RELATÓRIO CULTURA DE TECIDOS

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UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ 
CURSO DE ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS E BIOTECNOLOGIA 
 
 
 
 
 
ANA PAULA MIOLA PERIN 
 
 
 
 
 
 
RELATÓRIO CULTURA DE TECIDOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dois Vizinhos 
2017 
 
1 INTRODUÇÃO 
Cultura de tecidos vegetais é o nome dado a um conjunto de técnicas que são 
utilizadas em partes vivas de uma planta. Essas técnicas são muito uteis no melhoramento 
genético de plantas que são aplicadas na agricultura. Os pequenos fragmentos do vegetal 
(explantes) utilizados são isolados de um organismo, desinfetados e cultivados em meios 
de cultura apropriados. O principal objetivo da técnica é obter uma nova planta idêntica 
á original, ou seja, realizar uma clonagem vegetal que é definida como uma propagação 
assexuada de células ou organismos de modo a obter um novo individuo com genótipo 
idêntico ao seu ancestral (ANDRADE, 2002) 
Os explantes utilizados para cultivo in vitro na cultura de tecidos podem ser 
diversificados, podendo ser utilizados as folhas, raiz, caule ou qualquer outro tecido que 
responda a regeneração in vitro (figura 1). Essa capacidade de uma planta se regenerar é 
chamada de totipotncia essa manifestação de cada tecido em um determinado estimulo 
ou substrato apropriado para iniciar um novo indivíduo (TERMIGNONI; PORTO; 
MORAIS, 2005). 
 
Figura 1. Princípio da cultura de tecidos 
A plantas ornamentais caracterizam um mercado bastante competitivo e exigente 
e para atingir os parâmetros exigidos pelos consumidores a cultura de tecidos se faz 
essencial para tornar as plantas filhas sadias, com alta qualidade genética, características 
diferenciadas, propagação de clones em qualquer época do ano e facilitar o cultivo de 
espécies de difícil propagação. O cultivo comercial das orquídeas bem crescendo 
significativamente. As orquídeas são plantas herbáceas e perenes bastante diversificadas 
em tamanho, cor das flores. Seu cultivo pode ser tanto por sementes ou vegetativa. Na 
natureza so conseguem se estabelecer com ajuda simbiótica de fungos, bactérias e outras 
planta (FRÁGUAS; PEREIRA; RODRIGUES, 2014). 
As orquídeas podem ser encontradas em quase todas as regiões do planeta exceto 
os polos e desertos, sua frequência é mais abundantes nos trópicos. Além da sua função 
ornamental as orquídeas possuem um valor agregado na indústria para fabricação de de 
essências. 
No contexto de preservação ambiental o professor Lewis Knudson desenvolveu 
técnicas de cultivo assimbiótico no qual as orquídeas tiveram 100% de adaptação com 
parado com o meio natural. Com isso muitas outras técnicas de cultivo in vitro foram 
aparecendo cada uma dando chances a outras espécies de se propagar. (SILVA; 
PASQUAL, 2003). 
A rúcula é uma hortaliça relevante na alimentação humana e tem sido plantada em 
diversas regiões do Brasil. Embora a rúcula não seja a mais plantada e consumida ela vem 
ganhando mercado graças as receitas gourmet que incluem essa hortaliça (SILVA; 
BITTENCOURT-OLIVEIRA, 2011). 
 As rúculas são facilmente cultivadas in vitro pertence à família Brassicaceas, com 
centro de origem na região do Mediterrâneo e parte ocidental da Ásia, de porte herbáceo 
é uma planta anual, que necessita de temperaturas amenas para o cultivo. O cultivo da 
hortaliça pode ser realizado em sistemas de cultivo convencionais, protegidos ou 
hidroponia, com intensificação no país, do cultivo em sistemas hidropônicos 
(MEIRELLES; BALDOTTO, 2016). 
 Em termos de nutrição a rúcula apresenta uma carga de nutrientes bastante valiosa 
para nutrição animal. Possui sabor picante, cor verde escura e é rica em vitaminas A e C, 
magnésio, cálcio, potássio, enxofre, ferro e fibras. Por essas características é fundamental 
o desenvolvimento de tecnologias que incrementem sua produtividade e qualidade 
(PORTO et al., 2013). 
1.1 Objetivos 
 O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta de plântulas de orquídeas e rúculas 
cultivadas in vitro a diferentes concentrações do meio Knudson. 
2 METODOLOGIA 
2.1 Meio de cultura 
O meio Knudson foi preparado para 2L utilizando 2g de nitrato de cálcio, 0,5g fosfato 
monobásico de potássio, 0,5g sulfato de magnésio, 1g sulfato de amônio, 0,05g sulfato 
ferroso, 0,015g sulfato de manganês, 20g/L sacarose. Dos 2 L preparados, foi separado 
1,3 L de concentração original do meio Knudson onde foi adicionado 10,4 g de ágar e o 
restante 0,7 L utilizado para o meio ½ Knudson completando com mais 0,7 L de água e 
11,2 g de ágar, para obtenção de 1,4 L de meio de cultura Knudson com metade da 
concentração. Assim as soluções foram levadas ao micro-ondas a fim de homogeneizar a 
solução. Após a mistura ficar pronta frascos de vidro serviram de base para os meios, 
onde foram adicionado ± 30 mL do meio de cultivo, suficiente para preencher 15 frascos 
de cada meio, totalizando 30 frascos. Todos os frascos foram vedados com fita, alumínio 
e sacolas plásticas em seguida levados para autoclave. 
 
