RESUMO CITOLOGIA Cavendish.pdf

Prévia do material em texto

Universidade de Brasília 
 
 
 
 
CITOLOGIA 
 
Organizado por Rafael Cavendish 
 
 
 
 
O material 
Este material é um aglomerado de imagens e parágrafos transcritos de diversas fontes, com intenção de ser um auxílio no estudo da matéria de citologia. As informações foram extraídas do livro Biologia Molecular da Célula (Alberts, 5a Ed), slides dos professores Tatsuya Nagata e Fernando Lucas Melo, a apostila de biologia celular do CEDERJ e diversos websites, citados no fim do documento. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
COMPOSIÇÃO QUIMICA DA CELULA 
Substâncias Orgânicas 
Proteínas: presentes em todas as estruturas celulares. São formadas por aminoácidos e sua presença é indispensável para o metabolismo do organismo. As proteínas formam as enzimas. Correspondem a 17% da composição química da célula animal. 
Vitaminas: podem ser hidrossolúveis (solúveis em água) ou lipossolúveis (solúveis em lipídeos). São necessárias em pequenas quantidades pelo organismo, sua falta pode causar doenças. As vitaminas são adquiridas por meio de uma alimentação variada. 
 
Carboidratos ou Glicídios ou Açúcares: são fundamentais, pois dão energia às células e ao organismo. São de três tipos: monossacarídeos, dissacarídeos e polissacarídeos. Alguns têm função estrutural, como celulose e quitina; e de reserva, como o amido e glicogênio. Correspondem a 6% da composição química da célula animal. 
Lipídios: insolúveis em água, atuam como reserva de energia, isolante térmico etc. São classificados em glicerídeos, ceras, esteroides, fosfolipídios e carotenoides. Compõem estruturas celulares. Correspondem a 11% da composição química da célula animal. 
Substâncias inorgânicas 
Sais minerais: formados por íons. Algumas de suas funções são: formar o esqueleto, participar da coagulação sanguínea, transmissão de impulsos nervosos. Sua falta pode afetar o metabolismo e levar à morte. Correspondem a 4% da composição química da célula animal. 
Água: substância encontrada em maior quantidade nos seres vivos. Pode dissolver diversas substâncias, por isso é classificada como solvente universal. No corpo humano representa cerca de 70% do peso corporal. Participa de inúmeras reações químicas no organismo. Correspondem a 62% da composição química da célula animal. 
 
Organelas de uma célula animal e suas funções: 
Nucléolo -­‐ produção dos componentes ribossômicos Núcleo -­‐ conservar e transmitir a informação genética na reprodução das células e regular as funções celulares. Ribossomos -­‐ produção de proteínas 
Vesículas -­‐ transporte de substância e união com a membrana para eliminar conteúdos para fora da célula. Retículo endoplasmático rugoso -­‐ participa da síntese e transporte de proteínas. Complexo de Golgi -­‐ faz a secreção celular. Citoesqueleto -­‐ participam do transporte de substâncias e dão forma a célula. Retículo endoplasmático Liso -­‐ participa do processo de transporte celular, além de participar da síntese de lipídios. Mitocôndrias -­‐ são responsáveis pela respiração das células. Vacúolo -­‐ atuam no processo de digestão intracelular. São pequenos na célula animal, mas muito grandes em células vegetais. Citoplasma -­‐ nele está um fluído chamado citosol, O citoplasma tem a função de albergar as organelas e favorecer seus movimentos. Lisossomos -­‐ participam da digestão de substâncias orgânicas. Centríolos -­‐ estão ligados à organização do citoesqueleto e aos movimentos de flagelos e cilios. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FRACIONAMENTO CELULAR 
Para facilitar o estudo dos componentes celulares, sua composição e função, é necessário separá-­‐los. 
As células podem ser rompidas de varias maneiras: podem ser submetidas a um choque osmótico, vibração ultrassônica, forçadas a atravessar um pequeno orifício ou maceradas. Esses procedimentos rompem varias das membranas da célula em fragmentos que imediatamente se unem para formar varias vesículas fechadas. 
Se aplicados com cuidado, entretanto, os procedimentos de ruptura deixam organelas como o núcleo, mitocôndria, Golgi, lisossomos e peroxissomos intactas. A suspensão de células, nesse caso, é reduzida a um caldo grosso (homogenato ou extrato) que contém uma variedade de organelas envolvidas por membranas, cada qual com tamanho, carga e densidade diferentes. 
Uma vez que o meio de homogeneização tenha sido escolhido com cuidado (por tentativa e erro para cada organela), os vários componentes – incluindo as vesículas derivadas do reticulo endoplasmático, chamadas microssomos – retêm a maioria de suas propriedades bioquímicas originais. 
 
Centrifugação 
 A centrifugação permite a separação dos componentes baseado em seus respectivos tamanhos e densidades. Numa velocidade constante, os componentes maiores tendem a sedimentar, e os menores tendem a manter-­‐se no sobrenadante. Devem também ser considerados são a intensidade da velocidade e o tempo de centrifugação. Ajustando estes fatores, é possível selecionar isolar a maioria dos componentes por meio de sucessivas centrifugações, partindo de velocidades e tempos baixos para velocidades e tempos altos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Centrifugação zonal ou por velocidade de sedimentação 
A centrifugação é a primeira etapa na maioria dos fracionamentos, mas ela separa somente componentes que diferem muito em tamanho. Um grau mais refinado de separação pode ser alcançado colocando-­‐se o homogenato no topo de uma solução salina diluída dentro de um tubo de centrífuga, de maneira que forme uma fina camada. 
Quando centrifugada, os vários componentes da mistura movem-­‐se como uma serie de bandas distintas pela solução salina, cada uma a uma velocidade diferente. 
Para que o procedimento funcione efetivamente, as bandas devem ser protegidas de ser misturadas por convecção, o que ocorreria normalmente quando uma solução densa fosse colocada no topo de uma solução menos densa. Para que tal proteção ocorra, o tubo é preenchido com um gradiente de sacarose preparado por um misturador especial. 
O gradiente de densidade resultante (com a parte mais densa no fundo do tubo) mantém cada região da solução salina mais densa do que qualquer solução acima dela, evitando que uma mistura distorça a separação por convecção. 
 
Centrifugação isopícnica ou sedimentação por equilíbrio 
 
A ultracentrífuga também é utilizada para separar componentes celulares de acordo com a sua densidade de flutuação, independentemente do seu tamanho ou forma. 
Nesse caso, a amostra é usualmente sedimentada por um gradiente de densidade que contém uma alta concentração de sal ou de cloreto de césio (CsCl). 
Cada componente celular começa a descer pelo gradiente, mas eventualmente alcança uma posição em que adensidade da solução é igual à sua própria densidade. 
Nesse ponto, o componente flutua e não pode mais se mover. Uma serie de bandas distintas é então produzida no tubo da centrifuga, com as bandas mais próximas do fundo contendo componentes de maior densidade de sedimentação. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cromatografia 
A cromatografia é uma técnica quantitativa que tem por finalidade geral a identificação de substâncias e a separação-­‐purificação de misturas. Usando propriedades como solubilidade, tamanho e massa, envolve uma série de processos de separação de misturas. A cromatografia acontece pela passagem de uma mistura através de duas fases: uma estacionária (fixa) e outra móvel. A grande variabilidade de combinações entre a fase móvel e estacionária faz com que a cromatografia tenha uma série de técnicas diferenciadas. 
 
 Tipos de cromatografia: 
 -­‐ Partição 
 . Papel 
 . Camada fina 
 -­‐ Coluna 
 . Troca iônica 
 . Filtração em gel 
 . Afinidade 
 -­‐ HPLC (High Performance Liquid Cromatography) 
 
Cromatografia de papel 
 Envolve a separação de um soluto entre um solvente ligado firmemente a uma fase estacionaria polar e um segmento solvente (fase móvel), que se move através da fase estacionaria. Utiliza-­‐se papel normal ou papel de filtro como suporte da fase estacionaria. 
 A mistura é aplicada no papel e mergulhada na mistura das fases líquida e estacionária. A tira de papel de suporte é colocada em um cuba contendo o eluente. Esta fase móvel (solvente) sobe por capilaridade e arrasta a substância pela qual tem mais afinidade, separando-­‐a das substâncias com maior afinidade pela fase estacionária. Como a maioria das substâncias separadas são incolores, utiliza-­‐se um revelador. As manchas podem ser reveladas por meio de luz UV, vapores de iodo, soluções de cloreto férrico e tiocianoferrato de potássio, fluorescências, radioatividade, etc. 
 
