CARACTERIZAÇÃO DA CAPACIDADE DE SUPORTE LINFOPOIÉTICO DAS CÉLULAS ESTROMAIS DO ÚTERO DE MURINOS

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Revista Eletrônica Novo Enfoque, ano 2010, v. 09, n. 09, p. 87 – 106 
 
 
 
CARACTERIZAÇÃO DA CAPACIDADE DE SUPORTE LINFOPOIÉTICO DAS 
CÉLULAS ESTROMAIS DO ÚTERO DE MURINOS. 
 
SILVA JUNIOR, H da. 
 
 
 
 
 
 
 
 88 
 Índice 
 
1- Introdução ............................................................................................................................... 89 
2- Hematopoiese Central ou Medular ....................................................................................... 90 
3- Hematopoiese Periférica ou Extramedular .......................................................................... 91 
4- Microambiente Hematopoiético ............................................................................................ 91 
5- O fenômeno da gravidez e a linfopoiese ................................................................................ 92 
Células NK e o IFN-γ ............................................................................................................... 93 
6- Modelos animais ...................................................................................................................... 94 
7- Objetivos .................................................................................................................................. 94 
8- Materiais e Métodos………………………………………….....…………………………….8 
Animais: ................................................................................................................................... 94 
Obtenção de células do estroma uterino ............................................................................... 95 
Obtenção de células não aderentes de medula óssea e coculturas ...................................... 95 
Obtenção de esplenócitos e produção de células LAK ......................................................... 95 
Citometria de fluxo .................................................................................................................. 96 
Tabela 1: marcadores para citometria ............................................................................... 97 
Irradiação γ das culturas celulares ........................................................................................ 97 
ELISA para GM-CSF de sobrenadante das culturas .......................................................... 97 
Imunocitoquímica .................................................................................................................... 98 
Tabela 2: anticorpos primários .......................................................................................... 99 
Tabela 3: anticorpos secundários ...................................................................................... 99 
RT-PCR .................................................................................................................................... 99 
Tabela 4: primers ............................................................................................................ 100 
9- Resultados .............................................................................................................................. 101 
Cultura e cocultura de células da medula óssea e do estroma uterino ............................. 101 
ELISA para GM-CSF ........................................................................................................... 101 
Imuncitoquímica .................................................................................................................... 103 
RT-PCR .................................................................................................................................. 104 
Citometria de Fluxo .............................................................................................................. 104 
 Perspectivas ............................................................................................................................ 104 
10- Referências ............................................................................................................................ 20 
 
 
 
 89 
1- INTRODUÇÃO 
 A viviparidade é uma característica peculiar que trouxe sucesso evolutivo aos mamíferos, 
mas também alguns problemas para a manutenção da homeostase. O estudo da gravidez humana 
demonstra um bom exemplo deste fato. O conhecimento detalhado deste processo fisiológico tão 
complexo torna-se cada vez mais necessário com o aumento do número de abortos espontâneos, 
do interesse pela reprodução assistida e relatos de que menos de 30% dos embriões têm 
capacidade de implantação. Muitas são as reações responsáveis pelas perdas dos conceptos e 
algumas destas estão relacionadas com o sistema imune, mais especificamente com as células 
natural killer (NK). 
 As células NK são uma linhagem de linfócitos citotóxicos considerados primitivos por 
sua atividade relativamente inespecífica. Elas compõem a imunidade celular inata e possuem 
muitas características em comum com Linfócitos T citotóxicos CD8+. Já foram descritas como 
uma das principais células secretoras de citocinas inflamatórias, dentre elas o IFN-γ (interferon-
gama), IL-2 (interleucina-2) e TNF-α (fator de necrose tumoral - alfa), e estão sendo apontadas 
como protagonistas de uma cascata de eventos que culminam numa boa implantação do embrião 
no endométrio. No entanto, esta capacidade inflamatória precisa ser cuidadosamente controlada, 
pois seus efeitos podem ser prejudiciais tanto para a saúde materna quanto fetal. 
 Numa breve descrição do importante papel destas células no processo de reprodução, é 
possível citar os seguintes eventos: 1- na implantação, a presença do IFN-γ faz com que haja um 
afrouxamento dos vasos sanguíneos do endométrio, o que facilita a formação da placenta 
hemocorial dos mamíferos eutérios; e 2- após a implantação bem sucedida é necessário que estas 
células sejam retiradas ou eliminadas deste sítio, para que não haja a possibilidade de rejeição 
imunológica da presença do feto que possui antígenos paternos, os quais não são reconhecidos 
pelas células imunes maternas como antígenos próprios da mãe. 
 A ocorrência de células NK já foi descrita em situações como: aborto espontâneo, pré-
eclâmpsia, eclâmpsia e mesmo no processo da expulsão do feto num parto normal. Em modelos 
animais, foi demonstrado que estas células estão envolvidas em reações imunes deletérias 
quando o sistema imune da mãe é estimulado por uma infecção durante a gravidez. Estas reações 
deletérias podem ser controladas pelo tratamento dos animais com interleucinas anti-
inflamatórias, tais como IL-4 e IL-10 ou com anticorpos contra IFN-γ, IL-2 etc. 
Um tecido hematopoiético, ou pelo menos linfopoiético, extramedular no útero também 
seria composto de toda a maquinaria necessária para suportar a diferenciação dos distintos tipos 
celulares. Isso inclui proteínas de matriz extracelular como laminina, fibronectina, colágeno etc, 
além de fatores formadores de colônias (CSFs). No tecido hematopoiético central, que é a 
medula óssea, as células estromais e seus componentes de matriz e CSFs são essenciais para o 
 90 
desenvolvimento das diferentes linhagens celulares. Pouco é conhecido sobre a influência destes 
componentes no ambiente uterino. Muito menos o efeito deles sobre o fenótipo destas células 
uNK. 
 