2.2 Repicagem de orquídeas 
 
 Utilizou-se plantas hibridas Sopholaeliocattleya jowel box. Self e Anceps coruela x 
Schomburgkia splendida, como apresentadas na figura 1. As sementes foram manipuladas 
em fluxo laminar estéril e materiais devidamente esterilizados. Dentro do fluxo os frascos 
contendo os meios de cultivo foram abertos cuidadosamente para não permitir a 
contaminação. Foram aderidas as sementes de orquídeas em 3 frascos com meio Knudson 
original e 3 frascos de meio Knudson, em seguida os frascos foram fechados devidamente 
com filme plástico e seguiram para a sala de cultivo. 
 
Figura 1. Na primeira imagem está representada Sopholaeliocattleya jowel box. Self e na 
segunda imagem, Anceps coruela x Schomburgkia splendida, 
 
2.3 Germinação de (rúcula/salsa) 
 
Para a germinação das sementes realizou-se o mesmo procedimento de esterilização 
dos materiais e do fluxo laminar como realizado na repicagem das orquídeas. Na limpeza 
das sementes foram necessários 10 mL de hipoclorito de sódio em 90 ml de água e um 
frasco autoclavado. As sementes ficaram por 5 minutos nessa solução e depois a solução 
foi retirada lavando as sementes com água autoclavada. Após a lavagem devida das 
sementes, foram recolhidas 2 e inoculadas no meio de cultivo e levadas para sala de 
cultivo. 
 
2.4 Análise dos dados 
Na coleta de dados as plantas foram retiradas do meio de cultura, mergulhadas em 
hipoclorito 10% e lavadas em água corrente para retirar todo o resíduo de hipoclorito. Os 
dados analisados para as orquídeas foram: número de folhas, número de brotos, número 
de raízes, comprimento da parte aérea, comprimento da raiz mais longa, peso fresco. Para 
as rúculas foram analisadas apenas duas características, o tamanho da raiz e o 
comprimento da parte área. 
 
3 RESULTADOS 
3.1 Orquídeas 
 
 
11
12
13
14
15
Knudson 1/2 Knudson
1- Nº DE FOLHAS
0
0,05
0,1
0,15
0,2
Knudson 1/2 Knudson
2- Nº DE BROTOS
0
0,05
0,1
0,15
0,2
Knudson 1/2 Knudson
3- Nº DE BROTOS
1,5
1,6
1,7
1,8
1,9
2
Knudson 1/2 Knudson
4- Nº RAIZES
 
 
 
3.2 Rúcula 
 
 
 
 
 
 
 
 
0
1
2
3
4
Knudson 1/2 Knudson
5- COMP. PARTE AEREA
0
0,5
1
1,5
2
Knudson 1/2 Knudson
6- RAIZ
0
0,1
0,2
Knudson 1/2 Knudson
7- PESO FRESCO
0
1
2
3
Knudson 1/2 Knudson
8- CALOS
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Knudson 1/2 Knudson
Raiz Parte Aerea
9- RÚCULA
TABELA 1. Orquídeas 
 DESVIO 
PADRAO 
 