 
 
Cromatografia de camada fina 
 A cromatografia planar, também chamada de camada fina, é realizada sobre uma placa de vidro, plástico ou folha de alumínio, revestida com uma fina camada de material adsorvente, geralmente sílica em gel, oxido de alumínio ou celulose. Esta camada de adsorvente é a fase estacionaria. 
 Depois que a amostra é aplicada sobre a placa, um solvente ou mistura de solventes (fase móvel) é permeado pela placa por capilaridade. Os diferentes componentes da mistura percorrem a placa de cromatografia de maneiras diferentes, sendo possível a separação. 
 A cromatografia de camada fina pode ser usada para monitorar o progresso de reações químicas, identificar os compostos presentes em uma mistura ou determinar a pureza de uma substancia. Como exemplos específicos podem ser citados: análise de ceramidas e ácidos graxos , a detecção de pesticidas ou inseticidas em alimentos e água ou identificação de princípios ativos em plantas medicinais ou medicamentos.
Cromatografia em colunas 
 Nesse tipo de cromatografia, a amostra – uma solução contendo uma mistura de diferentes moléculas – é aplicada no topo de uma coluna cilíndrica de vidro ou plástico cheia de matriz solida permeável, como celulose. 
 Uma quantidade grande de solvente é então bombeada lentamente através da coluna e coletada em tubos separados à medida que emerge na parte inferior da coluna. Como vários componentes da amostra passam pela coluna em diferentes velocidades, eles são fracionados em diferentes tubos. 
 
 
 
 
 
 
 
Cromatografia de troca iônica 
 Na cromatografia de troca iônica, a matriz insolúvel carrega cargas iônicas que retardam o movimento das moléculas de carga oposta. As matrizes utilizadas para separar proteínas incluem dietilaminoetilcelulose (DEAE-­‐celulose), que é carregada positivamente, e carboximetilcelulose (CM-­‐celulose) e fosfocelulose, que são carregadas negativamente. Matrizes análogas com base em agarose ou outros polímeros também são utilizadas com frequência. 
 A força entre a associação entre as moléculas dissolvidas e a matriz para troca iônica depende tanto da força iônica quanto do pH da solução que esta passando pela coluna, que pode, portanto, ser variada sistematicamente para alcançar uma separação efetiva. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cromatografia de filtração em gel 
Na cromatografia de filtração em gel, a matriz é inerte, mas porosa. Moléculas que são suficientemente pequenas para penetrar a matriz retardam e viajam mais lentamente através da coluna do que moléculas que maiores que não podem penetrar. 
 
 
 
Cromatografia de afinidade 
 Esse tipo de cromatografia utiliza uma matriz insolúvel covalentemente ligada a um ligante específico, como um molécula de anticorpo ou um substrato de uma enzima, que ira ligar uma proteína especifica. 
 Moléculas de enzimas que se ligam a substratos imobilizados em tais colunas podem ser eluidas com uma solução concentrada da forma livre da molécula do substrato, enquanto moléculas que se ligam a anticorpos imobilizados podem ser eluidas dissociando-­‐se o complexo antígeno-­‐anticorpo com soluções concentradas de sais ou soluções com Ph alto ou baixo. 
 Altos graus de purificação são frequentemente alcançados em um único passo por uma coluna de afinidade. 
 
 
 
HPLC – High Performance Liquid Cromatography 
É um tipo de cromatografia líquida que emprega pequenas colunas, recheadas de materiais especialmente preparados e uma fase móvel que é eluída sobre altas pressões. Ela tem a capacidade de realizar separações e análises quantitativas de uma grande quantidade de compostos presentes em vários tipos de amostras, em escala de tempo de poucos minutos, com alta resolução, eficiência e sensibilidade. 
Resumo do procedimento: 
• A amostra é dissolvida em um solvente e introduzida na coluna cromatográfica preenchida com a fase estacionária (FE) 
• Um solvente (FM) é bombeado com vazão constante e desloca os componentes da mistura através da coluna. Esses se distribuem entre as duas fases de acordo com suas afinidades 
• As substâncias com maior afinidade com a FE movem-­‐se mais lentamente. Já as substâncias com pouca afinidade com a FE movem-­‐se mais rapidamente. 
• Ao sair da coluna, os componentes passam por um detector que emite um sinal elétrico o qual é registrado, constituindo um cromatograma. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Eletroforese em gel 
As proteínas normalmente possuem carga positiva ou negativa, dependendo da mistura de aminoácidos carregados que elas contêm. Um campo elétrico aplicado a uma solução que contem uma molécula proteica faz com que a proteína migre a uma velocidade que depende da sua carga liquida, do seu tamanho e sua forma. 
A aplicação mais popular dessa propriedade é a eletroforese em gel de poliacrilamida-­‐ SDS (SDS-­‐PAGE). Ela utiliza um gel de poliacrilamida de ligações altamentecruzadas como uma matriz inerte, pela qual as proteínas migram. O gel é preparado pela polimerização de monômeros; o tamanho do poro do gel pode ser ajustado de maneira que seja suficientemente pequeno para retardar a migração das moléculas proteicas de interesse. 
As próprias proteínas não estão em uma simples solução aquosa, mas em uma solução que inclui um detergente fortemente carregado negativamente, o dodecil sulfato de sódio (SDS). Como esse detergente se liga a regiões hidrofóbicas das moléculas proteicas, causando o seu desdobramento em cadeias polipeptídicas estendidas, as moléculas proteicas individuais são liberadas de suas associações com outras proteínas ou moléculas lipídicas tornando-­‐se completamente solúveis na solução detergente. Além disso, um agente redutor como o beta-­‐ mercaptoetanol normalmente é adicionado para quebrar quaisquer ligações S-­‐S nas proteínas, de forma que todos os polipeptídeos constituintes, presentes em múltiplas subunidades, possam ser analisados separadamente. 
Cada molécula de proteínas se liga a um grande numero de moléculas do detergente carregado negativamente, que supera a carga intrínseca da proteína e faz com que ela migre em direção ao eletrodo positivo, quando uma voltagem é aplicada. Proteínas do mesmo tamanho tendem a migrar pelo gel com velocidades similares, pois sua estrutura nativa está completamente desdobrada pelo SDS e se ligam à mesma quantidade de SDS, tendo, portanto, a mesma quantidade de cargas negativas. Proteínas maiores, com mais carga, são submetidas a forças elétricas maiores e também a um retardamento maior. 
Livres em solução, os dois efeitos seriam anulados, mas nas malhas do gel de poliacrilamida, que age como peneira molecular, as proteínas maiores são retardadas muito mais do que as menores. Como resultado, uma mistura complexa de proteínas é fracionada em uma serie de discretas bandas de proteínas arranjadas de acordo com sua massa molecular. 
 
 
 
 
 
Espectrometria de massa 
A espectrometria de massas (mass spectrometry) é uma poderosa ferramenta física que caracteriza as moléculas pela medida da relação massa/carga de seus íons. Ela foi usada, inicialmente, na determinação de massas atômicas e, vem sendo empregada na busca de informações sobre a estrutura de compostos orgânicos, na análise de misturas orgânicas complexas, na análise elementar e na determinação da composição isotópica dos elementos. A espectrometria de massas acoplada (MS/MS) é uma técnica analítica poderosa, usada para identificar compostos desconhecidos, quantificar compostos conhecidos e auxiliar na elucidação estrutural de moléculas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MICROSCOPIA DE LUZ 
Microscópio óptico comum 
Limite de resolução – limite de separação pelo qual dois objetos ainda podem ser vistos como distintos. Depende do comprimento de onda da luz e da abertura numérica do sistema de lentes utilizado. 
 
 
Abertura numérica – é uma medida da largura da abertura do microscópio, graduada de acordo com sua distância a partir do objeto que pode ser visualizado. 
 
 
⇨ Nas melhores condições, com luz violeta (comprimento de onda = 0,4 μm) e uma abertura numérica de 1,4, o microscópio óptico pode alcançar, teoricamente, um limite de resolução logo abaixo de 0,2 μm. 
 