 
2- HEMATOPOIESE CENTRAL OU MEDULAR 
 
 O fenômeno da hematopoiese é caracterizado por eventos de diferenciação celular, os 
quais culminam na produção das linhagens celulares sanguíneas, a partir de um precursor 
comum denominado “célula tronco” (stem cell) (Till & McCulloch, 1980). Didaticamente a 
hematopoiese pode ser dividida em dois setores: a linfopoiese, onde prima a formação dos 
linfócitosB, células NK (natural killer) e precursores comprometidos com a linhagem dos 
linfócitos T, cuja diferenciação e maturação terminará no timo; e a mielopoiese que é 
responsável pela diferenciação e desenvolvimento dos eritrócitos e dos leucócitos, como os 
megacariócitos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, monócitos etc (Heyworth et al, 1988). 
 Cronológica e ontologicamente o tecido hematopoiético é primeiramente reconhecido em 
pequenas ilhotas sanguíneas na estrutura extraembrionária denominada saco vitelínico. Com o 
desenvolvimento do embrião, as células precursoras passam a migrar para as regiões 
intraembrionárias da AGM (aorta-gonada-mesonephron) e PAS (para-aortic splanchnopleura). 
Mais tarde, a produção hematopoiética se concentra no fígado e baço fetais, até que a medula 
óssea tenha maturidade suficiente para receber, manter e caracterizar-se como o sítio central da 
produção sanguínea (Dzierzak et al, 1998 e Cumano &Godin, 2001). 
 É importante ressaltar que o sucesso da cascata de reações que regem este processo de 
diferenciação celular, depende muito da “informação” fornecida às células precursoras. O 
microambiente no qual ocorre a hematopoiese cada vez mais se torna alvo de estudos, pois sua 
composição estrutural parece ser a chave para tamanha diversidade e capacidade de suportar o 
desenvolvimento desses tipos celulares (Dorshkind, 1990). 
 O objetivo desta dissertação é contribuir com o entendimento desta estrutura de apoio 
hematopoiético, denominada estroma, onde se pode mencionar alguns componentes como as 
células reticulares adventiciais, o endotélio vascular, moléculas de suporte (colágenos, 
fibronectinas, proteoglicanas etc.) e fatores solúveis, além de outros. Alguns destes citados serão 
analisados com maior detalhamento um pouco adiante neste trabalho. 
 
