Apresentação na UEA Coleçoes de Cultura

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Fungos da Microbiota Amazônica Sucro-alcooleira e de Substratos Amiláceos: Conservação, Preservação e Aplicações Biotecnológicas.
PROGRAMA MULTI-INSTITUCIONAL DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
SEMINÁRIOS
Profa. Doutora Sônia Maria da Silva Carvalho
e-mail: sscarvalho1@ufam.edu.br ; sscarvalho1@hotmail.com
Endereço: Av. Gal. Rodrigo Otávio Jordão Ramos, 3000 – ICB – Setor Sul – Coroado – CEP: 69.077-000 / Fone: (092) 3305-4230/9984-6682
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COLEÇÕES DE CULTURA
Microrganismos desempenham funções essenciais para a manutenção do meio ambiente e seu biota. A diversidade de atividades metabólicas e produtos microbianos tem grande aplicação em diversos setores da indústria e, em especial, para o desenvolvimento da biotecnologia. 
A maneira mais eficaz de conservar microrganismos de importância econômica é a preservação em coleções de culturas 
“Coleções de culturas são centros de conservação que tem a função de coletar organismos relevantes para estudos científicos e aplicações tecnológicas, tornando-os disponíveis para os usuários interessados”
Fungos da Microbiota Amazônica Sucro-alcooleira e de Substratos Amiláceos: Conservação, Preservação e Aplicações Biotecnológicas.
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Fungos da Microbiota Amazônica Sucro-alcooleira e de Substratos Amiláceos: Conservação, Preservação e Aplicações Biotecnológicas.
COLEÇÕES DE CULTURA
Panorama Mundial - coleções de culturas e bancos genômicos são considerados peça fundamental em programas de bioprospecção e desenvolvimento em empresas atuantes no setor de biotecnologia em países industrializados.
Panorama Brasileiro –Coleções importantes e acervos estão predominantemente localizadas nas regiões Sudeste e Sul, em centros de pesquisa e universidades. No Brasil, na maioria dos casos, as coleções são fruto da iniciativa de pesquisadores individuais. 
Panorama Regional – Regiões consideradas ricas em diversidade como Norte (Amazônia) e Centro-Oeste (cerrado/Pantanal/ Mata Atlântica) apresentam um número pequeno de coleções (MANFIO, 2003)
Número de coleções: 
No Mundo: 484 registradas no WDCM * No Brasil: 46 registradas no WDCM* No estado de São Paulo:18 ** 
WDCM - World Data Center for Microorganisms 
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Fungos da Microbiota Amazônica Sucro-alcooleira e de Substratos Amiláceos: Conservação, Preservação e Aplicações Biotecnológicas.
PRESERVAÇÃO 
 Saber como preservar culturas dispondo de técnicas simples e eficientes é de suma importância em qualquer laboratório onde se desenvolvam atividades de pesquisa para fins biotecnologicos.
REQUERIMENTOS
 Ser capaz de manter o organismo vivo por longo período de tempo
 Não permitir ou minimizar a ocorrência de mutações ou de variabilidade que possam a vir refletir na patogenicidade, virulência ou características básicas da cultura original
 Garantir a viabilidade morfológica/fisiológica e genética da cultura
 Garantir a estabilidade morfológica/fisiológica e genética da cultura
 Manter sua pureza
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Fungos da Microbiota Amazônica Sucro-alcooleira e de Substratos Amiláceos: Conservação, Preservação e Aplicações Biotecnológicas.
PRESERVAÇÃO
Quanto ao Método empregado:
 