Caminho da luz no microscópio óptico 
 
 
 
Preparação de amostras 
 
1) Fixação – estabilização do material preservando a sua estrutura. A fixação torna as 
células permeáveis aos corantes e produz uma ligação cruzada entre as suas macromoléculas, de maneira que sejam estabilizadas e presas à sua posição. Em seguida, é feito tratamento com aldeídos reativos, em particular formaldeído e gluteraldeído, que formam ligações covalentes com os grupos de aminoácidos livres de proteínas, produzindo ligações cruzadas comas moléculas de proteínas adjacentes. (podem ser usados ainda calor, solventes orgânicos e ácidos) 2) Desidratação – substituição da água por soluções miscíveis no meio de inclusão 
(álcool ou acetona). 3) Inclusão – os tecidos precisam ser embebidos em um meio de suporte antes de ser seccionado (ceras de resinas plásticas, sendo parafina a mais usada). A resina é endurecida por resfriamento ou polimerização, formando um bloco pronto para ser seccionado pelo micrótomo. 4) Microtomia – aparelho que corta as amostras em fatias muito finas. As secções, geralmente com 1 a 10 μm de espessura são colocadas na superfície de uma lamina de vidro. 5) Coloração – é necessária para a contrastação da amostra, que permite a obtenção 
de mais detalhes na visualização. Os corantes utilizados na microscopia de luz são geralmente ácidos (Eosina, Orange G, Fucsina) ou básicos (azul de toluidina, azul de metileno, hematoxilina). 6) Análise – amostra pronta. 
Microscopia de fluorescência 
O microscópio de fluorescência é semelhante a um microscópio óptico comum, exceto que a luz utilizada para iluminação (originada de uma fonte muito potente) passa através de dois conjuntos de filtros: um para filtrar a luz antes de ela atingir a amostra, e outro para filtrar a luz que já passou pela amostra. 
O primeiro filtro é selecionado de forma que permita apenas a passagem de comprimentos de onda que excitem um determinado corante fluorescente. Já o segundo filtro bloqueia a passagem de sinais fluorescentes indesejáveis, permitindo somente a passagem dos comprimentos de onda específicos de quando o corante floresce. 
 
 
 
A imagem observada é resultado da radiação eletromagnética emitida pelas moléculas que absorveram a excitação primária e reemitiram uma luz com maior comprimento de onda. 
O principal uso do microscópio de fluorescência é na localização de substancias especificas no interior da célula com o uso de substancias fluorescentes com certa afinidade a um dos componentes celulares ou anticorpos conjugados a substancias fluorescentes para a detecção de proteínas especificas. A microscopia de fluorescência permite a utilização de células vivas ou mortas. 
Principais corantes 
. Fluoresceína – emite uma fluorescência verde intensa quando excitado com luz azul. 
. Rodamina – emite fluorescência vermelha quando excitada com luz amarelo-­‐esverdeada. 
 
Proteínas fluorescentes – proteínas que emitem fluorescência na faixa do laranja e vermelho, extraídas de animais marinhos. 
 
 
 Microscopia de contraste de fase 
O microscópio de contraste de fase permite a visualização com detalhes de amostras vivas e não-­‐coradas. É possível observar os processos celulares a medida que acontecem. 
Quando a luz atravessa uma célula viça, a fase da onda de luz é alterada de acordo com o índice de refração da célula: a luz que passa através de uma parte relativamente espessa ou densa da célula, como o núcleo, é retardada. Sua fase, consequentemente, é deslocada em relaçãoà luz que passou por uma região mais delgada do citoplasma. 
O microscópio de contraste de fase explora os efeitos de interferência produzidos quando esses dois conjuntos de ondas se recombinam, criando uma imagem estrutural da célula. 
 
 
 
 
 
 
Microscopia de campo escuro 
Na microscopia de campo escuro, o espécime é iluminado de tal forma que somente a luz desviada por ele pode ser vista: a luz do fundo não passa. A amostra parece luminescente contra um fundo escuro. 
Entre a fonte de luz e a lente condensadora é encontrado um disco opaco. Este disco não permite que toda a luz emitida seja passada para a lente condensadora: apenas uma pequena fração da luz passa. É ajustado de tal forma que somente a luz que atingiu a amostra chegue ao olho do observador. O restante da luz é desviado pelas laterais. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Microscopia confocal 
Na microscopia confocal, ocorre a focalização de um plano especifico de cada vez, ao contrario dos outros tipos de microscópio. Assim, é possível montar uma imagem tridimensional ou bidimensional com maior quantidade de detalhes. A focalização acontece por meio do intermédio de um feixe de laser, que é dividido por um divisor de feixes. Os feixes provenientes da divisão alcançam um espelho dicroico, que os refletem para diferentes pontos da amostra. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CULTURA DE CÉLULAS 
 Embora as organelas e as moléculas grandes em uma célula podem ser visualizadas com microscópios, entender como esses componentes funcionam requer uma analise bioquímica detalhada. A maioria dos procedimentos bioquímicos requer que grandes quantidades de células sejam rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes. 
 Para obter o máximo de informações possíveis sobre células em um tecido, deve-­‐se dissociar as células do tecido e separa-­‐las de acordo com o tipo. Essas manipulações resultam em uma população relativamente homogênea, que será proliferada em uma cultura de células. 
 A cultura de células é importante pois pode-­‐se fazer um estudo aprofundado de fatores como expressão gênica, câncer e fatores de crescimento. Além disso, as culturas permitem fazer a manutenção de patógenos intracelulares e permitem estudo e desenvolvimento de células-­‐tronco. 
 Os passos para se produzir uma cultura são o isolamento de tecidos, esterilização da superfície, dissociação das células (usando centrifugação) e, finalmente, colocá-­‐las em um meio de cultura. 
 
 
 
 
 
Cultura de células primária 
 Culturas de células primarias são culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo. Elas podem ser feitas com ou sem uma etapa inicial de fracionamento para separar diferentes tipos de células. As células em culturas primarias têm expectativa de vida muito baixa e, por isso, devem ter uso imediato. Uma vantagem disso, porém, é que não é preciso esforço para mantê-­‐las vivas. 
 
Linhagem de células contínua 
 Ao contrario da cultura de células primaria, a linhagem contínua visa a preservação das células, que são cuidadosamente inseridas num meio vital. A linhagem continua permite a execução de experimentos homogêneos e repetitivos. 
 
Meios definidos e meios complexos 
 O meio em que se insere a cultura de células pode ser definido ou complexo. 
Os meios definidos possuem composição química não só conhecida, mas também precisa. Nestes meios, é praticamente certo que pode-­‐se obter uma linhagem contínua. 
Os meios complexos tendem à desordem. São quimicamente indefinidos, usados principalmente para o cultivo de rotina em laboratórios. Não há muita preocupação com a inserção de componentes de modo preciso, tanto que são adicionados produtos naturais, como extrato de leveduras, carnes e plantas. 
 
Fatores físicos necessários para o crescimento 
-­‐ Temperatura 
 Existem as temperaturas mínimas, ótimas e máximas para o crescimento das culturas. A temperatura ideal (ótima) para o crescimento da maioria das células é de 37 oC. Isso acontece porque essa temperatura é aquela em que as enzimas celulares possuem máximo rendimento. 
 
 
-­‐ pH 
 Assim como a temperatura, o pH possui faixas mínimas, ótimas e máximas. Em geral, a faixa ótima é a média entre a máxima e a mínima. Se o pH for maior que a faixa máxima, ou menor que a faixa mínima, as enzimas perdem suas funções e as células morrem. Independentemente do pH externo, as células costumam manter o pH neutro em seu interior. O pH pode mudar dependendo do crescimento da cultura, ou se esta for contaminada. 
 
-­‐ Atmosfera gasosa 
 As células precisam de diferentes concentrações de O2, CO2, N2 e CH4 para sobreviver em ambiente natural. Dependendo da adaptação e resposta à presença de oxigênio, as células podem ser classificadas em aeróbios, microaerófilos, facultativos e anaeróbios. 
 
 
-­‐ Pressão osmótica 
 A solução deve ser isotônica dentro e fora da célula, para que a pressão osmótica se estabilize. Caso a solução que envolve a célula seja hipertônica (muito concentrada), ocorre saída de água da célula, o que inibe seu crescimento. Caso contrario, há entrada de água em excesso, o que pode fazer com que a membrana plasmática se rompa, causando a morte da célula. 
 
 
Curva de crescimento 
 
 
-­‐ Fase lag: é a fase latente, em que não ocorre replicação imediata. Ocorre síntese de DNA expressão gênica e a produção das enzimas necessárias para a futura divisão. 
-­‐ Fase log: é a fase em que se inicia a divisão celular, causando um crescimento exponencial nos indivíduos da cultura, até que o tempo de geração atinja um valor constante. É o período de maior atividade metabólica das células. 
-­‐ Fase estacionária: é o fim do crescimento exponencial. A velocidade de crescimento diminui tanto que a população torna-­‐se estável, ou seja, a taxa de morte celular é a mesma taxa de surgimento de novas células. A atividade metabólica decresce consideravelmente devido ao término de nutrientes, ao acúmulo de produtos de degradação e à alterações no pH do meio. 
-­‐ Declínio: a taxa de morte celular aumenta bastante, sendo ainda maior que a taxa de surgimento de novas células. Essa fase decorre até que a população desapareça totalmente. Caracteriza o fim da cultura. 
 