 91 
 
3- HEMATOPOIESE PERIFÉRICA OU EXTRAMEDULAR 
 
 Num organismo maduro e desenvolvido com situação fisiológica normal, a demanda e a 
produção sanguíneas estão em homeostase e ocorrem na medula óssea, como descrito acima. 
 Com o aprofundamento dos estudos no contexto da hematopoiese, observou-se que a 
produção celular pode ocorrer em sítios extramedulares, como já descrito em fígado e baço 
durante o desenvolvimento (embrião e feto). Numa infecção, numa patologia medular, numa 
disfunção do sistema hematopoiético, ou seja, em qualquer momento fisiológico desfavorecido 
no qual seja necessário um aumento da produção das células do sangue, os processos de 
diferenciação podem ser deslocados para sítios periféricos no intuito de suprir a nova demanda 
(Borojevic et al. 1983; Perez et al, 1993 e Alvarez-Silva et al, 1994). 
 Destes locais extramedulares nos casos de patologias, também estão o fígado e o baço, 
sugerindo uma manutenção da capacidade de suporte hematopoiético nestes órgãos. Além disso, 
recentemente está sendo demonstrado que muitos tecidos possuem células precursoras que 
passam por seus processos de desenvolvimento (relativamente semelhante à hematopoiese), 
como no cérebro, intestino, pele etc (Morrison, 2001). Talvez a capacidade de suporte da 
diferenciação celular não esteja restrito aos tecidos já bem caracterizados, como estes citados até 
aqui. Sendo assim, é preciso conhecer melhor sobre quais as necessidades estruturais de um 
microambiente para que este processo ocorra. 
 
4- MICROAMBIENTE HEMATOPOIÉTICO 
 
 Com um microambiente bastante estudado, a medula óssea apresenta uma organização 
complexa entre as trabéculas ósseas medulares. Estes espaços são recobertos por uma camada 
endosteal, formada por osteoblastos, e são muito irrigados por arteríolas e vênulas. 
Histologicamente encontram-se também uma estrutura complexa de redes de moléculas 
estruturais como colágeno, fibronectina e outras, que servem de suporte tanto para as células que 
ali habitam, quanto fatores solúveis que auxiliam nos distintos microambientes hematopoiéticos 
(Dorshkind, 1990; Wilkins et al, 1992 e Dzierzak et al 1998). 
 Toda esta maquinaria de sustentação também é composta por células. Dentre elas: 
miofibroblastos – fazem deposição de matriz extracelular e possuem capacidade contráctil; 
células reticulares adventícias – apoiadas nos seios venosos emitem prolongamentos que mantêm 
contato com células hematopoiéticas e outras estromais; fibroblastos – também depositam 
matriz; e tecido adiposo – relacionado com uma produção normal das células sanguíneas 
(Stevens & Lowe, 1995). 
 92 
 Através de um ponto de vista bem superficial, é importante pensar que o sucesso da 
hematopoiese só é alcançado quando todos os componentes até aqui citados estão relacionados 
diretamente. Ou seja, as moléculas de sustentação, células de suporte e células hematopoiéticas 
estão em contato íntimo entre si, além de estarem num microambiente onde a secreção de fatores 
de crescimento, por exemplo, afeta a fisiologia de todos. Sendo assim, quando o objetivo de um 
estudo é a diferenciação celular, é necessário caracterizar todo este microambiente e os efeitos de 
modificações induzidas sobre o sistema em questão. 
 
 
5- O FENÔMENO DA GRAVIDEZ E A LINFOPOIESE 
 
 O entendimento da manutenção da gravidez em animais eutérios requer algumas 
considerações na área da imunologia. O desenvolvimento de um organismo com antígenos que 
não são encontrados no organismo materno, já que o feto possui metade do genoma que vem do 
pai, intriga o sistema imune e os imunologistas. Várias teorias para o sucesso ou falha no 
processo do desenvolvimento completo do feto já foram propostas, mas nenhuma delas explica 
por completo este fenômeno tão impressionante da natureza. 
 Numa breve síntese, o embrião quando chega no endométrio inicia um processo de 
invasão intersticial em uns e destrutivo em outros mamíferos. Esta invasão põe o embrião em 
contato direto com o organismo da mãe. Isso deveria causar uma resposta imune pela mãe 
semelhante à causada contra um transplante. De fato, existem muitas modificações fisiológicas 
para garantir o sucesso da gravidez (Mellor & Munn, 2000). 
 No período pré-implantação, os componentes do esperma masculino já desencadeiam 
uma série de cascatas metabólicas que, dentre outras consequências, inicia uma reação 
inflamatória mediada por IFN-γ e outras citocinas, para que haja um remodelamento vascular e 
tecidual do endométrio (Ashkar & Croy, 1999). Com a implantação bem sucedida, o sistema 
imune da mãe precisa ser suprimido e então estas células NK e a produção de citocinas 
inflamatórias cessam e somente retornam próximo ao momento do parto (King, 2000). Em 
situações de aborto espontâneo e induzido este mesmo fenômeno também está relacionado, 
reforçando a importância de se entender como este processo é controlado. 
 93 
 