TIPO DE MEIO Nº DE 
FOLHAS 
NºDE BROTOSD Nº DE 
 RAIZ 
PARTE 
AEREA 
RAIZ PESO 
FRESCO 
CALOS 
KNUDSON 
 
 8,2 0,5 1,0 0,7 0,7 0,1 0 
½ KNUDSON 5,9 0,5 1,3 1,2 0,8 0,05 0 
 
TABELA 2. Rúcula 
 DESVIO PADRAO 
TIPO DO MEIO RAIZ PARTE AEREA 
KNUDSON 1,7 1,0 
 
½ KNUDSON 
 
0,7 
 
0,7 
 
 
 
4 DISCUSSÃO 
4.1 Orquídeas 
 
O meio Knudson é um dos principais meios de cultivo utilizados nas práticas in 
vitro, especialmente no cultivo de orquídeas. Baseado na adaptação que a maioria das 
plantas possuem com relação ao meio Knudson, foram testados duas concentrações do 
meio, para avaliar o desenvolvimento das plantas. As analises foram separadas por grupos 
e os resultados apresentados em forma de gráficos e tabelas. 
De acordo com a análise de variância, pode-se observar interação significativa 
para número de raízes, número de brotos, comprimento radicular e biomassa fresca 
radicular dos híbridos de orquídea. Analisando os gráficos 1, 2, 3, 5, 7, 8 notou-se que o 
meio Knudson original se sobressaiu em relação ao ½ Knudson. Quando o meio Knudson 
original é comparado com outros meios de cultura, como no trabalho descrito por 
Rodrigues et al. (2012), que comparou o meio Knudson C com o meio MN em cultivo in 
vitro de orquídeas hibridas. Nesse trabalho o autor relata que o meio Knudson estimulou 
a formação da parte aérea, e não estimulou formação das raízes, e em outros quesitos se 
igualou com o outro meio de cultura utilizado. Em outros trabalhos foi possível 
comprovar a mesma informação, como no trabalho apresentado por Silva et al. (2009), 
onde constatou que para altura das plântulas apenas as concentrações do meio Knudson 
promoveram efeito significativo, enquanto que em relação ao número de raízes, apenas o 
uso de diferentes concentrações de vitaminas do meio MS apresentou efeito significativo. 
Enquanto, no presente estudo o meio Knudson original se sobressaiu em quase todos os 
parâmetros exceto no número e tamanho das raízes como apresentados nos gráficos 4 e 
6, onde o ½ Knudson foi mais eficiente. Se levado em consideração os estudos realizados 
por outros autores como Felix et al. (2013), é possível notar que o meio ½ Knudson 
favorece a formação das raízes das orquídea s. 
Num substrato com deficiência de nutrientes, aumentar o comprimento das raízes 
é uma maneira da plântula buscar os nutrientes necessários ao seu desenvolvimento 
mesmo que isto implique em gasto de reservas. Pode-se inferir desta forma, que as 
vitaminas, aminoácidos e sacarose do meio por estarem reduzidas, influenciaram 
positivamente o enraizamento in vitro (SILVA; VILLA; PASCAL, 2009). 
Ainda que o ½ Knudson favorece a formação das raízes, o meio que mais 
favoreceu a planta como um todo foi o meio original, por dispor de maiores quantidades 
de nutrientes e sais no meio. Para melhorar o desenvolvimento radicular da planta e 
possível suprir o meio com hormônios especiais para esse segmento. Sendo essa falha 
suprida o meio original se torna ideal para culturas in vitro. 
Nas imagens apresentado abaixo e possível visualizar a diferença entre as 
plântulas de cada meio. 
 
 
Figura 2. Plantas do meio Knudson original 
 
 
 
Figura 3. Planta do ½ Knudson 
 
 
 
4.2 Rúculas 
 
No caso das sementes de rúculas, as duas concentrações de meio de cultura 
também foram analisado. Nesse caso foram usados 2 sementes em cada frasco, no final 
deveríamos ter as medidas de 12 plantas, mas um meio de cultivo contaminou perdendo 
as 2 sementes de um frasco como e possível ver na figura 4. Esse fato pode ter ocorrido 
devido a erros de manipulação inadequada, transferindo microrganismos para dentro do 
frasco. A contaminação possui características de fungo, embora não foi analisado para 
saber o tipo de microrganismo. Todas as medidas de descontaminação foram tomadas 
eliminando então a amostra de forma correta. E as estatísticas não foram afetadas por falta 
dessa amostra. 
 
