CITOLOGIA- Cultura de Celulas

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CULTURA DE 
CÉLULA 
Tatsuya Nagata, Ph.D. 
Virologia humana/vegetal 
Lab. Microscopia e Virologia 
Dept. Biologia Celular 
Universidade de Brasília 
 
Cultura de células, para quê? 
Cultura de células (mamífero) 
 Estudo de 
 Expressão gênica 
 Câncer 
 Fatores de crescimento 
 
 
 Manutenção de patógenos intracelulares 
 
 
 Cultura de células-tronco 
 
 Produção de anticorpo monoclonal 
 (Para Próxima Aula) 
 
 
E outros tipos de células? 
 Inseto? 
 Microorganismos 
 Bactéria 
 Fungo 
 Protozoário 
Cultivo de Vírus animais em 
laboratório: 
 
 
•Em animais 
 
•Em ovos embrionados 
 
•Em cultivos celulares 
 
 
Isolamento de vírus 
1. Isolamento de tecidos 
 
2. Esterilização superficial 
 
3. Dissociação de células 
 
4. Manutenção em meio de cultura 
80% etanol/hipoclorito Tripsina/colagenase 
Como isolar as células dissociadas???? 
Por centrifugação 
Por centrifugação 
O isolamento de linfócitos humanos por centrifugação 
Gradiente de Ficoll 
 
Está pronto? 
Cultura de célula primária 
 
 
 
 
 
Linhagem de célula contínua 
Morre tudo Pelo menos 1 ano 
Vantagens: 
- experimentos homogêneos 
- repetitividade 
 
Cultura de Célula primária 
vs 
 Linhagem de célula contínua 
Vantagens: 
- Uso imediato 
- Não exige o esforço de 
 estabelecimento 
 
Cultura de Célula primária Linhagem de célula contínua 
As linhagens celulares: mamíferos 
Linhagem Celular Origem 
3T3 Fibroblasto (rato) 
BHK21 Fibroblasto 
(Hamster) 
MDCK célula epitelial 
(cachorro) 
Hela Célula epitelial 
(humana) 
PtK1 Célula epitelial 
(rato) 
L6 Mioblasto (rato) 
cultura de células-tronco embrionárias 
Blastocisto 
cultura de células-tronco embrionárias 
Culturas de células são de mamíferos, só???? 
Linhagens celulares de inseto 
UFL-AG-286 Tn-5B 
Linhagens Celulares Vegetais 
Nicotiana 
Planta de fumo 
Vamos começar a manter uma 
cultura de células !!!!!!! 
 
 
Mas antes........ 
Preparar o meio de cultura 
para Células humanas 
 
O que precisa ????? 
Composição de um meio de cultura 
para células de mamíferos 
Aminoácidos Vitaminas Sais vários proteínas 
Arginina 
Fenilalanina 
Isoleucina 
Leucina 
Lisina 
Metionina 
Serina 
Treonina 
Triptofano 
valina 
 
Cisteína 
Glutamina 
Histidina 
Biotina 
Folato 
Nicotinamina 
Pantotenato 
Piridoxal 
Tiamina 
Riboflavina 
NaCl 
KCl 
NaH2PO4 
NaHCO3 
CaCl2 
MgCl2 
Glicose 
Penicilina 
Estreptom
icina 
Vermelho 
fenol 
 
Soro fetal 
 
Insulina 
Transferrina 
 (Fe) 
Fatores de 
crescimento 
específicos 
Meios quimicamente definidos: 
 
 
• Composição química e exata e conhecida 
 
 
 
 
 
 Meio complexo 
 
• Para o cultivo de rotina no laboratório (quimicamente indefinidos) 
 
 
• Produtos naturais adicionados como extrato de levedura, 
de carne, de planta 
 
• Componente protéica 
peptonas = pequenos cadeias de aminoácidos 
 
Condições de Cultura celular 
 
Fatores Físicos necessários 
para crescimento 
 
 
•Temperatura 
 
•PH 
 
•Atmosfera gasosa 
 
•Pressão osmótica 
Temperatura 
 
• Maioria de células crescem nas temperaturas ideais em 37C 
 
• Temperatura mínima/ótima/máxima 
 
• Células crescem em uma faixa grande (ou pequena) de 
 temperaturas: 
 Exemplos: Bacillus subtilis 8 – 53 C, 
 Neisseria gonorrhoeae 30 – 40 C 
Palavra Chave 
as enzimas 
pH 
 pH ótimo – media entre pH Maximo e mínimo 
 Bem definido para cada espécie 
 Células mantém pH neutro dentro da célula 
(mesmo bem acido ou básico o pH externo) 
 
pH 
 
 
•pH ótimo – media entre pH Maximo e mínimo 
 
 
 
•Células mantém pH neutro dentro da célula 
 (mesmo bem acido ou básico o pH externo) 
 
•pH muda decorrente de crescimento celular ou 
 contaminação 
 
Neutral / ácido 
Atmosfera Gasosa 
 
•No habitat natural – células necessitam concentrações diferentes de O2, 
CO2, N2, CH4 
 
 
•No laboratório - tem que fornecer estes gases 
 
 
•CO2 & O2: os dois gases principais 
 
•4 grupos : resposta ao oxigênio: 
 
 aeróbios 
 microaerófilos 
 facultativos 
 anaeróbios 
 
 
 
E maiorias células humanas??? 
Pressão Osmótica 
 
 
 
• Solução isotônica fora e dentro da célula: 
 
 
 
 
• Solução hipertônico fora da célula: 
célula perde água, crescimento inibido 
(ex: alimentos salgados) 
 
 
• Solução hipotônico fora da célula: 
água flui para dentro da célula – e a rompe 
Crescimento 
Tempo de geração: 
•Tempo necessário para célula se dividir (=dobrar população) 
 
Depende de: 
• Organismo 
• Condições ambientais 
 
• E. coli: 30 minutos 
 
• Maioria das bactérias: 1- 3 horas 
 
• Leveduras 4 horas 
 
• Células de inseto e mamífero 24-48 horas 
Curva de crescimento 
•4 fases: 
•Lag 
•Log 
•Estacionaria 
•Declineo ou morte celular 
•Fase Lag / latente 
 
 
•Células não começam a replicação imediatamente 
•Fase de síntese de DNA, expressão gênica e produção de 
enzimas necessários 
 
 
•Fase Log / crescimento exponencial 
 
 
•Divisão celular 
•Aumento logarítmico 
•Tempo de geração – atinge um valor constante 
•Período de maior atividade metabólica da célula 
•Fase estacionária 
 
•Depois de crescimento exponencial – acumulação de células 
•Velocidade de crescimento diminui 
•Numero de morte celular = numero de células novas = população 
estável 
•Atividade metabólica decresce 
 
Causas: 
•Termino de nutrientes 
•Acumulo de produtos de degradação 
•Mudanças no pH 
 
 
•Fase de Declínio / morte celular 
•Numero de células mortas excede o de células novas 
•Continua ate o população desaparece totalmente 
Curto prazo: 
•4 C na geladeira 
Longo Prazo 
 
•Nitrogênio liquido (–196C) 
Preservação de Culturas puras 
Dever de casa: 
 
 
Como prepara a vacina contra HPV 
?????? 
 
 
 
 
Dever de casa: 
 
 
Técnicas imunológicas?????? 
 
Técnicas usando afinidades entre 
Anticorpo-Antígeno 
 
 
 
 
Dever de casa: 
 
 
O que são? 
 
ELISA 
Western Blotting 
Anticorpo Monoclonal 
IgG 
IgM