Simplicidade e rapidez de execução
Baixo custo
Não requerimento de equipamento sofisticado
Elevado grau de eficiência
Abrangência para diferentes grupos ou gêneros
Teoricamente, para cada microrganismo, devido às suas pecualiaridades intrínsecas, dever-se-ia desenvolver um método específico.
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PRESERVAÇÃO – Quanto ao Tipo/Forma
	fungos filamentosos e leveduras
óleo mineral e água (esterilizados)
ultracongelamento a - 80°C
criopreservação a - 140°C
Liofilização
	bactérias
ultracongelamento a - 80°C
criopreservação a - 140°C 
liofilização
Adota-se alguns métodos de preservação já testados e recomendados, úteis a certos grupos ou gêneros de microrganismos
Fungos da Microbiota Amazônica Sucro-alcooleira e de Substratos Amiláceos: Conservação, Preservação e Aplicações Biotecnológicas.
Armazenamento de linhagens por congelamento a -80°C 
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Fungos da Microbiota Amazônica Sucro-alcooleira e de Substratos Amiláceos: Conservação, Preservação e Aplicações Biotecnológicas.
COLEÇÕES DE CULTURA – APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS
O crescimento acelerado da população mundial e as mudanças climáticas acentua a preocupação em relação à produção de alimentos, novos medicamentos, energia e conservação do meio ambiente. Neste sentido, a Biotecnologia apresenta grande contribuição, já que permite o desenvolvimento de novas e modernas técnicas
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 Na degradação de resíduos no meio ambiente: BIORREMEDIAÇÃO DE SOLOS TRATAMENTO DE EFLUENTES,
 No controle de pragas: ENTOMOPATOGÊNICOS
 Nas indústrias: ALIMENTOS , TEXTIL, QUÍMICA, DE CELULOSE E PAPEL, FARMACÊUTICA - COSMÉTICOS - NO DESENVOLVIMENTO DE NOVOS MEDICAMENTOS E TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO, ENTRE OUTROS. PRODUÇÃO DE ENZIMAS –Fenoloxidades, amilases, lipases, celulases, proteases, xilanases
 
 Na fixação de nitrogênio, 
Nestas técnicas,a utilização de microorganismos é constante e serve aos mais diversos fins, tais como:
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COLEÇÕES DE CULTURA – APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS
A exploração dos recursos naturais,realizada com a aplicação de técnicas biotecnológicas que utilizam microorganismos, permite a utilização de áreas consideradas inicialmente inaproveitáveis e o aumento da produtividade com sustentabilidade em áreas já exploradas,além de contribuir para o desenvolvimento de uma agricultura menos dependente de práticas que impliquem alto custo energético. 
 A aplicação dos microorganismos nas indústrias alimentícia, química, farmacêutica etc. permite processos mais eficientes e com melhor aproveitamento da matéria-prima. Isto permite a redução de custos, além de contribuir para um menor consumo energético e para a conservação ambiental.
Fungos da Microbiota Amazônica Sucro-alcooleira e de Substratos Amiláceos: Conservação, Preservação e Aplicações Biotecnológicas.
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INDÚSTRIA FARMACÊUTICA E DE COSMÉTICOS – Produção de antibióticos Ex. Penicilina produzida por Penicillium chrysogenum - Produção de vitaminas e outros Ex. Complexo B, ergosterol
INDÚSTRIA DE ALIMENTOS – Cogumelos comestíveis; Proteínas de unicelulares (leveduras);Flavorizantes de sopas e alimentos desidratados (Morchella hortensis); Produção de vinhos e cerveja; Produção de queijos; Ácido cítrico por Aspergillus niger; em Panificação como fermento biológico
Fungos da Microbiota Amazônica Sucro-alcooleira e de Substratos Amiláceos: Conservação, Preservação e Aplicações Biotecnológicas.
INDÚSTRIA DE BIOCOMBUSTÍVEIS – Bioetanol, Biodiesel
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COLEÇÕES DE CULTURA – APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS
As vantagens na aplicação de técnicas biotecnológicas que utilizam microorganismos propiciaram o reconhecimento da importância das coleções de culturas de microorganismos, bem como o aumento da demanda desse material por parte de universidades, institutos de pesquisa e empresas.
Para o pleno desenvolvimento destas oportunidades, é fundamental que culturas puras e autenticadas estejam prontamente disponíveis (em coleções ex situ) para o desenvolvimento de projetos tecnológicos, além de uma gama de conhecimentos associados, como procedimentos de isolamento, cultivo e manutenção dos organismos, bem como preservação de longo termo do material e suas características de interesse.
 