 
 
 
 
TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS 
Proteínas 
 São polímeros de aminoácidos que podem obter diferentes estruturas dependendo de seu tamanho e ligações entre as moléculas. Essas podem ser primárias, secundárias, terciárias ou quaternárias, sendo que cada nível de organização maior é formado por um conjunto de níveis de organização menores. 
 
 
 
Anticorpos 
 Anticorpos ou imunoglobulinas são glicoproteínas sintetizadas e excretadas por células plasmáticas derivadas dos linfócitos B, os plasmócitos, presentes no plasma, tecidos e secreções que atacam proteínas estranhasao corpo, chamadas de antígenos, realizando assim a defesa do organismo (imunidade humoral). Depois que o sistema imunológico entra em contato com um antígeno, são produzidos anticorpos específicos contra ele. 
 Há cinco classes de imunoglobulina com função de anticorpo: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Os diferentes tipos se diferenciam pelas suas propriedades biológicas, localizações funcionais e habilidade para lidar com diferentes antígenos. 
 -­‐ IgM – constitui 10% dos anticorpos do plasma sanguíneo, existindo na maior parte das vezes, sob a forma de pentâmero (combinação de cinco moléculas). Este imunoglobulina é a predominante no início das respostas imunitárias. 
 
 
 -­‐ IgG – é a imunoglobulina mais abundante na corrente sanguínea, constituindo cerca de 75% das imunoglobulinas presentes no plasma. Serve como modelo para as outras classes. Formada por duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas, também idênticas, ligadas por pontes de dissulfeto e forças não-­‐covalentes. É a responsável pela resposta imunitária a longo prazo (resposta secundária). 
 
 
 -­‐ IgA – é encontrado em áreas de mucosas, como os intestinos, trato respiratório e trato urogenital, prevenindo sua colonização por patógenos. É passado para o neonato via aleitamento. 
 
 -­‐ IgE – geralmente está na forma de monômero, possui grande afinidade para receptores localizados na membrana de mastócitos e basófilos. Após estas moléculas de imunoglobulinas serem secretadas pelos plasmócitos, elas irão se prender àqueles receptores, praticamente desaparecendo no plasma. A reação alérgica é mediada pela atividade desta imunoglobulina e dos alérgenos que estimulam sua produção. 
 
 -­‐ IgD – sua função principal ainda não foi esclarecida. Está presente no plasma sanguíneo em concentrações muito baixas, representando apenas 0,2% do total de imunoglobulinas. Esta molécula, juntamente com a IgM, está presente na superfície dos linfócitos B participando da diferenciação desta célula. 
 
ELISA 
 O ELISA (Enzyme-­‐linked immuno sorbent assay) é um dos métodos imunológicos mais utilizados para quantificar a concentração de antígenos e anticorpos, por apresentarem grande sensibilidade e especificidade. 
Nesse método, uma enzima, que reage com um substrato incolor para produzir um produto colorido, é covalentemente ligada a um anticorpo específico que reconhece um antígeno alvo. Se o antígeno estiver presente, o complexo anticorpo-­‐enzima irá ligar-­‐se a ele e a enzima catalisará a reação. Então, a presença de produto colorido indica a presença de antígeno. Trata-­‐se de um método eficiente, pois permite detectar quantidades de proteína da ordem de nanogramas (10-­‐9 g). 
O método ELISA pode ser direto, indireto ou por sanduíche (DAS-­‐ELISA): 
 
 
 
Imunofluorescência 
 Imunofluorescência é uma técnica que permite a visualização de antígenos nos tecidos ou em suspensões celulares utilizando corantes fluorescentes, que absorvem luz e a emitem num determinado comprimento de onda (c. d. o.). Quando o corante está ligado ou conjugado com um anticorpo, os locais de reação entre o antígeno e o anticorpo conjugado podem facilmente ser visualizados. 
Os fluorocromos mais utilizados em técnicas de imunofluorescência são a fluoresceína isocianetada (FITC) e rodamina. Os fluoróforos, depois de excitados por um comprimento de onda específico (espectro de absorção), emitem fluorescência (fótons de luz) a um comprimento de onda superior (espectro de emissão). 
 
 
 
 
Immunogold Labelling 
 Immunogold Labelling é uma técnica de coloração utilizada em microscopia eletrônica. Partículas de ouro coloidal são geralmente anexadas a anticorpos secundários, os quais são previamente anexados a anticorpos primários ligados a um certo antígeno ou proteína. 
O ouro é usado por sua alta densidade eletrônica, o que aumenta a dispersão eletrônica resultando em pontos escuros de alto contraste. Isso permite que a partícula elétron-­‐densa possa ser vista num microscópio eletrônico como um ponto escuro, indiretamente marcando a molécula procurada. 
 
 
 
Imunocromatografia 
 O sistema é realizado em uma matriz constituída de membrana de nitrocelulose ou de náilon coberta por acetato transparente para facilitar a visualização do teste. O antígeno ou o anticorpo é fixado na membrana na forma de linhas ou pontos e o restante da membrana é bloqueado com proteína inerte. 
 Para detecção de antígenos podem ser utilizados anticorpos fixados na linha de captura e como conjugado um segundo anticorpo conjugado ao corante. Um dos métodos imunológicos desses testes emprega corante insolúvel, como ouro coloidal (róseo) ou prata coloidal (azul marinho) como revelador da interação antígeno-­‐anticorpo. 
A amostra aplicada se liga ao conjugado colorido e após a migração por cromatografia a formação do imunocomplexo é revelada pelo depósito do corante coloidal na linha de captura. 
 
 
 
Southern Blotting 
 O Southern blotting é um método da biologia molecular que serve para verificar se uma determinada seqüência de DNA está ou não presente em uma amostra de DNA analisada. Isso é feito por meio do realce do resultado de uma eletroforese em gel de agarose. O método foi batizado com o nome de seu inventor, o biólogo britânico Edwin Southern, e isso fez com que outros métodos de blot fossem batizados com trocadilhos ao nome de Southern, por exemplo, Western blot e Northern blot. 
 
 
Northern Blotting 
 O Northern Blotting é uma técnica usada na pesquisa em biologia molecular para estudar a expressão gênica, ou seja, verificar se um determinado gene de um genoma é ou não transcrito em RNA e quantificar isso. Essa técnica tem tal nome devido à similaridade de seu procedimento com o Southern blotting, com a diferença chave de que, em vez de DNA, a substância analisada por eletroforese com uma sonda hibridizadora é RNA. 
Uma diferença no procedimento (quando comparada com o Southern blot) é a adição de formaldeído no gel de agarose, que funciona como um desnaturante. 
 
Western Blotting 
É usado para detectar proteínas em um homogenato (células bem trituradas) ou um extrato de um tecido biológico. Essa técnica usa eletroforese em gel para separar as proteínas desnaturadas por massa. As proteínas são então transferidas do gel para uma membrana (tipicamente de nitrocelulose), onde são usados como sonda anticorpos específicos à proteína. 
Assim, os pesquisadores podem examinar a quantidade de proteína em uma dada amostra e comparar os níveis entre diversos grupos. 
 
 
CITOQUÍMICA 
-­‐ É o estudo da composição química celular e dos processos biológicos no interior da célula. 
 
Corantes 
Corantes ácidos 
 Corantes ácidos são corantes aniônicos hidrossolúveis que se ligam a um substrato carregado positivamente (catiônico). Entre eles destacam-­‐se o grupo Ponceau e o Fast Green,cujos alvos são proteínas. 
 
 
Corantes básicos 
 Corantes básicos são corantes catiônicos que se ligam a um substrato carregado negativamente (aniônico). Entre eles destacam-­‐se o Azul de Toluidina, que colore a parede celular, e a Hematoxilina, que colore o núcleo. 
 
Azul de Toluidina Hematoxilina 
Coloração por interação hidrofóbica 
 Existem corantes hidrofóbicos que funcionam por afinidade entre o corante e seu alvo, também hidrofóbico. Um exemplo desses é o Sudan, que detecta lipídeos. 
 
 
 
 
Coloração por ligação covalente 
 São corantes que se utilizam de ligações covalentes com seus substratos para que possam detectá-­‐los. Dentre esses podemos citar a Reação de Feulgen, que colore DNA, e as PAS lectinas, que detectam polissacarídeos. 
 