Células NK e o IFN-γ 
 
 As células natural killer são linfócitos citotóxicos que compõem a imunidade inata, 
considerados primitivos por exercerem suas funções imunes relativamente inespecíficas. Elas 
dividem muitas características funcionais com os Linfócitos T CD8+ citotóxicos, como a 
expressão de perfurina e granzimas (promotoras de morte programada nas células-alvo) nos seus 
grânulos citoplasmáticos. Entretanto, diferente dos CD8+, a ontogenia das células NK é menos 
centralizada. Já foi descrito o desenvolvimento desta linhagem no timo e medula óssea 
(Yokoyama, 1999). 
 Dentre as principais características destas células estão a ausência da expressão de CD3ε, 
receptores como os TCRs (T cell receptors) e cadeias associadas (CD4 e CD8), e estão mais 
relacionadas com respostas imunes a tumores (Yokoyama, 1999). Como descrito acima, as 
células NK do útero (uNK) possuem um papel importante no processo de implantação do 
embrião no endométrio materno. Umas das razõesmais bem descritas para esta participação é 
que estas células são as principais produtoras da citocina inflamatória denominada IFN-γ 
(Ashkar & Croy, 1999). 
 O aspecto mais relacionado a este projeto diz respeito ao controle exercido sobre as 
células NK na gravidez. Recentemente foi demonstrada a importância da presença das células 
NK no ambiente uterino durante períodos bem determinados fisiologicamente. Fora destas 
janelas temporais estas células já não são necessárias e passam a ser um perigo iminente para que 
uma gravidez dure a termo. Muitos autores demonstram que estas células são 70% dos leucócitos 
encontrados no endométrio nos períodos de pré-implantação e parto (King, 2000). 
 Em alguns trabalhos foi relatado o fato de que alguns modelos animais que possuem 
pouca ou nenhuma presença detectável destas células NK nos tecidos periféricos, as uNK estão 
presentes em números normais (Mellor & Munn, 2000). Além disso, foi demonstrado que as 
células NK periféricas, como no baço, possuem um perfil molecular “agressivo”, expressando 
grande densidade de CD16 e pouco ou nenhum CD56, portanto são CD16hi56-. Já as uNK são o 
inverso, CD16-56hi. No entanto, as duas populações possuem maquinaria citotóxica “abastecida” 
e pronta para atividade (King, 2000). 
 A origem das células uNK já foi relacionada com a medula óssea e baço. Porém, ainda 
não foi provada a capacidade de modulação destas células pelo ambiente uterino (Ashkar et al, 
2000). Mais que isso, não foi demonstrado se precursores linfóides são capazes de sofrer o 
processo de diferenciação que é sugerido ocorrer no timo, baço e fígado fetais e medula óssea, 
para a formação de células NK maduras no útero. 
 94 
 Neste projeto pretendemos avaliar a importância dos componentes do tecido uterino nesta 
modulação, ou mesmo numa possível capacidade do estroma uterino suportar a diferenciação 
destes linfócitos. 
 
6- MODELOS ANIMAIS 
 Dentre os vários modelos possíveis e factíveis para o desenvolvimento deste projeto, 
escolhemos o modelo de camundongos deficientes do receptor alfa para o interferon gama (IFN-
γRα-/-). Neste modelo já havia sido descrito uma incapacidade de responder aos estímulos do 
IFN-γ e o processo de implantação estava prejudicado por falha no remodelamento do tecido 
endometrial, apesar da presença das uNK (Ashkar et al, 2000). Como controle para os 
fenômenos que serão estudados, utilizaremos também animais das linhagens 129, C57Bl/6 e 
Balb/c. 
 
7- OBJETIVOS 
 Baseados nos dados acima apresentados, nossos objetivos neste projeto de doutorado são: 
• Caracterizar o microambiente uterino e analisar sua capacidade de linfopoiese in 
vitro; 
• Estabelecer as condições ideais de cocultivo de células do estroma uterino e 
células NK maduras; 
• Estabelecer as condições ideais de cocultivo de células do estroma uterino e 
células tronco ou precursoras (stem cells); 
• Avaliar e caracterizar os diferentes estágios de diferenciação das células NK 
relacionados com o estroma uterino. 
 