Fungos da Microbiota Amazônica Sucro-alcooleira e de Substratos Amiláceos: Conservação, Preservação e Aplicações Biotecnológicas.
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COMO OBTER UM MICRORGANISMO DE INTERESSE INDUSTRIAL ?
1.Isolamento a partir de recursos naturais 
 2. compra em coleções de culturas 
 3.obtenção de mutantes naturais 
 4.obtenção de mutantes induzidos por métodos convencionais 
5.obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas de engenharia genética 
Fungos da Microbiota Amazônica Sucro-alcooleira e de SubstratosAmiláceos: Conservação, Preservação e Aplicações Biotecnológicas.
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Fungos da Microbiota Amazônica Sucro-alcooleira e de Substratos Amiláceos: Conservação, Preservação e Aplicações Biotecnológicas.
ISOLAMENTO A PARTIR DE RECURSOS NATURAIS – é o mais importante meio de obtenção de linhagens de interesse industrial que podem conduzir tanto para as melhores produtoras, quanto para a descoberta de novos produtos. Envolve intenso trabalho experimental e um custo relativamente elevado. É necessário para o êxito da empreitada a definição do que se pretende.As empresas que mais investem nessa linha são fabricantes de antibióticos e ENZIMAS.
2.COMPRA EM COLEÇÕES DE CULTURAS – A compra em coleções é viável pelo número existente destas em diversos países e, é facilitada pela via eletrônica, entretanto, poucas são especializadas em vender linhagens com características de interesse industrial 
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Fungos da Microbiota Amazônica Sucro-alcooleira e de Substratos Amiláceos: Conservação, Preservação e Aplicações Biotecnológicas.
Segundo Cooney (l981) o crescimento de um microrganismo, assim como a formação de um produto ocorrem como reposta às condições ambientais, e deste modo é essencial a compreensão da relação que existe entre a regulação do metabolismo microbiano e seu ambiente físico e químico. 
Apresentar elevada eficiência na conversão do substrato em produto. 
Ter alta capacidade na produção de substância que atuem sobre a matéria-prima (substrato) -
Permitir o acúmulo do produto no meio, de forma a se ter elevada concentração do produto no caldo fermentado. Não sofrer inibição pelo produto, ser tolerante
Não produzir substâncias incompatíveis com o produto.Ex.produtor de enzimas produzindo proteases
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Apresentar constância quanto ao comportamento fisiológico. Ser geneticamente estável
Não ser patogênico Ex. usada em reatores de pequeno porte para obter produtos de alto valor agregado como vacinas.
Não exigir condições de processo muito complexas.Ter faixa de valores ótimos de pH e Temperatura.  desempenho em  [ ] de O2 , cresçam isoladamente,não formem espuma
Não exigir meios de cultura dispendiosos. Ex. adição de Y.E. peptona como fonte de N
Permitir a rápida liberação do produto para o meio. Excreção extracelular (recuperação do produto – 1a. Etapa = separação de céls. (centrifugação ou filtração) 
Fungos da Microbiota Amazônica Sucro-alcooleira e de Substratos Amiláceos: Conservação, Preservação e Aplicações Biotecnológicas.
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COLEÇÕES DE CULTURA DA UFAM
PARA APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS
Fungos da Microbiota Amazônica Sucro-alcooleira e de Substratos Amiláceos: Conservação, Preservação e Aplicações Biotecnológicas.
O isolamento, identificação, seleção, caracterização, conservação e uso de microrganismos é prática imprescindível para o desenvolvimento de processos e obtenção de produtos de interesse econômico
Bagaço
Vinhoto
Lodo/fermentado
Cana-de-Açúcar
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Fungos da Microbiota Amazônica Sucro-alcooleira e de Substratos Amiláceos: Conservação, Preservação e Aplicações Biotecnológicas.
Diluição Sucessiva
CLARK (1965)
1 mL
1 mL
1 mL
9 mL
9 mL
9 mL
10 mL
0,1 mL
0,1 mL
0,1 mL
Acompanhar a cada 24hs
 UFC
1:10
1:100
1:1000
Fermentado
Diluição Sucessiva
CLARK (1965)
1 mL
1 mL
1 mL
9 mL
9 mL
9 mL
10 mL
0,1 mL
0,1 mL
0,1 mL
Acompanhar a cada 24hs
 UFC
1:10
1:100
1:1000
Fermentado
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Plaqueadas por esgotamento, em estrias paralelas, na superfície do meio de purificação
ISOLAMENTO, PURIFICAÇÃO, SELEÇÃO E FERMENTAÇÃO
Fungos da Microbiota Amazônica Sucro-alcooleira e de Substratos Amiláceos: Conservação, Preservação e Aplicações Biotecnológicas.
