2803%2900190-
2>,acesso em: 15/12/2011.
Apesar de existirem trilhões de células de E. coli no lúmen intestinal humano, 
algumas mutações podem levar a patogenicidade. 
Qual a grande vantagem de produzir proteínas de forma heteróloga, já que essas 
mesmas proteínas são encontradas em seus organismos originais?
Produção de proteínas heterólogas em E. coli
Como vimos nos módulos anteriores, E. coli (Figura 3) é um dos micro-organismos mais utilizados 
tanto para clonagem molecular como para produção de proteínas recombinantes. É uma bactéria 
gram-negativa, possui formato de bastonete, com tamanho variando entre 1 a 2,5 µm e seu habitat 
natural é o cólon de mamíferos. Possui ainda uma membrana externa que apresenta cerca de 10 
flagelos e alguns pelos, uma fina parede celular e uma membrana citoplasmática revestindo os 
componentes celulares. Como os demais organismos procariotos, E. coli não possui um núcleo 
e seu material genético é livre no citoplasmas. É uma bactéria, na maioria das vezes, inofensiva, 
ocasionalmente algumas linhagens podem se tornar patogênica e secretar toxinas que provocam 
diarréia, por exemplo. 
17
CLONAGEM MOLECULAR │ UNIDADE I
Figura 3. E. coli, bactéria gram-negativa que apresenta três camadas envolvendo e citoplasma. A membrana externa e a 
membrana citoplasmática são bicamadas lipídicas, e a parede celular é constituída de peptidoglicanos. diferentemente das 
células eucarióticas não há uma membrana envolta no cromossomo, permitindo que o dNA fique livre no citoplasma.
Modificado de Biotechnology: Applying the Genetic Revolution, david p. Clark, Nanette pazdernik (2009).
Em um meio rico durante a fase exponencial de crescimento, E. coli pode se multiplicar a cada 
20-30 minutos. Assim, durante o período de uma noite, um único organismo pode se multiplicar e 
produzir uma colônia ou mesmo 1-2 bilhões de células por milímetro de meio de cultura. A facilidade 
com que esta bactéria pode ser transformada e manipulada geneticamente são fatores que tornam 
E. coli uma das melhores opções de escolha para propagação, caracterização de DNA recombinante 
e produção de proteínas heterólogas. Nos últimos 60 anos, esta bactéria tem sido objeto de estudo 
das mais diversas áreas, o que tornou a E. coli o organismo mais conhecido na face da terra. Uma 
grande variedade de mutantes de E. coli já foi isolado e caracterizado. Quase todas as linhagens, 
utilizadas nos experimentos de DNA recombinante, são originárias de uma única linhagem: E. coli 
K-12, isolada de fezes de um paciente com difteria em 1922. 
E. coli é um micro-organismo modelo extensivamente utilizado em biologia molecular e biotecnologia, 
pois possui um estrutura relativamente simples, é de fácil manipulação e é cultivada com facilidade 
em laboratório, possui pouquíssimos genes (quando comparado a outros organismos), seu genoma 
é composto por aproximadamente 4,6 milhões de pares de bases e inclui mais de 4000 genes 
codificantes para proteínas. Sua capacidade de atingir uma alta densidade celular, em um espaço 
de tempo relativamente curto, a torna altamente eficiente na produção de proteínas recombinantes, 
permitindo a obtenção de até 50% do total de proteínas celular. A genética de E. coli é a mais conhecida 
entre os demais micro-organismos, assim como os processos de transcrição e tradução. O domínio 
da genética e da fisiologia de E. coli, em conjunto com a grande disponibilidade de ferramentas de 
melhoramento genético, torna esta bactéria um dos organismos mais promissores na produção de 
proteínas heterólogas. Seu genoma pode ser modificado com facilidade e precisão, é relativamente 
fácil ter controle sob o promotor, o número de cópias do plasmídeo pode ser facilmente alterado, 
além de sobreviver em diferentes condições ambientais (aeróbico ou anaeróbico). Todas estas 
características tornam E. coli o organismo mais utilizado na produção de proteínas recombinantes. 
18
UNIDADE I │ CLONAGEM MOLECULAR 
E. coli é um excelente sistema para expressão de proteínas não glicosiladas, entretanto nem todos os 
genes podem ser expressos eficientemente neste organismo. O fato deve-se a algumas características 
estruturais sutis da sequência gênica, à estabilidade e à eficiência translacional do mRNA, à 
facilidade de enovelamento da proteína recombinante, à degradação da proteína(devido à presença 
de determinadas proteases celulares), a diferenças marcantes entre os códons utilizados pelo gene 
exógeno e os preferenciais de E. coli e o risco em potencial de toxidade da proteína recombinante 
para a célula hospedeira. Atualmente, um planejamento cuidadoso de sistemas de expressão pode 
minimizar as dificuldades listadas acima. Todavia, os pontos mais problemáticos da utilização de E. 
coli para algumas proteínas de eucariotos são a faltada capacidade em realizar modificações pós-
traducionais, a falta de um mecanismo eficiente para a liberação dos produtos recombinantes no 
meio de cultura e a limitação na capacidade de facilitar a formação de ligações dissulfeto. 
Atualmente, inúmeras linhagens de E. coli estão disponíveis para a produção de proteínas 
recombinantes, mas as mais utilizadas são a BL21 e K-12 e seus derivados (Quadro 2). E. coli BL21 
é uma linhagem robusta apresentando um bom crescimento até mesmo em meio mínimo. Esta 
linhagem é deficiente nas proteases ompT e lon, proteases que podem interferir no isolamento da 
proteína recombinante intacta. Há vários derivados de BL21, incluindo a linhagem mutante recA, 
utilizada para estabilizar plasmídeos alvos que possuem sequências repetitivas (Novagen BLR 
strain). Mutantes trxB/gor são utilizados para facilitar a formação de ligação dissulfeto de proteínas 
recombinantes expressas no citoplasma (Novagen Origami and AD494 strains). Mutantes lacY 
permitem o ajuste dos níveis de expressão proteico (Novagen Tuner series) e facilitam a expressão 
solúvel de proteínas que são propensas a irem para corpos de inclusão e proteínas de membrana 
(Avidis C41(DE3) and C43(DE3) strains).
Quadro 2. Algumas das linhagens de E. coli mais utilizadas para produção heteróloga de proteínas e suas 
características. 