 
 Reação de Feulgen PAS lectinas 
 
 
Em resumo: 
Corante Alvo Tipo Grupo Ponceau Proteínas Aniônico Fast Green Proteínas Aniônico Azul de Toluidina Parede Celular Catiônico Hematoxilina Núcleo Catiônico Sudan Lipídeos Hidrofobicidade Reação de Feulgen DNA Lig. Covalente PAS Lectinas Açúcares Lig. Covalente 
 
Citoquímica enzimática 
Detecção de enzimas in situ 
Para obter sucesso na localização de enzimas in situ, é preciso criar um ambiente favorável, que consiste na incubação de seu substrato, e no ajuste de pH e temperatura que correspondem à atividade padrão da enzima. O substrato é escolhido de tal forma que obtenha uma coloração diferente quando ligado à sua enzima específica. Assim, pode se detectar a presença de enzimas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Imunocitoquímica 
Consiste na detecção de antígenos in situ através de anticorpos específicos marcados com indicadores: enzimas (visíveis ao microscópio de luz), fluorocromos (visíveis ao microscópio de fluorescência), ou coloides de ouro (elementos eletrondensos visíveis ao microscópio eletrônico de transmissão). O anticorpo marcado se liga ao antígeno, revelando sua presença. 
 
 
 Fluorocromos 
 
 
 Os anticorpos marcados podem ser primários, ou seja, se ligam diretamente ao antígeno, ou secundários, que se ligam a outro anticorpo, que por sua vez estará ligado ao antígeno. 
 
 
Hibridização in situ 
 A hibridização in situ é uma técnica que permite identificar sequencias específicas de nucleotídeos através de uma sequencia complementar de nucleotídeos marcada com um indicador. Essa sequencia é chamada de sonda. A sonda é aplicada à amostra, e se houver uma sequencia complementar à sonda presente, estas se ligam, permitindo a detecção da sequencia. 
 
 
FISH 
 A hibridização fluorescente in situ, conhecida como FISH (do inglês: Fluorescence In Situ Hybridization), é um técnica citogenética usada para detectar e localizar a presença ou a ausência de determinadas sequências de DNA em cromossomos. Ela utiliza sondas fluorescentes que se ligam somente às partes do cromossomo a que eles apresentem um elevado grau de complementaridade de sequência. A visualização do resultado é feita em um microscópio de fluorescência. 
 
 
 
 
 
 
 
 
TÉCNICAS MOLECULARES 
PCR 
 A reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction) é uma técnica pela qual se pode clonar rapidamente uma determinada sequencia de DNA. 
 A fita de DNA a ser replicada é aquecida até 94oC, temperatura em que as fitas são separadas. São adicionados a enzima DNA-­‐polimerase e bastantes nucleosídeos que serão usados na replicação, como substratos da DNA polimerase, são eles o dATP, dGTP, dCTP e dTTP. 
A temperatura é reduzida para 54oC e ocorre o anelamento dos primers, ou seja, eles conectam-­‐se às fitas de DNA separadas. 
A temperatura é aumentada para 72oC, ideal para o funcionamento da DNA polimerase, que sintetiza as outras fitas complementares. 
Este ciclo é repetido inúmeras vezes, fazendo com que a quantidade de fitas de DNA cresça exponencialmente. 
 
 
 
Bibliotecas genômicas 
Uma biblioteca genômica é uma coleção de fragmentos de DNA de uma determinada espécie de organismo, obtidos a partir da ação de endonucleases de restrição, ligados aos vetores apropriados e clonados após terem sido inseridos em um hospedeiro. 
É suposto que uma biblioteca genômica seja representativa de todos os genes do organismo, sendo muito útil quando se pretende isolar um gene específico. Assim, torna-­‐se claro que quando se quer clonar um determinado gene ou o cDNA (DNA complementar) das mensagens por ele codificadas (mRNA) é necessário a construção de coleções de genes recombinantes. As bibliotecas são construídas, na maioria das vezes, usando-­‐se vetores plasmidiais. 
Os vetores plasmidiais são pequenas moléculas circulares de DNA de fita dupla, derivadas de plasmídeos maiores. Os círculos de DNA plasmidial purificados são primeiro clivados com uma nuclease de restrição para criar moléculas de DNA linear. O DNA genômico usado na construção da biblioteca é clivado com a mesma nuclease de restrição, e os fragmentos de restrição resultantes são então adicionados aos plasmídeos clivados e anelados por meio de suas extremidades coesivas para formar círculos de DNA recombinante. 
 
 
 
 
 
 
 
Os plasmídeos são inseridos em bactérias, que são colocadas em culturas para multiplicar o DNA plasmidial resultante. A coleção inteiura dos plasmídeos é chamada de biblioteca de DNA genômico. 
 
As bibliotecas de cDNA são construídas extraindo-­‐se o mRNA de células e fazendo-­‐se uma copia de DNA complementar (cDNA) a partir desse mRNA. Essa reação é catalisada pela transcriptase reversa de retrovírus, que sintetiza uma cadeia de DNA complementar a partir de um molde de RNA. As moléculas de cDNA de fita simples sintetizadas pela transcriptase reversa são convertidas em cDNA de fita dupla pela DNA polimerase, sendo inseridas em um vetor plasmidial e clonadas. 
 
 
Eletroforese em gel – ver parte de fracionamento celular 
Hibridização – ver parte de citoquímica 
Sequenciamento de DNA 
 O sequenciamento de DNA é um processo que determina a disposição dos nucleotídeos ao longo de um dado fragmento de DNA. Isto é feito através de técnicas manuais ou automatizadas, baseadas na identificação do último nucleotídeo incorporado na extremidade de alongamento de uma molécula de DNA marcada, complementar fita simples da qual se deseja determinar a sequência. Assim, é possível a identificação da ordem exata dos pares de bases (A, T, G e C) em um segmento de DNA. 
 Antigamente, eram utilizados o método de degradação de bases (Allan Maxam e Walter Gilbert, 1977) e o método didesoxi (Sanger, 1978). Atualmente, existem técnicas automatizadas, como o pirosequenciamento Roche 454 e o sequenciamento Illumina. 
 
Southern Blot – ver parte de técnicas imunológicas 
 
MICROSCOPIA ELETRÔNICA 
 
 
 
Microscópio eletrônico de transmissão (MET) 
A imagem é formada pelos elétronsque atravessam a amostra, resultando em imagens 2D. 
 
 
Microscópio óptico (esquerda) em comparação com o MET (direita). 
 
Preparação da amostra para MET 
 Fixação – consiste em matar o tecido vivo e preservá-­‐lo. A fixação é feita com gluteraldeído, que faz com que as moléculas de proteína façam ligações covalentemente cruzadas com seus vizinhos. 
 Pós-­‐fixação – o tetróxido de ósmio se liga e estabiliza as bicamadas lipídicas, assim como as proteínas. 
 Desidratação – substituição da água presente nas células por um solvente orgânico (acetona ou álcool, por exemplo). 
 Inclusão – o solvente orgânico é substituído por uma resina monomérica que se polimeriza para formar um bloco sólido (endurecimento da resina). 
 Ultramicrotomia – o bloco sólido é cortado com uma lamina de vidro especial, ou de diamante, em um micrótomo especial. 
 Contrastação – são aplicados sais que contenham metais pesados, como acetato de uranila e citrato de chumbo. 
 
 
Microscópio eletrônico de varredura (MEV) 
A imagem é formada pelos elétrons refletidos ou emitidos pela superfície da amostra, resultando em imagens 3D. 
 
 
 
 
 
Preparação de amostra para MEV 
Fixação – consiste em matar o tecido vivo e preservá-­‐lo. A fixação é feita com gluteraldeído, que faz com que as moléculas de proteína façam ligações covalentemente cruzadas com seus vizinhos. 
 Pós-­‐fixação – o tetróxido de ósmio se liga e estabiliza as bicamadas lipídicas, assim como as proteínas. 
 Desidratação – substituição da água presente nas células por um solvente orgânico (acetona ou álcool, por exemplo). 
 Secagem ao ponto crítico – a secagem ao ponto crítico tem como objetivo remover o solvente orgânico e substituí-­‐lo por ar, mas sem que a célula se deforme. Primeiro, o solvente orgânico é substituído por CO2 líquido num aparelho especial. Esta troca se dá entre 0 e 5oC sob pressão atmosférica. Em seguida, eleva-­‐se a temperatura e a pressão da câmara que contém a amostra até o chamado ponto crítico, em que o CO2 passa ao estado gasoso sem que se forme uma interfase gás-­‐líquido, que levaria à deformação das células devido à alta tensão superficial do sistema. O ponto crítico do CO2 se dá a 31oC e sob pressão de 73 atm. 
 Cobertura com metal pesado – a amostra é coberta com um metal pesado, como ouro ou platina, que ajuda na reflexão dos elétrons e protege a amostra. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MEMBRANA PLASMÁTICA 
A membrana plasmática é uma bicamada fosfolipídica que possui várias funções, dentre as quais a definição dos limites espaciais da célula, proteção, revestimento e permeabilidade seletiva. Os fosfolipídios estão dispostos de modo que suas extremidades hidrofílicas fiquem voltadas para o meio externo e interno, enquanto as extremidades hidrofóbicas compõem a parte interna da membrana. 
A membrana também é composta por varias proteínas, com diversas funções. A relação aproximada entre a quantidade de lipídios e proteínas na membrana é de 50% para cada tipo de molécula. 
 