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LEVEDURA
TERMOTOLERÂNCIA
[20; 27; 30; 35 e 42oC]
Ogawa, 2000
Ogawa, 2000
Lacaz, 2001
TOLERÂNCIA AO ETANOL
[glicose 1%+ EtOH (20% v/v) + Tampão Acetato Na 0,1M]
ZIMOGRAMA
[diferentes concentrações de sacarose]
Fungos da Microbiota Amazônica Sucro-alcooleira e de Substratos Amiláceos: Conservação, Preservação e Aplicações Biotecnológicas.
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Fungos da Microbiota Amazônica Sucro-alcooleira e de Substratos Amiláceos: Conservação, Preservação e Aplicações Biotecnológicas.
RESULTADOS
S: sem glicerol
G: com glicerol
B: bruto
T: tratado
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Fungos da Microbiota Amazônica Sucro-alcooleira e de Substratos Amiláceos: Conservação, Preservação e Aplicações Biotecnológicas.
PENICILLIUM
ASPERGILLUS
PROJETO CELULASES DA PETROBRAS – UFAM, UnB, UFRJ
33 isolados – identificados pela Doutora. Maria Inez de Moura Sarquis- FIOCRUZ/RJ
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Espécies de Fungos Filamentosos Isolados da Microbiota nativa de Bagaço, Meio Fermentado e Vinhoto da Cana-de-Açúcar da Usina Jayoro S/A.
Aspergillus ochraceus
Penicillium citrinum
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DO=0,5; ARTi=160 g/L; pH=5,5; T=30oC
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IDENTIFICAÇÃO DAS LINHAGENS DE LEVEDURAS
MACROMORFOLOGIA
MICROMORFOLOGIA
S6
S7
S9
S13
Fungos da Microbiota Amazônica Sucro-alcooleira e de Substratos Amiláceos: Conservação, Preservação e Aplicações Biotecnológicas.
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BIOTIPAGEM PELO SISTEMA KILLER
Legenda:	(+): linhagem sensível à levedura killer; 
		( -): linhagem neutra à levedura killer 			Resp.Dra. Sandra Ceccato-Antonini UFSCar
De acordo com Tosta (2004), resultados de sensibilidade a no mínimo 4 leveduras killer dentro do grupo formado pelas linhagens 008, 015, 118, 176, 195, 630 e 666; com resultados de neutralidade às linhagens 194 e 199, caracterizam as linhagens testadas como Saccharomyces cerevisiae.
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PCR
A amplificação da região ITS do DNA ribossomal permite a distinção interespecífica de leveduras. Leveduras da espécie Saccharomyces cerevisiae possuem região ITS por volta de 850 bp.
Fungos da Microbiota Amazônica Sucro-alcooleira e de Substratos Amiláceos: Conservação, Preservação e Aplicações Biotecnológicas.
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Fungos da Microbiota Amazônica Sucro-alcooleira e de Substratos Amiláceos: Conservação, Preservação e Aplicações Biotecnológicas.
BATELADA SEQÜENCIAL EM MEIO MELAÇO-VINHOTO COM CICLOS DE 6H
Concentração Inicial e Final de Etanol em Meio Melaço-Vinhoto no Processo Conduzido em Batelada Seqüencial com Ciclos de 6 horas. =0,40; No total de esferas=17.000; No de células/esferas= 3,38 x 107
Obs: As medidas foram realizadas em períodos de tempo de 24 horas
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SISTEMA CONTÍNUO 
Operação Contínua com Células de Levedura Imobilizadas em Reator de Leito Fixo para Produção de Etanol. ARTi= 80 g/L; F=320,0 mL/h; =0,40; D=0,65 h-1; t=1,54 h; No total de esferas=17.000; No de células/esferas= 3,38x107 
Fungos da Microbiota Amazônica Sucro-alcooleira e de Substratos Amiláceos: Conservação, Preservação e Aplicações Biotecnológicas.
Gráf2
		35.08		7.33
		33.46		9.79
		28.56		7.34
		41.38		4.71
		33.03		5.83
		35.31		7.62
		35.31		7.5
		40.13		8.99
		38.02		8.64
		36.33		7.19
		35.11		7.26
		35.51		10.6
		35.08		9.45
		28.87		12.36
		31.42		7.39
(EtOH)média = 34,84 g/L
(ART)média = 7,81 g/L
EtOH
ART
Tempo (h)
ART (g/L); EtOH (g/L)
Plan1
		1.8		7.333		21.26								10.63
		4		8.551
		8		7.069
		12		9.787		20.28								10.14
		16		9.045
		20		4.972
		24		7.342		19.04								9.52
		28		5.421
		32		4.615
		36		4.708		25.08								12.54
		40		5.498
		44		3.392
		48		5.833		20.02								10.01
		52		7.28
		56		7.386
		60		7.616		21.4								10.7
		64		7.051
		68		7.828
		70		7.492		21.4								10.7
		74		7.898
		78		7.139
		82		8.993		24.32								12.16
		86		7.563
		90		7.845
		94		8.64		23.04								11.52
		98		10.475
		102		7.863
		106		7.192		22.02								11.01
		110		7.757
		114		9.222
		118		7.263		21.28								10.64
		122		8.692
		126		11.887130		10.599		21.52								10.76
		134		7.986
		138		10.228
		140		9.451		21.26								10.63
		144		8.445
		148		8.957
		152		12.364		17.5								8.75
		156		8.728
		160		7.227
		164		7.386		19.04								9.52
		