Linhagem de E. Coli Derivado de Característica chave
AD494 K-12 Mutante trxB, facilita a formação de ligação disulfeto no citoplasma;
BL21 B834 Deficiente nas proteases Ion e ompT;
BL21trxB BL21 Mutante trxB, facilita a formação de ligação disulfeto no citoplasma;
Deficiente nas proteases Ion e ompT;
BL21 CodonPlus-RIL BL21 Aumenta a expressão de proteínas eucarióticas que possuem códons raros em 
E. coli: AGG, AGA, AUA e CUA; Deficiente nas proteases Ion e ompT;
BL21 CodonPlus-RP BL21 Aumenta a expressão de proteínas eucarióticas que possuem códons raros em 
E. coli: AGG, AGA e CCC; Deficiente nas proteases Ion e ompT;
BLR BL21 Mutante de recA; Estabiliza repetições em tandem;
Deficiente nas proteases Ion e ompT;
B834 Linhagem B Auxotrófica para metionina (Met); Marcação com 35S-Met;
C41 BL21 Mutante construído para expressão de proteínas de membranas;
C43 BL21 Duplo mutante construído para expressão de proteínas de membranas; 
HMS174 K-12 Mutante recA; resistências a rifampicina (Rif)
JM83 K-12 Utilizada para a secreção de proteínas recombinantes para o periplasmas;
19
CLONAGEM MOLECULAR │ UNIDADE I
Origami K-12 Mutante de trxB/gor; facilita a formação de ligação dissulfeto no citoplasma;
Origami B K-12 Mutante de trxB/gor; facilita a formação de ligação dissulfeto no citoplasma;
Deficiente nas proteases Ion e ompT;
Rosetta BL21 Aumenta a expressão de proteínas eucarióticas que possuem códons raros em 
E. coli: AUA, AGG, AGA, CGG, CUA, CCC e GGA; Deficiente nas proteases Ion e 
ompT;
Rosetta-gami BL21 Aumenta a expressão de proteínas eucarióticas que possuem códons raros 
em E. coli: AUA, AGG, AGA, CGG, CUA, CCC e GGA; Deficiente nas proteases 
Ion e ompT; Mutante de trxB/gor; facilita a formação de ligação dissulfeto no 
citoplasma;
dados retirados e modificados de Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from 
molecular and biochemical fundamentals to commercial systems, K. terpe (2006).
O índice que mede a quantidade de fezes na água, conhecido como índice de 
coliformes fecais, se refere exatamente a quantidade de E. coli nas amostras. Esse 
monitoramento garante a qualidade da água potável dos municípios. 
Vetores de expressão bacteriana
Um vetor de expressão bacteriana bem projetado traz um conjunto de elementos gênicos otimizados: 
que afetam tanto os processos transcripcionais como os traducionais, que conferem resistência 
a um determinado antibiótico facilitando a seleção fenotípica do vetor, que possui o replicon, 
composto pela origem de replicação (ori) e em alguns casos elementos cis atuantes. A maioria dos 
plasmídeos usados em vetores de expressão de proteínas recombinantes tem a origem de replicação 
ColE1 e p15A. A origem de replicação é responsável por controlar o número de cópias do plasmídeo. 
O replicon ColE1, presente nos plasmídeos utilizados atualmente para expressão heteróloga, é 
derivado das famílias de plasmídeos pBR322, que permite um número de cópias entre 15 e 20, 
ou do PUC, que permite um número de cópias entre 500 e 700. Já o replicon p15A é derivado do 
pACYC184, que permite um número de cópias entre 10 e 12. Estes plasmídeos apresentam uma 
alta estabilidade ao serem replicados sob fortes condições seletivas, diminuindo a probabilidade de 
haver perda plasmidial nas células filhas. 
Esses vetores permitem uma rápida expressão da proteína recombinante, mas normalmente 
necessitam de uma pressão de seleção ativa, por exemplo, a presença de antibióticos. Dependendo 
da necessidade, há plasmídeos construídos para permitir um baixo número de cópias, ou ainda 
cassetes de expressão incorporados no cromossomo bacteriano. Diversos elementos devem estar 
presentes em um vetor de expressão, assim a construção deste plasmídeo deve ser cuidadosamente 
planejada para assegurar o melhor nível de expressão proteica.
Um plasmídeo, cuja sequência apresenta elementos cis atuantes, significa que 
todos os genes presentes neste plasmídeo não têm qualquer influência sob outras 
moléculas de DNA. Genes capazes de gerar qualquer efeito em outras moléculas de 
DNA são ditos como moléculas trans atuantes. 
20
UNIDADE I │ CLONAGEM MOLECULAR 
Os elementos e a configuração de um vetor de expressão para E. coli estão esquematizados na Figura 
4. O promotor deve ficar posicionado em aproximadamente 10 a 100 pares de base (pb) upstream, 
ou seja, acima do sítio de ligação ao ribossomo (RBS, do inglês ribosome-binding site) e sob o 
controle de um gene regulador, que pode estar presente no vetor ou integrado no cromossomo da 
célula hospedeira. Os promotores de E. coli são formados por uma sequências de seis nucleotídeos 
localizados em cerca de 35pb upstream, ou seja, 35pb acima do sítio de iniciação da transcrição 
(região 235), separado por uma pequena sequências de hexanucleotídeos (região 210). Existem 
vários promotores disponíveis para expressão de um gene em E. coli, incluindo aqueles derivados 
de bactérias gram-negativas e de bacteriófagos. As características gerais que um promotor são: 
 » deve ser um promotor forte;
 » deve apresentar um baixo nível de expressão basal, ou seja, deve ser altamente 
regulado;
 » deve ser de fácil transferência para outra linhagem de E. coli, o que permite testar 
diferentes linhagens para otimização do rendimento proteico;
 » deve ser de fácil indução e preferencialmente barato.
O sítio de ligação ao ribossomo (RBS), compreende uma região de 54 nucleotídeos ligados a posição 
235 e 119/122 das sequências codificante para o mRNA. A sequências de Shine-Dalgarno (SD) 
interage com o final 3’ do rRNA 16S durante o inicio da tradução. A distância entre a sequências de 
SD e o códon de iniciação é de cerca de 5 a 12 bases, e a sequências desta região preferencialmente 
deve ser otimizada para eliminar a probabilidade de formação de estrutura secundária no transcrito 
de mRNA, fato que pode reduzir a eficiência do inicio da tradução. Ambas as regiões 5’ e 3’ do 
RBS exibem uma certa preferência por um alto teor de adenina. O terminador da transcrição está 
localizado logo após a sequência do gene de interesse e tem dupla função, a de terminar a transcrição 
e a de atuar também como um elemento de proteção do mRNA contra degradação exonucleolítica. 
Além destes elementos que tem um impacto direto na eficiência da expressão gênica, esses vetores 
de expressão devem possuir um gene que confere resistência a um antibiótico, permitindo a seleção 
e propagaçãoplasmidial. Geralmente, a ampicilina é bastante utilizada para este fim, entretanto 
na produção de proteínas terapêuticas frequentemente é necessário utilizar outros marcadores 
de seleção para evitar prováveis reações alérgicas em humanos. E por fim, o número de cópias 
plasmidial, determinado pela origem de replicação, em alguns casos a utilização dos replicons, 
resulta em uma amplificação plasmidial massiva em conjunto com altos rendimentos de plasmídeos 
codificantes para o produto recombinante. A eficiência final da expressão protéica depende de vários 
fatores como: dosagem gênica, presença de um promotor forte, estabilidade do mRNA e eficiência 
do início da tradução, fatores que veremos mais detalhadamente abaixo. 