8- MATERIAIS E MÉTODOS 
 
Animais 
 
Camundongos das linhagens C57Bl/6, Balb/c e 129 Knockout para o receptor do 
interferon gama (IFN-γR-/-) e selvagem, utilizados em todos os experimentos, são obtidos a partir 
do Instituto Oswaldo Cruz, Centro de Pesquisas Gonçalo Muniz – Salvador – Bahia – Brasil, 
com idade entre 2 e 3 meses. Todos os animais são transportados e manipulados segundo as 
normas de uso de animais do CAUAP (Conselho de Avaliação do Uso de Animais de Pesquisas). 
 95 
Obtenção de Células do Estroma Uterino 
 
 Com auxílio de tesouras e pinças, os úteros das fêmeas de camundongos das 
linhagens estudadas são retirados e levados a uma placa de Petri de 60mm com meio de cultura 
DMEM (Sigma) pH7,4, preparado segundo o fabricante. Dos órgãos são retirados tecidos de 
gordura com seus vasos sanguíneos, ovidutos e ovários. Tudo isto para evitar ao máximo a 
contaminação da futura cultura com células que não façam parte do tecido uterino. 
 Após a limpeza do órgão ele é recortado em pedaços aleatoriamente e passam pelos 
processos de dissociação enzimática com colagenase IA 0,1%(Sigma). A primeira etapa de 
1h/37oC, da qual a população celular proveniente desta é descartada, já que existem muitos 
componentes ainda de tecidos não uterinos que não são passíveis de remoção manual. 
Já a população celular proveniente da segunda dissociação pela colagenase é levada a 
cultivo em meio DMEM (Sigma), suplementado com 10% de soro fetal bovino (Cultilab), 1mM 
Piruvato de sódio (Sigma), 2mM L-glutamina (Sigma), 1% aminioácidos essenciais (Sigma), 10-
5M β-mercaptoetanol (Sigma) e 1% penicilina/streptomicina (Life Technologies). 
 
 
Obtenção de Células Não Aderentes de Medula Óssea e Coculturas 
 
 Com auxílio de tesouras e pinças, os dois fêmures do camundongo são retirados, a 
cavidade medular é exposta e com auxílio da agulha numa seringa com meio de cultura, a 
medula óssea é expulsa por “flushing” em tubo Falcon de 15ml. A amostra é homogeneizada 
com a pipeta Pasteur em aproximadamente 5ml de meio D-MEM (Sigma), suplementado como 
descrito anteriormente. A suspensão é transferida para duas placas de Petri de 60mm, e esta é 
mantida a 37oC em estufa úmida com atmosfera de CO2 por 1h e ½, visando a diminuir a 
população das células aderentes. 
Após a incubação, a placa é levemente homogeneizada, transferindo o sobrenadante com as 
células não aderentes, para um tubo Falcon de 15ml, contendo Ficoll (Sigma) na densidade de 
1,077g/cm3, centrifugando por 30min/1500rpm, na tentativa de concentrar as células precursoras. 
As células são lavadas, contadas e cultivadas sobre uma monocamada de estroma uterino, obtida 
como descrito acima. 
 