Modelo do mosaico fluido 
 No meio da matriz lipídica são encontradas moléculas de proteínas, com grande capacidade de movimentação e deslocamento, apresentando significativa importância na retenção e no transporte de outras moléculas através da membrana plasmática, tarefa que realiza de forma seletiva. 
As substâncias que são lipossolúveis transpõem a membrana passando diretamente pela dupla camada lipídica. O restante das substâncias é transportado pelas moléculas proteicas, do meio externo para o meio interno. Íons e pequenas moléculas hidrossolúveis, até mesmo a própria água, atravessam a membrana por meio de diminutos canais compostos pelas moléculas de proteína. Esta estrutura da membrana proteica é chamada de mosaico fluido. 
Lipídios de membrana 
 -­‐ Esteróis: conferem maior rigidez à membrana e aumentam a sua resistência à deformação. Isso acontece pois os anéis aromáticos atrapalham o movimento das caudas dos fosfolipídios, que são bastante flexíveis. 
 
 
 
 -­‐ Glicolipídios: representam 5% dos lipídios da membrana. 
 
 
-­‐ Fosfolipídios: são anfipáticos, ou seja, possuem uma extremidade polar (a “cabeça”) e outra apolar (a “cauda”). 
São formados por um grupo hidrofílico composto por um esqueleto de glicerol com um radical fosfatado e uma cauda hidrofóbica composta por duas cadeias de ácidos graxos de comprimento variável (14 a 24 carbonos). 
 Uma dessas cadeias geralmente é saturada, isto é, não há duplas ligações entre os átomos de carbono, e a outra pode ser saturada ou insaturada. 
 Os principais fosfolipídios são a fosfatidilcolina, fosfatidilserina, esfingomielina e fosfatidiletanolamina. 
 
 
 
Proteínas de membrana 
 As proteínas de membrana podem ser classificadas em transmembrana (atravessam toda a membrana plasmática) ou periféricas (associadas a outras proteínas ou lipídios na membrana). 
Dentre as proteínas transmembrana, existem as unipasso, que atravessam a membrana apenas uma vez, e as multipasso, que atravessam a membrana múltiplas vezes. 
 
 
 
Experimento de Frye e Edidin – as proteínas se movem 
 
Domínios específicos 
 Muitas proteínas não se difundem livremente no plano da membrana. Isso acontece porque membrana plasmática se divide em várias áreas, chamadas domínios, que podem ser delimitados por barreiras. 
As barreiras são formadas por arranjos de proteínas que impedem a livre difusão de outras proteínas ou lipídeos entre elas. As proteínas se difundem livremente dentro de um determinado domínio; entretanto, não passam aos domínios vizinhos por não serem capazes de cruzar as barreiras. 
 
 
Permeabilidade da membrana 
 A membrana possui permeabilidade seletiva, que se baseia no tamanho, na polaridade e na carga das moléculas que atravessam a bicamada. 
Quanto ao tamanho, quanto menor a molécula, mais facilidade tem de atravessar a membrana. 
Em relação à polaridade, as moléculas apolares têm muito mais facilidade em atravessar a membrana, pois a natureza do interior da membrana é apolar. 
Quanto à carga, os íons, positivos ou negativos, não atravessam a membrana, por menores que sejam. 
 
 
Proteínas de transporte 
 As proteínas de transporte têm a função de permitir a passagem de moléculas que não atravessariam a membrana por elas mesmas. Essas proteínas são transmembrana, multipasso, e específicas para cada tipo de molécula. Elas se dividem de acordo com seu modo de atuação, em carreadoras ou canais. 
 As proteínas carreadoras têm a função de se ligar à molécula em um dos meios e liberá-­‐la no outro. Elas transportam poucas moléculas por vez. 
 
 
 
 
 As proteínas do tipo canal atuam como comportas. Ao se abrirem, formam um poro ou canal pelo qual passa rapidamente uma grande quantidadede moléculas. Mesmo assim, podem ser específicas, como os canais iônicos. 
 
Tipos de transporte 
 O transporte transmembrana pode ser classificado em uniporte (a molécula passa pela proteína de membrana normalmente), simporte (a molécula precisa que um íon passe junto com ela), ou antiporte (ao mesmo tempo que uma molécula entra, outra deve sair ao mesmo tempo). 
 
 
 
 
RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO 
 Todas as células eucarióticas possuem o Retículo Endoplasmático. Sua membrana constitui mais da metade da membrana total de uma célula animal. Está localizado em um labirinto de túbulos ramificados e vesículas achatadas que se estendem através do citosol. Os túbulos e vesículas se interconectam, e suas membranas são contínuas junto à membrana nuclear externa. O espaço interno do reticulo chama-­‐se lúmen, e ocupa aproximadamente 10% do volume total da célula. 
 A principal função do reticulo é a síntese de proteínas e lipídeos, servindo também como fonte de armazenamento intracelular de Ca2+. A membrana do RE é o sítio de produção de todas as proteínas transmembrana e lipídeos para a maioria das organelas celulares, e membranas mitocondriais e de peroxissomos. Alem disso, todas as proteínas endereçadas para secreção ao exterior da célula são destinadas inicialmente ao lúmen do RE. 
 O reticulo possui dois domínios variáveis, o liso e o rugoso. O domínio liso caracteriza pela ausência de ribossomos acoplados à sua membrana e é responsável principalmente pela síntese de lipídeos. O domínio rugoso caracteriza-­‐se pela presença abundante de ribossomos acoplados à superfície de sua membrana; sua principal função é a síntese de proteínas, além de participar de modificações pós-­‐traducionais proteicas. 
 
 
 
 
 
 
 
A síntese de proteínas no retículo rugoso 
 Quando a síntese de uma proteína que precisa passar pelo retículo se inicia, os primeiros aminoácidos expostos fora do ribossomo constituem uma sequencia sinal. Essa sequencia então se liga a uma partícula reconhecedora do sinal ou SRP (do inglês Signal Recognition Particle). A membrana do retículo, por sua vez, possui um receptor para o conjunto sequencia de sinal. A membrana do retículo possui também um receptor que forma uma âncora para adesão do ribossomo. A SRP interrompe a síntese das proteínas endereçadas ao retículo até que o ribossomo esteja acoplado à sua membrana. A partir do acoplamento, a cadeia proteica continuará sendo sintetizada para dentro do lúmen do retículo. 
 
 A importação de proteínas é um processo co-­‐traducional, ou seja, o ribossomo que esta sintetizando a proteína está diretamente aderido à membrana do RE, permitindo que uma ponta da proteína seja translocada para o RE enquanto o resto da cadeia polipeptídica está sendo montada. 
 Quando o ribossomo vai se acoplar ao retículo, forma-­‐se um canal hidrofílico transmembrana por onde a proteína nascente vai passar. Esse canal é formado por proteínas transmembrana que se agrupam apenas quando o ribossomo vai se acoplar. Esse canal hidrofílico recebe o nome de translócon (translocador). O ribossomo se ajusta no translocon, de modo que nada mais atravesse o canal além da cadeia proteica e nada vaze do lúmen do retículo para o citosol. O ribossomo permanecerá aderido até terminar de sintetizar a seqüência primária de aminoácidos da proteína. No final da síntese, a seqüência sinal é cortada por uma enzima específica e a proteína fica livre no lúmen do retículo, a partir de onde terá início um processo de acabamento e endereçamento ao seu destino final. Quanto ao 
ribossomo, o que define se este ficará livre ou aderido ao retículo é o tipo de proteína (com ou sem sequencia de sinal) que ele estiver sintetizando naquele momento. 
 