21
CLONAGEM MOLECULAR │ UNIDADE I
Figura. 4 Representação esquemática dos elementos essenciais de um vetor de expressão bacteriana. A) Arquitetura básica 
de um vetor de expressão em E. coli. B) Representação mais detalhada dos elementos essenciais do vetor. O promotor tac 
(p) formado pelas sequências -31 e -10, separadas por espaçador de 17 bases. A seta indica a direção da transcrição. O sítio 
de ligação ao ribossomo (RBs) é formado pelas sequências shine-dalgarno (sd), seguido por um espaço traducional rico em 
At que possui um comprimento otimizado de aproximadamente oito bases. A sequências de sd interagem com 3’ do RNA 
ribossomal 16s durante o inicio da tradução. Os três códons de iniciação estão mostrados junto com a frequência de utilização 
em E. coli. dos três códons de terminação, UAA seguido por U é a sequências de terminação mais eficiente em E. coli. O 
repressor é codificado por um gene regulatório (R) que modula a atividade do promotor, e que pode estar presente no vetor 
ou ainda integrado no cromossomo da célula hospedeira. O terminador da transcrição (tt) atua na estabilização do mRNA de 
do vetor, um gene de resistência a antibiótico (exemplo, tetraciclina) que facilita a seleção fenotípica do vetor, a origem de 
replicação (Ori) que determina o número de cópias do vetor. 
Figura A retirada e modificada de <http://homepage.univie.ac.at/nikos.pinotsis/webpp/genetoprotein/clo_vector/Ecoli_vector-
features.html>. Figura B retirada e modificada de Stratégies for efficient production of heterologous proteins in Escherichia 
coli, s. Jana . J. K. deb (2005).
22
CAPítulo 2
Clonagem molecular
Antes de iniciarmos este capítulo, vamos definir o que é clonagem molecular: é todo o processo de 
construção de moléculas de DNA recombinante, que, basicamente, compreende duas etapas: 
1. O fragmento de DNA de interesse, chamado de inserto, é ligado à outra molécula de 
DNA (vetor de clonagem), gerando a molécula de DNA recombinante;
2. O DNA recombinante é propagado em uma célula hospedeira.
Clonagem molecular também é conhecida como:
3. engenharia genética;
4. manipulação gênica;
5. clonagem gênica;
6. tecnologia do DNA recombinante.
Até o momento, tivemos uma visão geral das descobertas que resultaram na consolidação da Biologia 
Molecular como uma área das ciências biológicas. Vimos também a importância da descoberta do 
DNA como transmissor da informação gênica. Conhecemos as principais técnicas que permitem 
a manipulação do DNA. Com todo esse conhecimento que foi passado até agora, já podemos 
vestir nosso jaleco e adentrarmos em um laboratório de biologia molecular, pois nesse momento, 
começaremos a por em prática os ensinamentos aqui expostos.
Sintam-se em um laboratório, pois seguiremos um roteiro de clonagem molecular com a finalidade 
de obter uma molécula de DNA recombinante. 
Inicialmente, iremos fazer algumas considerações pertinentes ao processo de clonagem molecular. 
Antes de iniciarmos a clonagem de um gene temos que saber qual será a fonte para obtermos o DNA 
de interesse em quantidade suficiente para manipulá-lo. Para este fim, precisamos de informações 
sobre este gene, como:
1. sequência de nucleotídeos, que nos permitirá obter os oligonucleotídeos que 
delimitará a sequência de interesse;
2. organismo de origem, se é eucarioto ou procarioto;
3. se for procarioto poderemos isolar o gene por PCR, a partir do DNA da fonte;
4. se for eucarioto poderemos isolar por PCR, se nos for dado como fonte cDNAs, mas 
teremos que isolar por RT-PCR se a fonte for mRNA;
5. de acordo com as análises a serem realizadas, determinar qual vetor de clonagem 
que será usado. Geralmente, genes específicos são isolados para serem expressos 
em uma célula hospedeira com a finalidade do produto proteico ser caracterizado.
23
CLONAGEM MOLECULAR │ UNIDADE I
roteiro para clonagem molecular
Objetivo: Adentramos como estagiários em um laboratório que tem como linha de pesquisa o estudo 
de genes que possam estar relacionados com doenças neurodegenerativas. O chefe do laboratório, 
Dr. X deu- nos a incumbência de clonar o gene que codifica a proteína humana Septina 3 (SEPT3) 
em um plasmídeo de expressão em bactéria, pois há informações na literatura que relacionam esta 
proteína com o mal de Alzheimer. 
Dr. X deu- nos uma biblioteca de cDNA (nada mais é que uma coleção de diferentes cDNAs) como 
fonte para a obtenção do DNA e os oligonucleotídeos que delimitam a sequência de interesse e 
contém sequências adicionais para as enzimas de restrição BamHI em um oligonucleotídeos e XhoI 
no outro. O plasmídeo de clonagem será o pET28a (Figura 5) comercializado pela empresa Novagen.
Mais algumas informações nos foram passadas, como a sequência de SEPT5 que está depositada no 
Gene Bank sob o número de acesso NM_019106.4 e que possui 1014 nucleotídeos (Figura 6).
Figura 5. plasmídeo de expressão em bactéria pEt28a. O Box é um zoom de algumas partes do plasmídeo. As setas numeradas 
indicam: 1, MsC; 2: sequência do gene que confere resistência ao antibiótico canamicina (Kan).3: Origem de replicação (Ori); 
4: Região promotora (t7 promoter); 5: RBs; 6: sequência que codifica para seis resíduos de histidina que ficará fusionada ao 
gene de interesse.
Figura adaptada do site: <http://www.genomex.com/vector_maps/ pEt28_map.pdf>, retirada em:17/9/2011.
24
UNIDADE I │ CLONAGEM MOLECULAR 
Figura 6. sequência de nucleotídeos que codifica a proteína sEpt3. Em negrito e sublinhado estão os três nucleotídeos que 
iniciam e os que finalizam a sequência de sEpt3. Em negrito, a região de pareamento dos oligonucleotídeos e em letra 
maiúscula as sequências adicionais dos oligonucleotídeos que codificam a enzima BamHI (GGAtCC) e XhoI (CtCGAG).
Fonte: Gene Bank sob o número de acesso NM_019106.4.