Obtenção de Esplenócitos e Produção de Células Lak 
Baços dos animais em estudo são dissecados com assepsia e macerados com bulbo de 
seringa em uma peneira de malha fina apoiada dentro de uma placa de Petri com meio RPMI-
1640. Após a maceração as células são transferidas para tubos de 50ml e concentradas por 
 96 
centrifugação. As células obtidas do baço são ressoltas em 10ml de tampão de lise de hemáceas 
contendo 1mM KH2CO3, 150mM NH3Cl, 0,1mM EDTA em pH7,4 e incubadas por 10min à 
temperatura ambiente num tubo de 50ml. Após a incubação o volume do tubo é completado para 
50ml com meio RPMI-1640 e 10mM NaHCO3 pH7,4 para restabelecer a isotonicidade do meio. 
O tubo é submetido à centrifugação e o pellet ressolto em 4ml de meio de cultura RPMI-1640 
(Sigma), contendo 10% de soro fetal bovino (Gibco), 10mM NaHCO3 (Sigma) e 1% de 
penicilina/streptomicina (Gibco), pH 7,4 a 37oC. Esses 4ml de meio com células são aplicados 
numa coluna de lã de nylon, previamente preparada em uma seringa de 20ml, e incubada por 1h 
em estufa com 5% de CO2 a 37oC (Nuaïre). 
A lã é limpa numa incubação com H2O-3% HCl por 30min, depois lavada 3 vezes com 
água deionizada fervente. Só então desfiada, empacotada em seringa e esterilizada em autoclave 
20min a 120oC. Após o processo de esterilização da coluna a lã é umedecida com meio RPMI-
1640, 10mM NaHCO3 (Sigma) e 1% de penicilina/streptomicina (Gibco) pH 7,4, e depois 
embebida com meio de cultura RPMI-1640 (Sigma) contendo 10% de soro fetal bovino (SBF) 
(Gibco), 10mM NaHCO3 (Sigma), 1% de penicilina/streptomicina (Gibco), pH 7,4 a 37oC. O 
sistema de retenção da coluna é feito com uma válvula de três vias (Socimed – Socibra Ltda. - 
RJ). 
As células são eluídas com 50ml de meio RPMI-1640 (Sigma) contendo 10% de soro 
fetal bovino (Gibco), 10mM NaHCO3 (Sigma), 1% de penicilina/streptomicina (Gibco), pH 7,4 a 
37oC. O eluído é centrifugado e o pellet ressolto numa concentração de 2x106 células/mL de 
meio LAK (RPMI-1640 + 10% de sorofetal bovino + 10mM NaHCO3 + 1% de 
penicilina/streptomicina (Sigma) + 1% PHA-M (Sigma) + 1000 U/ml rIL-2h (CetusTM 
Corporation – Emeryville CA 94608) + 10-5M β-mercaptoethanol (Sigma), pH 7,4 a 37oC) e 
cultivadas 12-48 h em estufa com 5% de CO2 a 37oC (Nuaïre). 
 
Citometria de Fluxo 
 
Nesta etapa as células para estudo são mantidas o tempo todo a baixa temperatura (0oC a 
4oC). Em contagem na câmara de Newbauer (Sigma), as células são obtidas entre 105 e 106 por 
poço, lavadas duas vezes em PBS pH7,4 e concentradas por centrifugação em placas de 96 poços 
com fundo em U (Nunklon). A reação de marcação para citometria de fluxo inicia-se por uma 
incubação de 30min em PBS-BSA 3% para bloqueio de sítios inespecíficos. Logo após 
centrifugação, o anticorpo primário é devidamente diluído nesta mesma solução e adicionado a 
cada poço em questão, incubando-se por 30min. Lava-se então os poços com o mesmo PBS-
BSA 3% por três vezes de 5min, utilizando a centrifugação em cada passo. 
 97 
Quando em marcação direta as células são ressoltas em PBS-paraformaldeído 4% pH7,4 
e levadas ao citômetro de fluxo (BD – FACSCALIBUR) para análise, ou armazenadas a 4oC 
para futura análise em no máximo uma semana. Quando em marcação indireta, as células são 
submetidas à incubação de 30min ou com anticorpo secundário ou com streptavidina, todos 
associados com a devida combinação de fluorocromos disponíveis. Após esta terceira incubação 
as células sofrem o tratamento de fixação e análise, como citado acima. 
Tabela 1: Marcadores para Citometria 
Marcador Fluorocromo 
CD4 FITC e PE 
CD8 FITC e PE 
CD3 PE 
B220 FITC e PE 
NK1.1 BIOTIN 
Pan NK BIOTIN 
cKIT BIOTIN 
Thy1.2 BIOTIN e purificado 
CD16 FITC e purificado 
Streptavidin PE e FITC e TRICOLOR 
IgG de rato FITC 
 
Irradiação γ das Culturas Celulares 
As garrafas com cultura de células são irradiadas com 2500rads no irradiador gama com 
fonte de sal de césio (137Cs) do Departamente de Produtos Naturais em Farmanguinhos – 
FIOCRUZ – Rio de Janeiro. 
 
ELISA para GM-CSF de Sobrenadante das Culturas 
O teste de ELISA é procedido com o GM-CSF mouse ELISA system (Pharmacia) 
utilizando o sobrenadante das culturas de células, conforme o manual do fabricante. Em resumo, 
os poços a serem trabalhados com as amostras, são preparados com uma incubação de 2hs/37oC 
após adicionarmos 50µL do reagente de placa (fornecido no kit) e 50 µL das amostras. Estas 
placas, então, são lavadas cinco vezes de 400µL com o tampão de lavagem e adicionado 100µL 
do conjugado GM-CSF e incubadas 1h/37oC. As mesmas lavagens são feitas e adiciona-se 
100µL do substrato TMB, incubando 30min a temperatura ambiente (no escuro). Segue-se o 
processo de parada da reação adicionando 100µL do tampão de parada e determina-se a 
 98 
densidade óptica usando um espectrofotômetro a 450nm. Os resultados são plotados em gráfico 
logarítmico como recomendam as fórmulas de conversão do fabricante. 
 