A síntese de lipídeos no retículo liso 
 Todas as enzimas responsáveis por catalisar a síntese de fosfolipídeos se localizam na membrana do retículo do lado voltado para o citossol, onde estão as moléculas precursoras colina, glicerolfosfato e ácidos graxos. Com isso, todos os lipídeos sintetizados serão inicialmente adicionados ao lado da bicamada voltados para o citossol. 
 Entretanto, uma membrana é uma bicamada lipídica em que as quantidades de lipídeo em cada camada é equivalente, assim como as áreas ocupadas por eles, no retículo liso deveria haver um desequilíbrio entre as duas camadas. Esse desequilíbrio de área que teoricamente deveria existir nunca foi realmente observado. Assim, acredita-­‐se que ele é muito rápido, sendo imediatamente corrigido por uma enzima chamada scramblase, capaz de flipar um fosfolipídeo, translocando-­‐o para a face da membrana voltada para a luz do retículo. 
 
 
O fosfolipídeo sintetizado em maior quantidade é a fosfatidilcolina. Essa molécula é produzida pela adição de colina a duas cadeias de ácido graxo e uma molécula de glicerol fosfato. Outros lipídeos, como a fosfatidiletanolamina, a fosfatidilserina e o fosfatidilinositol, são sintetizados e acrescentados à membrana dessa mesma forma. 
COMPLEXO DE GOLGI 
 Assim como o retículo endoplasmático, geralmente existe apenas um complexo de Golgi por célula. Diferente do retículo endoplasmático, com sua rede contínua de túbulos, o complexo de Golgi é formado por cisternas (ou cisternas) que não são contínuas. No conjunto, elas se arranjam como uma pilha de pratos ou, comparação ainda melhor, como vários pães árabes empilhados. Olhando mais atentamente, há perfurações nas cisternas, como se os pães tivessem buracos não alinhados. De cada lado da pilha há uma rede de túbulos. 
 
 
 As vesículas que trazem material do retículo se incorporam à primeira rede de túbulos do Golgi e daí atingem a primeira cisterna. O complexo de Golgi é muito polarizado, isto é, tem uma face diferente da outra. As vesículas que vêm do retículo sempre se incorporam ao Golgi pelo mesmo lado. Esse lado de “entrada” do Golgi, que recebe material do retículo, é chamado lado (ou face) Cis, enquanto a outra extremidade, mais distante do retículo, o lado de “saída” do Golgi, é o lado (ou face) Trans. 
 O número de cisternas entre uma extremidade e outra varia de célula para célula, mas obedece a uma configuração mínima formada por: 
 – rede cis do Golgi, ou CGN, 
 – cisterna cis, 
 – cisterna medial, 
 – cisterna trans 
 – rede trans do Golgi, ou TGN. 
 
 
Funções do aparelho de Golgi 
 O complexo de Golgi tem três funções principais: 
– a glicosilação, isto é, adicionar açúcares a proteínas e lipídeos que foram sintetizados no retículo endoplasmático; 
– adição de grupamentos sulfato a proteínas, participando da síntese de proteoglicanas; 
– distribuição de macromoléculas provenientes do retículo endoplasmático e que percorreram o complexo de Golgi entre três possíveis destinos: 
. Membrana plasmática, onde tais moléculas se incorporarão ou serão secretadas;. Vesículas de secreção, que se acumulam no citoplasma esperando um sinal para exocitarem seu conteúdo; 
. Lisossomos, onde formarão a própria membrana da organela ou terão papel na digestão intracelular. 
 
Glicosilação 
 É a adição de monômeros de açúcar a proteínas e lipídeos, formando glicoproteínas e glicolipídeos. Existem dois tipos de glicosilação de proteínas, as N-­‐ligadas e as O-­‐ligadas. 
 – Glicosilação O-­‐ligada: é catalisada por uma serie de enzimas do tipo glicosil-­‐ transferase que utilizam os açúcares nucleotídeos do lúmen do aparelho de Golgi para adicionar um resíduo de açúcar de cada vez a uma proteína. Em geral, a N-­‐acetilglicosamina é adicionada primeiro, seguida por um numero variável de resíduos adicionais de açúcares. 
 
 – Glicosilação N-­‐ligada: existem duas classes de oligossacarídeos N-­‐ligados, os oligossacarídeos complexos, e os oligossacarídeos ricos em manose. Às vezes, ambos os tipos são encontrados anexados à mesma cadeia polipeptídica. 
 Os oligossacarídeos complexos são gerados quando os oligossacarídos N-­‐ligados originais, adicionados no RE, sofrem retirada e adição de novos açúcares. Eles pode conter mais do que as duas N-­‐acetilglicosaminas originais, bem como um numero variável de resíduos de galactose e de ácido siálico e, em alguns casos, de fucose. 
Ao contrario, os oligossacarídeos ricos em manose sofrem retirada, mas sem adição de novos açúcares no complexo de Golgi. Eles contém apenas duas N-­‐acetilglicosaminas e muitos resíduos de manose, com frequência aproximando-­‐se do numero originalmente presente no oligossacarídeo precursor ligado a lipídeos adicionado no RE. 
 
 
 
Resumo do processamento no complexo de Golgi: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MITOCÔNDRIA E PEROXISSOMOS 
Mitocôndria 
 As mitocôndrias ocupam uma porção substancial do volume citoplasmático das células eucarióticas. Elas são responsáveis pela produção de energia de origem era aeróbia. Acredita-­‐ se que as mitocôndrias descendem de bactérias que se juntaram a células eucarióticas num processo conhecido como endossimbiose. 
 São normalmente descritas como cilindros rígidos e alongados, com diâmetro de 0,5 a 1 μm. Cada mitocôndria é limitada por duas membranas altamente especializadas com funções vitais para a atividade mitocondrial. Juntas, elas definem dois compartimentos separados: a matriz mitocondrial e o espaço intermembranas, bem mais estreito. Cada um desses espaços tem uma coleção única de proteínas. 
 A membrana externa, que delimita o volume da mitocôndria na fronteira com o citosol, possui varias moléculas de porinas, um tipo de proteína transportadora que forma grandes canais aquosos através da bicamada lipídica. Essa membrana, portanto, assemelha-­‐se a um filtro permeável a muitas moléculas pequenas, incluindo pequenas proteínas. Outras proteínas existentes nessa membrana incluem as enzimas envolvidas na síntese de lipídeos mitocondriais e as enzimas que convertem substratos lipídicos em formas que possam ser subsequentemente metabolizados na matriz, receptores importadores de proteínas mitocondriais e a maquinaria enzimática para a divisão e a fusão da organela. 
 A membrana interna é dobrada em numerosas cristas que aumentam bastante a sua área superficial total. Ela contém proteínas com três tipos de funções: conduzir reações de oxidação na cadeia respiratória, produção de ATP na matriz pela ATP-­‐sintase, e regulação da passagem de metabolitos para dentro e fora da matriz por proteínas transportadoras específicas. 
 A matriz mitocondrial contém uma mistura altamente concentrada de centenas de enzimas, incluindo aquelas necessarias ao inicio do ciclo do acido citrico. A matriz também contém varias copias identicas do DNA genômico mitocondrial, dos ribossomos mitocondriais especiais, dos tRNAs e de varias enzimas requeridas para a expressão dos genes mitocondriais. O ciclo do ácido citrico ocorre na matriz mitocondrial. 
 O espaço intermembranas, muito semelhante quimicamente ao citoplasma da celula, contém varias enzimas que utilizam o ATP proveniente da matriz para fosforilar outros nucleotídeos. 
 
 
 
Peroxissomos 
 Os peroxissomos são envolvidos por uma única membrana e não possuem DNA ou ribossomos. Por não serem dotados de genoma, todas as suas proteínas são codificadas no núcleo. Os peroxissomos obtém muitas das suas proteínas por importação seletiva do citosol, embora algumas delas passem por sua membrana por meio do reticulo endoplasmático. 
 