Vamos às etapas do procedimento, aproveitando para consolidar os conhecimentos já adquiridos 
até o momento:
1. Amplificação do fragmento de DNA por PCR, utilizando os oligonucleotídeos e a 
biblioteca de cDNA como DNA molde. Ou seja, vamos agora obter o inserto de DNA 
que codifica a proteína SEPT3. Após a realização da PCR, precisamos confirmar se 
a reação foi realizada com sucesso.
Como podemos analisar o resultado? Utilizaremos a técnica de eletroforese em gel 
de agarose, no qual aplicaremos uma pequena amostra da PCR. 
Confirmação: por análise da reação em eletroforese em gel de agarose (Figura 7).
Figura 7. Confirmação da amplificação de sEpt3. 1: Corresponde ao padrão de fragmentos de dNA 
de tamanhos conhecidos. 2: produto da pCR, conforme o tamanho esperado, próximo a 1000 pares 
de bases (pb).
2. Agora que temos o inserto, precisamos prepará-lo junto com o vetor de clonagem 
para que eles fiquem adequados para serem unidos.
25
CLONAGEM MOLECULAR │ UNIDADE I
Como vimos, o Dr. X nos deu os oligonucleotídeos contendo as sequências de 
reconhecimento para as enzimas de restrição BamHI e XhoI. Sendo assim, após a 
amplificação do fragmento, este deve ser digerido com estas enzimas juntamente 
com o plasmídeo pET28a para queambos tenham extremidades complementares 
para a reação de ligação (Figura 8).
Figura 8. Clivagem do pEt28a e do produto amplificado com as enzimas BamHI e XhoI. 
3. No próximo passo, realizaremos a ligação entre o inserto e o plasmídeo. Lembrando 
que para este fim utilizaremos a enzima T4 DNA ligase. Após a ligação, o plasmídeo 
retorna a sua condição circular, só que agora carregando o gene de interesse (Figura 9).
Figura 9. Reação de ligação originando um dNA recombinante.
26
UNIDADE I │ CLONAGEM MOLECULAR 
4. Montamos nosso DNA recombinante, mas ainda precisamos propagá-lo em 
bactéria para que, assim, possamos obtê-lo em quantidades suficientes para futuras 
análises. Além disso, precisamos confirmar se a ligação do fragmento ao plasmídeo 
ocorreu como esperado. Nesta etapa, realizaremos a transformação da bactéria 
Escherichia coli com o plasmídeo recombinante. As bactérias que carregam o DNA 
recombinante (bactérias transformantes) serão selecionadas por resistência ao 
antibiótico canamicina, conferida pelo plasmídeo pET28a (Figura 10).
Figura 10. Resultado da transformação da bactéria com o dNA recombinante. (A) placa controle: 
transformação realizada com água no lugar do dNA, neste caso não cresce bactérias no meio contendo 
antibiótico. (B) transformação com o dNA recombinante, os pontos brancos representam as colônias de 
bactérias resistentes ao antibiótico canamicina.
5. Tudo indica que conseguimos propagar nosso DNA na bactéria. Mas, para termos 
certeza, precisamos extrair o DNA plasmidial da bactéria. Para realizamos este 
procedimento, colocamos as bactérias para crescer em meio líquido e deixamos que 
elas se multipliquem por aproximadamente 14 horas. Desta forma, teremos uma 
quantidade de células suficiente para extrairmos o DNA. Um das vantagens em 
utilizar bactérias como células hospedeiras para propagação de DNA é o fato de o 
ciclo de vida delas ser curto, aproximadamente 20 minutos. Logo, após 14 horas de 
crescimento a quantidade de célula é muito superior em relação à quantidade inicial.
Já temos o DNA recombinante em quantidade suficiente para ser analisado, então agora partiremos 
para confirmar a clonagem, ou seja, confirmar que este DNA que extraímos é formado pelo plasmídeo 
pET28a + SEPT3. Para fazer a confirmação, utilizaremos duas técnicas, digestão com enzima de 
restrição e sequênciamento de DNA: Clivagem do DNA extraído da bactéria com as enzimas BamHI 
e XhoI, as mesmas que nós utilizamos para preparar o plasmídeo e o inserto. Quando os DNAs 
foram unidos pela ação da ligase os sítios das enzimas de restrição foram restituídos, logo ficando 
disponíveis para serem reconhecidos e clivados pelas respectivas enzimas. Vamos então realizar a 
eletroforese em gel de agarose para analisarmos o resultado esperado para esta clivagem (Figura 11).
27
CLONAGEM MOLECULAR │ UNIDADE I
6. 
Figura 11. Confirmação da inserção de sEpt3 no plasmídeo pEt28a. 1, 2, 3, correspondem aos dNAs 
extraídos de 3 colônias de bactérias transformantes. M corresponde aos fragmentos de dNA de tamanho 
conhecido, marcador de pares de bases. As setas indicam as bandas correspondentes ao plasmídeo 
pEt28a (aproximadamente 5.400 pb) e ao inserto sEpt3 (1014 pb).
Como desejávamos, o inserto foi inserido dentro do plasmídeo e isso é confirmado pela presença 
dos fragmentos de DNA no gel correspondente ao pET28a e o inserto após a ação das enzimas 
de restrição. Quando realizamos este tipo de análise, dizemos que estamos avaliando o padrão de 
restrição do DNA.
Como nós isolamos nosso gene de uma biblioteca de cDNA, ou seja, de uma mistura de cDNAs, é 
importante que nós confirmemos que a sequência do fragmento de DNA amplificado corresponde 
a SEPT3. 
Então, como segunda estratégia de confirmação da clonagem nós vamos sequênciar o DNA 
recombinante. Geralmente, nos laboratórios que possuem o equipamento sequênciador de DNA 
automático, há uma pessoa responsável por manuseá-lo. Logo, nós passamos o nosso DNA e o 
oligonucleotídeo para esta pessoa e ela nos dará o resultado do sequênciamento. 
E agora, como vamos saber se a sequência corresponde a SEPT3? Para isto fazemos o uso de 
ferramentas da bioinformática que estão disponíveis na web. Além das ferramentas que estão 
disponíveis no site NCBI, que já foram vistas na disciplina “Dogma Central da Biologia Molecular 
e Introdução à Bioinformática”, há um conjunto de ferramentas de busca de similaridade chamada 
BLAST, que tem por finalidade procurar similaridade entre sequências. Entre as ferramentas de 
busca, a que nos interessa é chamada de BLASTx. 
28
UNIDADE I │ CLONAGEM MOLECULAR 
No BLASTx, nós colocamos uma sequência de nucleotídeo para serem analisados e o programa irá 
traduzir para sequência de aminoácidos, que será comparada com sequências presentes em bancos 
de dados de proteínas.
Na Figura 12 é apresentada a página principal do site, para que todos possam acompanhar como 
proceder para fazer a busca com esta ferramenta da bioinformática. 