 
Figura 4. Frasco contaminado possivelmente com fungo filamentoso 
 
As análises foram realizadas e estão apresentadas no gráfico 9 e tabela 2. Foram 
comparado dois parâmetros, parte área e raiz, a partir desses resultados foi possível 
verificar o melhor desenvolvimento da planta no meio original Knudson para parte aérea 
como visto no caso das orquídeas, enquanto para as raízes o ½ Knudson manteve o melhor 
enraizamento. As rúculas não são plantas muito exigentes como e no caso das orquídeas, 
que necessitam de uma grande variedade de nutrientes. Por isso, as concentrações 
contidas no meio original foram ideias para o desenvolvimento das plantas. Embora o ½ 
Knudson não teve os piores resultados de crescimento. As condições externas como 
temperatura e luz não podem ser esquecidas pois também são fatores essenciais para o 
crescimento do vegetal. 
 
 
5 CONCLUSÃO 
Após analise cautelosa de todos os dados, é possível concluir que o aumento no 
número de folhas, brotos, calos, parte aérea são influenciados pela concentração total do 
meio Knudson original. Enquanto a metade da concentração original do meio influência 
o desenvolvimento da parte radicular da planta. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
REFERENCIAS 
TERMIGNONI, Regina Ramos; PORTO, Maria Luiza; MORAIS, Marcelo Gravina 
de. Cultura de tecidos vegetais. Porto Alegre: Ufgrs, 2005. 182 p. 
ANDRADE, Solange Rocha Monteiro de. Principios da cultura de tecidos 
vegetais. Planaltina: Embrapa Cerrados, 2002. 16 p. 
MEIRELLES, Ana Flavia Mairinck; BALDOTTO, Marihus Altoé. PRODUTIVIDADE 
DE HORTALIÇAS (ALFACE, BRÓCOLIS E RÚCULA) EM RESPOSTA AO 
TRATAMENTO COM ÁCIDOS HÚMICOS E BACTÉRIAS PROMOTORAS DE 
CRESCIMENTO EM UNIDADES DE AGRICULTURA FAMILIAR. 2016. 108 f. 
Dissertação (Mestrado) - Curso de Engenharia Florestal, Universidade Federal de Viçosa, 
Minas Gerais, 2016. 
SILVA, Ítalo Macedo; BITTENCOURT-OLIVEIRA, Maria do Carmo. EFEITOS 
ALELOPÁTICOS DE MICROCISTINAS EM RÚCULA (Eruca sativa Mill.). 2011. 
67 f. Dissertação (Mestrado) - Curso de Ciências Biológicas, Universidade Estadual 
Paulista, Rio Claro, 2011. 
SILVA, Enoque Fernandes da; PASQUAL, Moacir. Multiplicação e crescimento in 
vitro de orquídea Brassiocattleya Pastoral x Laeliocatteya. 2003. 73 f. Dissertação 
(Mestrado) - Curso de Agronomia, Universidade Federal de Lavas, Minas Gerais, 2003. 
FRÁGUAS, Chrystiane Borges; PEREIRA, Alba Regina; RODRIGUES, Vantuil 
Antônio. PROPAGAÇÃO IN VITRO DE ESPÉCIES ORNAMENTAIS. 2014. 20 f. 
TCC (Graduação) - Curso de Agronomia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 
Porto Alegre, 2014. 
PORTO, Rebeca de Andrade et al. Potassium fertilization in rocket plants: production 
and efficiency in water use. Agroambiente, Boa Vista, v. 7, n. 1, p.28-35, jan. 2013. 
RODRIGUES, Donizetti Tomaz et al. Concentrações e composições químicas do meio 
nutritivo para o cultivo in vitro de orquídea. Revista Ceres, [s.l.], v. 59, n. 1, p.1-8, fev. 
2012. FapUNIFESP (SciELO). http://dx.doi.org/10.1590/s0034-737x2012000100001. 
FELIX, Lucas Macedo; BARBANTE, Gilberto. Efeito de giberelina, oxido nítrico e 
etileno no estiolamento de Dendrobium. 2013. 54 f. Dissertação (Mestrado) - Curso de 
Biologia, Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo, São Paulo, 2013. 
SILVA, Enoque Fernandes da; VILLA, Fabíola; PASCAL, Moacir. MEIO DE 
CULTURA KNUDSON MODIFICADO UTILIZADO NO CULTIVO IN VITRO DE 
UM HÍBRIDO DE ORQUÍDEA: CULTURE MEDIUM KNUDSON MODIFIED 
UTILIZED IN VITRO CULTIVATION OF ORCHID’S HYBRID. Scientia 
Agraria, Curitiba, v. 10, n. 4, p.267-274, ago. 2009.