		
		2		21.26		7.333						2		35.08		7.33
												12		33.46		9.79
												24		28.56		7.34
		12		20.28		9.787						36		41.38		4.71
												48		33.03		5.83
												60		35.31		7.62
		24		19.04		7.342						70		35.31		7.5
												82		40.13		8.99
												94		38.02		8.64
		36		25.08		4.708						106		36.33		7.19
												118		35.11		7.26
												130		35.51		10.6
		48		20.02		5.833						140		35.08		9.45
												152		28.87		12.36
												164		31.42		7.39
		60		21.4		7.616
		
		
		70		21.4		7.492
		
		
		82		24.32		8.993
		
		
		94		23.04		8.64
		
		
		106		22.02		7.192
		
		
		118		21.28		7.263
		
		
		130		21.52		10.599
		
		
		140		21.26		9.451
		
		
		152		17.5		12.364
		
		
		164		19.04		7.386
Plan1
		21.26		0
		20.28		0
		19.04		0
		25.08		0
		20.02		0
		21.4		0
		21.4		0
		24.32		0
		23.04		0
		22.02		0
		21.28		0
		21.52		0
		21.26		0
		17.5		0
		19.04		0
EtOH
ART
Tempo (h)
ART (g/L); EtOH (g/L)
Plan2
		
21,3 g/L
8,1 g/L
Plan3
		
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Valores de Rendimento e Produtividade das Fermentações conduzidas em Batelada Seqüencial e Contínuo em Meio Melaço-vinhoto com a Linhagem S7 de S. cerevisiae Imobilizada em Alginato de Cálcio 
Fungos da Microbiota Amazônica Sucro-alcooleira e de Substratos Amiláceos: Conservação, Preservação e Aplicações Biotecnológicas.
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Fungos da Microbiota Amazônica Sucro-alcooleira e de Substratos Amiláceos: Conservação, Preservação e Aplicações Biotecnológicas.
ISOLAMENTO, SELEÇÃO, CARACTERIZAÇÃO, IDENTIFICAÇÃO, PRESERVAÇÃO
Obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas de engenharia genética
Leveduras
Fungos Filamentosos
Bactérias
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Ensaios qualitativos,em Microtubos, para enzimas amilolíticas evidenciando amostras com produção negativa (azul) e positiva (amarelo)
Revelação, em placa, de ágar amido com vapor de iodo
ISOLAMENTO - substratos amiláceos, frutos, 
Fungos da Microbiota Amazônica Sucro-alcooleira e de Substratos Amiláceos: Conservação, Preservação e Aplicações Biotecnológicas.
SELEÇÃO - termotolerância, tolerância ao etanol, habilidade enzimática e fermentativas
Substrato amiláceo de macaxeira com presença de fungos amilolíticos
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Fungos da Microbiota Amazônica Sucro-alcooleira e de Substratos Amiláceos: Conservação, Preservação e Aplicações Biotecnológicas.
CARACTERIZAÇÃO – Ensaios Qualitativos para Amilases
IDENTIFICAÇÃO – Técnicas Tradicionais e Moleculares
PRESERVAÇÃO – Repique, Óleo Mineral e Blocos de Ágar em Água Destilada 		Estéril
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LINHAS DE PESQUISA
Produção de Álcool
Produção de Enzimas
Produção de Açúcares (Xilose)
Produção de Alimentos ou Bebidas Fermentadas
Produção de Antibióticos
Tratamento de Efluentes
Desenvolvimento Tecnológico com células livres e Imobilizadas
Fungos da Microbiota Amazônica Sucro-alcooleira e de Substratos Amiláceos: Conservação, Preservação e Aplicações Biotecnológicas.
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