Figura 12. página principal da ferramenta para busca de similaridades entre sequências. BLAstx.
<http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?pROGRAM=blastx&BLAst_pROGRAMs=blastx&pAGE_
typE=Blastsearch&shOW_dEFAULts=on&LINK_LOC=blasthome>.
Inserimos a sequência que recebemos após o sequênciamento no Box indicado pela seta 1 e, em 
seguida, clicamos no botão BLAST indicado pela seta 2. Ao chegar o resultado da busca, caminhamos 
pela página até identificarmos uma lista, como mostrado na Figura 13. No topo desta lista, já 
identificamos a septina 3, confirmando que nossa sequência corresponde à septina 3 de Homo 
sapiens, ou seja, humana. Clicando no ícone ao lado do nome, como indicado pela seta, teremos 
mais informações sobre o alinhamento das sequências.
Parabéns a todos os estagiários, pois concluíram o objetivo proposto pelo Dr. X. Mas, agora vocês 
poderiam perguntar o que será feito com esse DNA recombinante? Como o interesse do Dr. X é 
caracterizar a proteína SEPT3, este DNA recombinante será introduzido em uma bactéria que 
contém algumas características que favorecem a expressão de genes exógenos que se encontram 
em um plasmídeo de expressão. Logo, a SEPT3 será expressa por estas bactérias que, em etapas 
seguintes, será purificada e passará por várias análises para, então, ser caracterizada estruturalmente 
e funcionalmente. Os procedimentos de expressão, purificação e de caracterização estrutural de 
proteínas serão vistos nas próximas disciplinas.
29
CLONAGEM MOLECULAR │ UNIDADE I
Figura 13. Resultado da busca por similaridade de sequências com a ferramenta BLAstx.
Fonte: <http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi>.
<http://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::595::600:: /sites/
dl/free/0072552980/115875/micro10.swf::Steps%20in%20Cloning%20a%20Gene>
<http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/plasmidcloning.
html>
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21696/>
<http://www.blackwellpublishing.com/allison/docs/sample_ch8.pdf>
Sistema livre de células (Cell-free systems)
O sistema livre de células para síntese proteica utiliza o extrato ou lisado celular contendo toda a 
maquinaria de síntese proteica, e os elementos relativos que direcionam a síntese de uma proteína 
a partir de um DNA adicionado ou um mRNA molde (Figura 14). Em geral, extratos de qualquer 
célula podem ser feitos ou reconstituídos para a síntese de proteínas utilizando um DNA molde ou 
um mRNA molde. Por exemplo, um sistema livre de células utilizando um extrato de E. coli e um 
DNA plasmidial, o extrato celular deverá conter ou ser suplementado com uma RNA polimerase 
para transcrever o gene de interesse, os mRNAs são traduzidos por uma mistura complexa contendo 
ribossomos e fatores complementares de iniciação,alongamento e terminação, assim como um 
conjunto completo de aminoacil-tRNA sintetase e outras enzimas essenciais para síntese protéica. 
A presença de chaperonas moleculares, proteínas dissulfeto e peptidil-proli cis-trans isomerases, 
geralmente garantem que as proteínas sintetizadas serão enoveladas corretamente e estarão 
solúveis e ativas. Com extratos de células eucarióticas, é possível ainda programar a síntese protéica 
diretamente com um transcrito de mRNA que pode ser produzido diretamente a partir de produtos 
de PCR, e a presença de fatores responsáveis pela realização de modificações pós-traducionais 
asseguram que as proteínas sintetizadas, neste sistema, certamente serão biologicamente ativas. 
Devido à simplicidade destes sistemas, muito se tem feito para melhorar a produtividade e a 
eficiência. Os fatores limitantes para produção de proteínas heterólogas utilizando sistemas livres 
de células é o baixo rendimento do produto final, devido à ausência de uma fonte contínua de 
30
UNIDADE I │ CLONAGEM MOLECULAR 
aminoácidos e nucleotídeo trifosfato na mistura da reação e de um sistema eficiente de regeneração 
de energia. 
Figura. 14 sistema livre de célula. Esquema representativo da síntese protéica utilizando um sistema livre de célula.
Figura extraída e modificada de Advances in Escherichia coli production of therapeutic proteins, J. R swartz (2001). 
31
unidAdE ii
ClonAgEM 
rEProdutiVA E 
tErAPêutiCA
CAPítulo 1
Clonagem reprodutiva: o caso da 
ovelha dolly
Um clone é definido como uma população de moléculas, células ou organismos que se originaram 
de uma única célula e que são idênticas à matriz original. A clonagem é um mecanismo comum de 
propagação da espécie em plantas ou bactérias. Em humanos, os clones naturais são os gêmeos 
idênticos que se originam da divisão de um óvulo fertilizado. Dolly foi a demonstração, pela primeira 
vez, de que era possível clonar um mamífero, isto é, produzir uma cópia geneticamente idêntica, a 
partir de uma célula somática diferenciada. Os criadores de Dolly, comandados pelo pesquisador Dr. 
Ian Wilmut, mostraram que as modificações no genoma das células somáticas não são irreversíveis, 
e que o DNA pode ser reprogramado. A clonagem de Dolly foi realizada com um procedimento 
chamado de clonagem reprodutiva, cujas etapas estão descritas abaixo (Figura 15):
Figura 15. Clonagem reprodutiva – dolly.
Figura adaptada do site: <http://www.ghente.org/ temas/clonagem/index_dolly.htm>, retirada em: 17/9/2011.
32
UNIDADE II │ CLONAGEM REPRODUTIVA E TERAPÊUTICA 
1. Células mamárias de uma ovelha da raça Finn Dorset foram as doadoras do núcleo. 
Neste ponto, que está centrada a grande descoberta da ciência, células mamárias são 
células somáticas, ou seja, células diferenciadas, que até o momento eram conhecidas 
como células que não possuem a capacidade de se reprogramar e voltar aos estágios 
iniciais de desenvolvimento. Para que isso aconteça, é necessário que a célula volte 
a ter características de células embrionárias e as informações contidas no DNA 
deveriam ser reprogramadas. Devemos lembrar que por ser uma célula somática 
apenas os genes necessários para a manutenção deste tipo celular estão ativos.
Esta foi a grande diferença de Dolly para os outros animais que foram clonados antes dela, no lugar 
de células somáticas como as mamárias utilizavam-se células embrionárias.
2. Estas células foram cultivadas, cresceram e se dividiram produzindo cópias idênticas 
a elas. Neste processo isolaram-se células que estivessem na fase G0 do ciclo celular, 
e isso foi obtido submetendo as células a uma condição com poucos nutrientes, esse 
estado é chamado de quiêsciencia (estado de latência no qual as células param de 
crescer). Estas células quiescentes foram então as doadoras do núcleo, ou seja, do 
material genético
3. Uma ovelha da raça Scottish Blackface foi a doadora do óvulo, cujo ovócito foi 
isolado e o núcleo retirado. 