 Desintoxicação da célula 
 Os peroxissomos possuem uma ou mais enzimas que utilizam o oxigênio molecular para remover átomos de hidrogênio de substratos orgânicos específicos (R) em uma reação oxidativa que produz peróxido de hidrogênio: 
 
 A enzima catalase então utiliza o H2O2 gerado por outras enzimas na organela para oxidar uma variedade de outros substratos pela reação peroxidativa, que forma água. Esse tipo de reação oxidativa é importante nas células do fígado e dos rins, nas quais os peroxissomos destoxificam varias moléculas tóxicas que entram na corrente sanguínea. 25% do etanol ingerido é oxidado a acetaldeído desta forma. Alem disso, quando há excesso de H2O2 na célula, a catalase o converte em H2O. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
NÚCLEO E NUCLÉOLO 
 
 
Cromatina 
 Eucromatina – regiões nas quais a cromatina encontra-­‐se desespiralada. Nestas áreas, os nucleossomos afastam-­‐se uns dos outros, expondo os genes que podem, assim, "trabalhar" normalmente sem interrupções, isto é, ser transcritos. Na divisão celular, as regiões de eucromatina também se condensam, juntamente com a heterocromatina dando um aspecto uniforme, de bastões cromossômicos à cromatina como um todo. 
 Heterocromatina – regiões nas quais a cromatina encontra-­‐se espiralada e é, portanto, transcricionalmente inativa. A heterocromatina parece ter funções estruturais durante o ciclo celular. Há, ainda, dois tipos de heterocromatina: constitutiva e facultativa. A heterocromatina constitutiva nunca se expressa como proteínas e que se encontra localizada em volta do centrômero (contem geralmente sequências repetitivas). O tipo facultativo de heterocromatina é, por vezes, transcrito em outros tipos celulares, consequentemente a sua quantidade varia dependendo da atividade transcricional da célula, além de se apresentar condensada na interfase. 
 
Cromossomos 
O cromossomo é o nome pelo qual o conjunto de filamentos de cromatina é chamado durante o processo de divisão. É formado por pedaços de cromatina que se dobram diversas vezes sobre si e possuem um formato de bastonete. Antes que ocorra a divisão, o cromossomo se duplica e são formadas as cromátides (a cromátide é cada um dos filamentos de DNA que são formadas na duplicação do cromossomo). 
O cromossomo possui o centrômero (ou cinetócoro) e, dependendode sua posição, pode lhe proporcionar uma classificação diferente: 
-­‐ Metacêntrico: quando o centrômero está no meio; 
-­‐ Submetacêntrico: quando o centrômero está um pouco distante do meio; 
-­‐ Acrocêntrico: quando ele se encontra perto de um dos polos; 
-­‐ Telocêntrico: o centrômero está em cima de um dos polos. 
 
 
 Na interfase, um dos fatores preparatórios para a divisão celular é a duplicação dos cromossomos, que ocorre com várias origens de replicação nos mesmos: não é definida uma única posição padrão para o inicio da replicação. 
 
 
 
 
 
Nucleossomos e histonas 
As histonas estão presentes em enormes quantidades nas células eucarióticas, de forma que sua massa total na cromatina é praticamente igual à do DNA. Elas são responsáveis pelo primeiro e mais básico nível de organização cromossômica, o nucleossomo, um complexo de DNA-­‐proteína descoberto em 1974. 
 Na fase da interfase, se a cromatina for submetida a um tratamento que a desenrole parcialmente, observa-­‐se, no microscópio eletrônico, uma serie de “contas em um colar”. O colar é o DNA e cada conta é uma “partícula cerne do nucleossomo”, que consiste em DNA enrolado em um núcleo de proteínas formado de histonas. 
Após seu isolamento da cromatina compactada, a organização estrutural dos nucleossomos foi determinada pela digestão com enzimas específicas (nucleases), que degradam o DNA clivando-­‐o entre os cernes dos nucleossomos. Após digestão por um curto período, o DNA exposto entre as partículas dos nucleossomos (DNA de ligação) é degradado. 
Cada partícula do cerne nucleossômico individual consiste de um complexo de oito proteínas histonas – duas moléculas de cada uma das histonas H2A, H2B, H3 e H4 – e a fita dupla de DNA, com 147 nucleotídeos de comprimento. O octâmero de histonas forma um cerne proteico ao redor do qual a fita dupla de DNA é enrolada. 
 
Replicação do DNA 
 Inicialmente, a enzima helicase quebra as ligações de hidrogênio entre as bases nitrogenadas de ambas as fitas, para promover sua separação. À medida que a helicase abre a fita, a enzima topoisomerase desenrola a cadeia, criando um eixo de rotação para facilitar a ação da helicase. A ação dessas duas enzimas acontece em múltiplas partes da dupla hélice, formando várias forquilhas de replicação na fita. 
 Em seguida, a DNA polimerase deve iniciar síntese de uma nova fita no sentido 5’-­‐ 3’, entretanto, para que a DNA polimerase comece seu trabalho, é necessário que receba auxílio da enzima RNA primase. A RNA primase sintetiza os primeiros nucleotídeos (primers) da fita nova, ligados à fita molde. Feito isso, a DNA polimerase pode começar o processo de extensão da nova fita a partir dos primeiros nucleotídeos. Esta nova fita é chamada de fita líder. 
 Na outra fita molde, ocorre o mesmo processo, mas no sentido oposto. Entretanto, a helicase e a topoisomerase continuam abrindo a forquilha de replicação. Consequentemente, são necessários vários pontos de inicio de síntese para essa fita. Quando o alongamento da fita chega ao primer anterior, estas partes não se conectam, deixando pequenos espaços conhecidos como fragmentos de Okazaki. Assim, essa fita é chamada de fita descontínua. 
 
 
 
 Posteriormente, em ambas as novas fitas, os primers são removidos pela DNA polimerase I. Na fita descontínua, em especial, os fragmentos de Okazaki são conectados pela enzima DNA-­‐ligase. 
 
 
A DNA polimerase é autocorretiva 
 Correção durante a polimerização (5-­‐3’) – é a primeira etapa de correção, realizada pela DNA polimerase imediatamente antes da adição do novo nucleotídeo à cadeia crescente. O nucleotídeo correto tem maior afinidade pela polimerase em movimento em comparação ao incorreto, pois o pareamento correto é mais favorável energeticamente. Além do mais, após a união por ligações de hidrogênio do nucleotídeo, mas antes de ser ligada covalentemente à cadeia crescente, a enzima deve sofrer uma alteração conformacional. Como essa alteração ocorre mais prontamente com o pareamento correto, a polimerase pode verificar a geometria exata do pareamento de bases antes de catalisar a adição do novo nucleotídeo. 
 Correção exonucleolítica – ocorre imediatamente após os raros casos em que um nucleotídeo incorreto é covalentemente ligado à cadeia crescente. As DNA polimerases são altamente especificas para os tipos de cadeias de DNA que alongam: elas necessitam, absolutamente, de um pareamento de bases previamente formado, com a extremidade 3’-­‐OH de um primer (iniciador). Essas moléculas de DNA com pareamento impróprio de nucleotídeos na extremidade 3’ –OH da fita iniciadora não servem como molde eficiente porque a polimerase não pode alongar a fita. As moléculas de DNA polimerase corrigem essas fitas iniciadoras com pareamentos incorretos por um sitio catalítico separado (outra parte da 
molécula). Essa atividade de exonuclease de correção 3’-­‐5’ cliva qualquer nucleotídeo não pareado na extremidade do iniciador, continuando até que um numero suficiente de nucleotídeos tenha sido removido para regenerar uma extremidade 3’ –OH corretamente pareada, e então iniciar a síntese de DNA. 
 
 
 
 
Telômeros e telomerase 
 Os telômeros compreendem inúmeras sequencias curtas e repetitivas nas extremidades dos cromossomos. Em humanos, a sequencia da unidade de repetição é GGGTTA, sendo repetida aproximadamente mil vezes em cada telômero. 
 As sequencias de DNA telomérico são reconhecidas por proteínas ligadoras de DNA que reconhecem uma sequencia específica de DNA e atraem a enzima telomerase, que repõe essas sequencias cada vez que a célula se divide. A telomerase reconhece a extremidade de uma sequencia telomérica existente e a estende na direção 5’-­‐3’, utilizando um molde de RNA que compõe a própria enzima para sintetizar novas copias da repetição. Após a extensão da fita de DNA original pela telomerase, a replicação da fita descontinua na extremidade cromossômica pode ser completada pelas enzimas DNA polimerase convencionais usando as extensões como molde para a síntese da fita complementar. 
 Este mecanismo também assegura que a extremidade 3’ do DNA de cada telômero seja sempre um pouco mais longa que a extremidade 5’ a qual está pareada, deixando uma porção terminal de fita simples exposta. Esta extremidade exposta inclina-­‐se para trás, inserindo sua extremidade de fita simples na dupla-­‐hélice de DNA da sequencia telomérica repetida, formando uma alça t. 
 As alças t geram uma estrutura característica nas extremidades cromossômicas normais que as protege de enzimas de degradação e claramente as distingue das extremidades de moléculas de DNA quebradas, que devem ser imediatamente reparadas pela célula. 
 
 
Transcrição 
 A transcrição começa com a abertura e desespiralação de uma pequena porção da dupla-­‐hélice de DNA, o que expõe as