4. O ovócito anucleado e o núcleo da célula mamária foram então fundidos por meio 
de uma descarga elétrica. De alguma forma, a qual ainda não sabemos, o ovócito 
após a fecundação reprogramou o material genético da célula mamária, de modo 
a tornar todos os seus genes novamente ativos, resultando no desenvolvimento de 
um embrião de ovelha. As células se diferenciaram até o 6º dia, quando o embrião é 
chamado de blastócito.
5. Uma terceira ovelha da raça Scottish Blackface entra no cenário como uma barriga 
de aluguel, pois no seu útero foi colocado o blastócito. Após a gestação, esta ovelha 
deu origem a uma ovelha da raça Finn Dorset, idêntica a ovelha que doou o material 
genético.
Apesar da importância desta descoberta, a criação de Dolly não foi tao bem sucedida quanto pareceu:
1. Dolly foi o único embrião que se desenvolveu após 277 tentativas de transferência do 
núcleo, nos quais menos de 10% resultaram em embriões e apenas um desenvolveu 
em um animal adulto. A eficiência do procedimento foi muita baixa.
2. A ovelha Dolly não era tão idêntica a ovelha que doou o material genético, como se 
esperava.
3. Dolly possuia as extremidades dos telômeros 20% menores do que dos animais de 
sua idade, resultando no envelhecimento precoce.
33
CLONAGEM REPRODUTIVA E TERAPÊUTICA │ UNIDADE II
4. Dolly sofria de artrite e doença pulmonar que levaram a sua morte aos 6 anos. 
5. A ovelha que doou o material genético tinha seis anos, como foi observado o 
envelhecimento precoce em Dolly. 
A pergunta que ficou: essas enfermidades foram fruto do envelhecimento precoce ou consequência 
do estilo de vida imposto a ela? Qual a verdadeira idade da Dolly ao nascer, teria 6 anos de idade?
Considerado isso, muitas perguntas surgiram sobre a possibilidade de aplicar esta tecnologia em 
seres humanos e em outros animais. O que esta claro hoje em dia é que a clonagem de animais, 
utilizando esta metodologia, na maioria das vezes é uma experiência desastrosa, pois para cada feto 
que se desenvolve, vários outros são gerados com anomalias. Poderia o homem já estar pensando 
na clonagem humana, ele está preparado para lidar com “produtos” da clonagem com anomalias? 
O que fazer? 
Na comunidade científica mundial é um consenso que não deve ser realizada clonagem reprodutiva 
em humanos. A clonagem de Dolly deixou claro que há muitos riscos associados a este procedimento. 
É importante sabermos que a clonagem para fins reprodutivos é distinta da clonagem 
para fins terapêuticos. Muitas pessoas confundem estes conceitos criando polêmicas 
em relação às pesquisas com células-tronco. Uma coisa é o homem almejar fazer 
cópias de si mesmo, outra coisa é usar a clonagem para produzir tecidos com a 
finalidade de salvar vidas.
<http://www.revistapesquisa.fapesp.br/Suplemento_Clonagem.pdf>
<http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0103-40142004000200016&script=sci_
arttext>
Quer clonar um rato, você mesmo? Acesse aqui e veja: <http://learn.genetics.utah.
edu/content/tech/cloning/clickandclone>
34
CAPítulo 2
Clonagem terapêutica e as células- 
tronco
definição e classificação de células-tronco
Antes de vermos o que é a clonagem terapêutica daremos um ressumo à definição e à classificação 
de células-tronco e quais os seus potenciais terapêuticos.
As células-tronco são células indiferenciadas. São responsáveis pela construção e regeneração dos 
tecidos e órgãos de um indivíduo. Para isto, precisam possuir duas propriedades distintas:
1. a habilidade de autorrenovação ;
2. a clonabilidade;
3. a capacidade de originar aos vários tipos celulares que compõem um tecido ou órgão 
ou indivíduo. 
Assim, podemos considerar que uma célula-tronco é uma entidade clonal, que pode proliferar-se 
indefinidamente para gerar, por um lado, cópias de si mesma e, por outro, diferenciar- se em algum(s)tipo(s) celular(es) específico(s), como precursores de células sanguíneas, células musculares ou 
neurônios etc. Estas propriedades podem variar entre os diversos tipos de células-tronco.
Segundo o potencial diferenciador de uma célula-tronco, podemos classifica-las em três tipos 
(Figura 16): 
4. totipotentes;
5. pluripotentes;
6. multipotentes;
7. oligopotente/bipotente;
8. nulipotentes.
35
CLONAGEM REPRODUTIVA E TERAPÊUTICA │ UNIDADE II
Figura 16: Esquema representativo do potencial diferenciador e da capacidade autoreplicante de uma célula-tronco.
Modificado a partir de: <http://biotecnologiapopular.webnode.com.br/células-tronco/>.
1. As células- tronco Totipotentes se encontram no zigoto recém-fecundado (mórula) 
e cada uma delas tem a capacidade originar: as três camadas germinativas (meso, 
endo e ectodermo) do indivíduo, assim também como os tecidos extra-embrionários 
(placenta e cordão umbilical). 
2. Ja as células Pluripotentes são também de origem embrionária, porém têm 
capacidade limitada de gerar apenas as três camadas germinativas, não geram os 
extraembrionários. 
3. As células Multipotentes são as células-tronco adultas, procedentes do indivíduo 
após nascimento e tem o seu potencial restrito ao órgão ao qual pertencem, gerando 
alguns tipos celulares. Podemos dizer que cada órgão do corpo possui seu próprio set 
de células-tronco multipotente e de fato tem sido demostrado que as células-tronco 
adultas podem ser usadas pelo organismo para repor tecidos. O caso mais bem 
conhecido de células-tronco adultas multipotentes são as células hematopoiéticas, 
elas já estão sendo transplantadas para medula óssea com o propósito de estimular 
a produção dos vários tipos de células sanguíneas. Essas células-tronco podem ser 
obtidas em grande quantidade do cordão umbilical, mas são difíceis de isolar e 
purificar.
4. As células Oligopotentes são aquelas capazes de se autoperpetuar e gerar duas 
ou mais linhagens celulares diferenciadas em um tecido específico. As células 
hematopoiéticas são um típico exemplo, já que elas podem originar células da 
linhagem linfoide e mieloide. Também tem sido reportado que células da córnea e 
glóbulo ocular contém este tipo de células-tronco as quais geram colônias únicas de 
células da córnea e células do tecido conjuntivo.
5. As células Unipotentes podem se autorreplicar, porém apenas geram uma 
linhagem específica, como a muscular, e não outra. Nos pulmões, existem os 
pneumocitos do tipo I, como outro exemplo. 
36
UNIDADE II │ CLONAGEM REPRODUTIVA E TERAPÊUTICA 
Segundo a sua origem as células-tronco, são classificadas como: 
a. embrionárias (ESCs); 
b. somáticas (ou adultas MSCs); 
c. Induzidas (ou IPS).
Células-tronco embrionárias (ESC)
Essas células são encontradas no embrião e formam parte dele durante todo o desenvolvimento. 
Como visto acima, são pluripotentes e podem ser identificadas pela prescença de fatores de 
transcrição como Nanog e Oct4, fatores responsáveis de manter o estado indiferenciado e o 
poder autoreplicante. Podem ser isoladas e cultivadas in vitro, mas não podem sofrer modificoes 
genéticas anormais, sendo, portanto, importante mantê-las em crescimento como os suplementos 
necessários. Estas células podem ser conservadas a temperaturas inferiores a -80C e podem ser 
descongeladas repetidas vezes. A cultura in vitro desta células exige a presença de LIF (Cytokine 
leucemia inhibitory fator) , uma citosina que mantem o estado indiferenciado destas células, do 
contrario a células começarão a se diferenciar nas três camadas germinativas do embrião.
Potencial terapêutico
As ESC têm o potencial para se tornar qualquer tipo de célula no corpo, tornando-se uma promissora 
fonte de células para o tratamento de muitas doenças.
Considerações especiais
Sem drogas que suprimam o sistema imunológico, esse sistema em um paciente irá reconhecer 
células transplantadas como estranhas e atacá-las. As implicações éticas e legais que isto leva pode 
atrasar ou, mesmo impedir, futuras pesquisas. 
Considerações éticas 
Quando os cientistas isolam células-tronco embrionárias humanas (hES) no laboratório, eles 
destroem um embrião. 
Células-tronco somáticas
Também chamadas células-tronco adultas ou mesenquimais (MSC) existem naturalmente em todo 
tecido adulto. célulaSão importantes para o crescimento, cura e substituicão de células e tecidos.
Potencial terapêutico
As células- tronco do sangue e medula óssea são rotineiramente utilizadas no tratamento de doenças 
relacionadas com o sangue. No entanto, em circunstâncias naturais, as células-tronco somáticas 
37
CLONAGEM REPRODUTIVA E TERAPÊUTICA │ UNIDADE II
podem tornar-se apenas um subconjunto de tipos de células relacionados. As da medula óssea, por 
exemplo, diferenciam-se essencialmente em células sanguíneas. Esta diferenciação parcial pode ser 
uma vantagem quando você quer produzir células sanguíneas, mas é uma desvantagem se você 
estiver interessado em produzir um tipo de células independentes.
A maioria dos tipos de células- tronco somáticas não está presenteem grandes quantidades e 
abundâncias, são difíceis de isolar e crescer em cultura. Isolamento de alguns tipos de tecido pode 
causar danos consideráveis ao órgão, tal como no coração ou cérebro. As células estaminais podem 
ser transplantadas somáticas do doador ao paciente, mas sem as drogas que suprimem o sistema 
imunológico, o sistema imunológico de um paciente irá reconhecer células transplantadas como 
estranhas e atacá-las.
Considerações especiais
Terapia com células-tronco somáticas não é controversa, no entanto, está sujeita às mesmas 
considerações éticas que se aplicam a todos os procedimentos médicos. 
Considerações éticas
Células tronco induzidas (iPSC, induced 
pluripotente stem cells)
As células-tronco induzidas são células geradas a partir de células somáticas adultas que sofreram 
uma reprogramação genética artificial ou desdiferenciação induzida. A reversão do estado Célula 
Somática para o estado semelhante ao estado de célula-tronco embrionária e forcado pela expressão 
de poucos genes. As primeiras iPSCs produzidas em laboratório foram de origem murino, e um ano 
mais tarde foram as de humanos. Embora seja possível reprogramar uma célula somática para gerar 
uma célula tronco pluripotente, ainda não se sabe se estas celulas reprogramadas irão conter todas 
as características de tais células tronco, hoje todos os estudos realizados com este tipo de células 
apontam a este assunto. Tem sido demostrado que apesar de serem pluripotentes, estas células, 
muitas vezes, não se comportam de maneira idêntica a uma célula tronco embrionária. No entanto 
para isso, as células tronco induzidas são de extrema importância para o estudo de diversos tipos de 
doenças e para a descoberta de possíveis drogas terapêuticas. 
Potencial terapêutico
Células iPS de camundongo podem se transformar em qualquer célula do corpo (ou mesmo um 
individuo completo). Embora seja necessária mais análise, parece ser verdade para as células iPS 
humanas, tornando-se uma promissora fonte de células para o tratamento de muitas doenças,uma 
vez que as células iPS podem ser feitas a partir de células do próprio paciente, não existe o perigo de 
que o sistema imunitário as rejeite.
38
UNIDADE II │ CLONAGEM REPRODUTIVA E TERAPÊUTICA 
Considerações especiais
As células iPS são muito menos custosas do que as células- tronco embrionárias geradas por meio 
de clonagem terapêutica. O principal inconveniente em utilizar esse tipo de células na terapia 
regenerativa é que para produzi-las é necessária a introdução de genes adicionais (exemplo: por meio 
de transfecção viral) dentro da células. Portanto esse processo dever ser controlado cuidadosamente 
e muito bem entendidoantes de esta técnica ser aplicada em humanos, ja que estudos em animais 
têm demonstrado, em algumas ocasiões, o que esses vectores virais podem causar. Atualmente, 
novas pesquisas estão tentando utilizar iPSCs não induzidaos por vírus, mas, de toda forma, o fato 
de conseguir reprogramar uma célula somática no nosso corpo para programá-la novamente em um 
outro tipo de célula é um passo enorme. Se for possível usar essas células na terapia regenerativa 
evitaremos uma possível rejeição do transplante,pois as células seriam do próprio paciente.
Considerações éticas
Terapia com células iPS está sujeita às mesmas considerações éticas que se aplicam a todos os 
procedimentos médicos.
A clonagem terapêutica tem como objetivo gerar células-tronco embrionárias in vitro com a 
finalidade de produzir diferentes tecidos. Este procedimento é semelhante ao utilizado para clonar 
a ovelha Dolly, consiste na transferência do núcleo de uma célula somática (célula diferenciada),por 
meio de injeção, para um ovócito sem núcleo. A diferencça está em logo que iniciada a diferenciação 
celular( 4 a 5 dias) as células-tronco contidas no embrião são removidas e mantidas em meio à 
cultura para posterior utilização com fins de pesquisa e terapêutica. Estas células são geneticamente 
idênticas à célula que doou o DNA, ou seja, a célula da qual o núcleo foi retirado (Figura 17).
Estas células-tronco embrionárias poderiam ser introduzidas no homem para reparar danos causados, 
por exemplo, por doenças neurodegenerativas. Pensando mais além, elas poderiam ser induzidas a 
diferenciar-se formando tecidos e órgãos que poderiam ser usados em transplantes. Além disso, estas 
células poderiam ser aplicadas também no combaté a doenças cardiovasculares, diabetes do tipo 1, 
acidentes vasculares cerebrais, doenças hematológicas e em traumas na medula espinhal.
Figura 17. Clonagem terapêutica para produção de células-tronco embrionárias.
Figura adaptada do site: <http://www.scielo.br/scielo.php?pid=s0103-40142004000200016&script=sci_arttext>, 
retirada em: 17/09/2011.
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CLONAGEM REPRODUTIVA E TERAPÊUTICA │ UNIDADE II
O grande potencial deste tipo de terapia pode ser melhor compreendido se as células-tronco e os 
tecidos originados dela forem geneticamente idênticos ao paciente que recebê-los, pois desta forma, 
evitaria a rejeição. Assim, a busca desesperada de pacientes com leucemia por medula óssea poderia 
ser resolvida com a clonagem terapêutica, os médicos criariam medula óssea usando o núcleo de 
células da pele do próprio paciente.
Várias questões faz a clonagem terapêutica ser um tema muito polêmico, como:
1. Após a retirada das células o embrião seria descartado. Estaria o homem 
eliminando uma vida para salvar outra?
Algumas pessoas acreditam que uma pessoa é formada no momento 
que o óvulo é fertilizado, então elas consideram a clonagem terapêutica 
equivalente a matar uma criança deliberadamente para beneficiar outra 
pessoa.
2. De outro lado, fica a questão, os embriões, independente de serem usados 
para a retirada das células-tronco, quando não são introduzidos em um 
útero, são eliminados após um período nas clínicas de fertilização. Não 
seria mais apreciável utilizá-los para salvar vidas?
3. Podemos considerar violação da vida humana a retirada das células-
tronco destes embriões que ainda são aglomerados de células?
4. Há a preocupação com o fato de que, para este tipo de pesquisa, será 
necessária grande quantidade de óvulos humanos. É aceitável pagar 
mulheres para coletar seus óvulos? 
Um país que proíbe pesquisas com células-tronco embrionárias está fadado ao 
atraso científico e até ao progresso humano. 
<http://www.lance-ufrj.org/viacutedeos-lance.httm>
40
unidAdE iii
tErAPiA gêniCA 
E orgAniSMoS 
trAnSgêniCoS
CAPítulo 1
terapia gênica
A terapia gênica envolve a inserção de uma cópia de um gene terapêutico (normal) no genoma de 
uma pessoa para reparar o gene defeituoso. Várias doenças são causadas por genes defeituosos 
(com mutação), como por exemplo, fibrose cística, hemofilia, e susceptibilidade a alguns cânceres. 
Esta terapia tem como objetivo substituir os genes causadores destas enfermidades por um gene 
normal, sem mutação (Figura 18). 
A terapia gênica é uma forma experimental de tratamento que ainda está na sua infância, mas tem 
o potencial de revolucionar o tratamento de todas as doenças genéticas.
A maioria dos ensaios clínicos de terapia gênica ocorre nos Estados Unidos e na Europa, tendo 
principalmente como foco diversos tipos de cânceres. 
Os desafios para desenvolver a terapia gênica são muitos, entre eles estão:
1. conhecer bem o gene defeituoso, causador da enfermidade; 
2. identificar as células específicas para o tratamento; 
3. ter um mecanismo eficiente de entrega do gene.
41
TERAPIA GÊNICA E ORGANISMOS TRANSGÊNICOS │ UNIDADE III
Figura 18. processo básico da terapia Gênica.
Extraído a partir de: <http://revistaescola.abril.com.br/ensino-medio/plano-de-aula-biologia-terapia- 
genetica-relacao-genes-doencas-733518.shtml>.
O ponto mais desafiador da terapia gênica é o mecanismo de entrega do gene do qual depende de 
vetores eficientes. O mais promissor dos vetores é o uso de vírus inofensivos que tem a maioria dos 
seus genes retirados. Estes vírus podem ser usados para transportar o gene até as células e expressá-lo 
durante seu processo de divisão, ou promover a inserção do gene na posição correta dentro do genoma 
da célula. Uma vez dentro da célula, os genes são “ligados” restituindo a função do gene defeituoso.
A terapia gênica tem como alvo apenas células somáticas, pois estas não transmitem a informação 
genética para seus descendentes (filhos). Qualquer impacto da terapia gênica sobre o corpo não 
deve ser transmitido para os filhos, ela deve tratar o indivíduo sem alterar a herança genética para 
futuras gerações.
Outra técnica de terapia gênica envolve o uso de células-tronco que são manipuladas em laboratório 
para receber o gene exógeno. Este gene ao ser expresso poderia, por exemplo, tornar estas células 
mais resistentes à quimioterapia. Logo, estas células poderiam ser transplantadas em um paciente, 
para auxiliar no tratamento quimioterápico.
A terapia gênica tem alguns riscos, que conduzem às polêmicas quanto ao uso deste tipo de 
tratamento:
1. o sistema imunológico pode reagir ao gene exógeno;
2. o gene exógeno pode ser introduzido em lugar errado;
3. outros genes podem ser entregues acidentalmente para a célula;
4. o vírus pode infectar outras células além da célula alvo.
42
UNIDADE III │ TERAPIA GÊNICA E ORGANISMOS TRANSGÊNICOS 
Do mesmo modo que a clonagem terapêutica, a terapia gênica ainda necessita de muita pesquisa 
para mostrar o seu potencial. Ela se encontra no centro de várias discussões éticas que envolvem 
a manipulação de células, a transgenia, questões quanto à acessibilidade desta terapia para a 
população, entre outras.
<http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S1413-81232002000100010&script=sci_
arttext>
<http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio12/terapia.pdf>
43
CAPítulo 2
organismos transgênicos
Desde seus primórdios, o homem vem selecionado plantas e animais domesticados por meio da 
criação seletiva dos indivíduos, a fim de transferir os caracteres desejados. A principal limitação 
deste processo encontra-se na incompatibilidade sexual observada quando os organismos são 
geneticamente muito divergentes, o que impede a transferência de espécies cruzadas. A engenharia 
genética pode quebrar essa barreira, permitindo a incorporação de genes de outras espécies que de 
outra forma seria impossível com os métodos tradicionais de reprodução. 
Os organismos Transgenicos são espécies de plantas, animais, fungos ou bactérias geneticamente 
modificados