Imunocitoquímica 
 
 As células são cultivadas por 5 dias sobre lamínulas de vidro, em placas de 24 poços 
(Nunclon), em baixa confluência (3 x 103 células por poço), em DMEM (Sigma) suplementado 
com 10% de soro fetal bovino (Cultilab), 1mM Piruvato de sódio (Sigma), 2mM L-glutamina 
(Sigma), 1% aminoácidos essenciais (Sigma), 10-5M 2-mercaptoetanol (Sigma) e 1% 
penicilina/streptomicina (Life Technologies). As células são fixadas com solução de 
paraformaldeído (Sigma) 4% em PBS pH7,4 durante 60 min/4oC. 
Após a fixação as células são lavadas 5 vezes em PBS pH 7,4 para retirar o fixador, as 
amostras são incubadas 30min em cloreto de amônio (NH4Cl) 50 nM em PBS, para neutralização 
e remoção dos grupamentos aldeídicos livres (Burke et al., 1982). A reação de bloqueio de sítios 
inespecíficos é feita numa incubação de 30min em PBS-BSA (Sigma) 3%. 
 A reação segue na incubação com anticorpo primário durante 90min, conforme tabela 
abaixo. Lava-se em PBS, 3 ou 4 vezes de 5min e incuba-se com o anticorpo secundário durante 
1h e 30min, conforme a tabela abaixo. Lava-se 3 ou 4 vezes em PBS e uma vez, rapidamente, em 
água destilada. 
As lamínulas são montadas em lâminas de vidro com N-propilgalato (Sigma) e 
observadas em microscópio de fluorescência (Zeiss) acoplado a um sistema de câmera 
fotográfica. 
 99 
 
Tabela 2: Anticorpos Primários 
Anticorpos Diluição 
policlonal antilaminina murina 1/100 
monoclonal anti-4-prolil-hidroxilase 1/100 
monoclonal antidecorina 1/100 
monoclonal antitubulina 1/100 
policlonal anticolágeno I 1/100 
policlonal anticolágeno IV humano 1/100 
policlonal antifibronectina 1/100 
monoclonal anti-α-actina de músculo liso murino 1/400 
policlonal antitrombospondina 1/100 
Soro normal de coelho (SNC) (usado como controle 
negativo) 
1/100 e 1/200 
Obs.: Para controle negativo dos anticorpos primários monoclonais, será utilizado PBS. 
 
Tabela 3: Anticorpos Secundários 
Anticorpos Diluição 
anti imunoglobulina (IgG) de coelho conjugado a tetrametilrodamina 
(TRITC) 
1/80 
Anti imunoglobulina (IgG) de camundongo conjugado a tetrametilrodamina 
(TRITC) 
1/80 
 
RT-PCR: 
O RNA total das células é extraído com Trizol (Gibco) conforme o protocolo do 
fabricante. Resumindo, um pellet de 106-107 células em um eppendorf de 1,5ml é ressolto 1ml de 
solução de Trizol. Após uma incubação de 15min à temperatura ambiente deste lisado, é 
adicionado 200µL de clorofórmio (Merk) e homogeneizado por 15seg, seguindo para uma 
centrifugação de 15min/14000rpm/≈14000g (Microspin 1450- Eppendorf). 
A fase aquosa transparente é transferida para um eppendorf novo e a ela é adicionado 
500µL de 2-propanol (Merk), seguindo uma incubação de 30min à temperatura ambiente. Após a 
fase de precipitação a solução é novamente centrifugada gerando um pellet, que é lavado com 
etanol (Merk) 70% a 4oC, centrifugado 5min/14000rpm/14000g e posto a secar. O pellet é então 
 100 
dissolvido em água. A concentração de RNA foi estimada pela leitura de absorbância em 
espectrofotômetro, dada em D.O (densidade óptica), no comprimento de onda de 260nm, 
multiplicado pelo fator 40 ([ ]µg/µL = 40 x DO x diluição do RNA). 
A retrotranscrição é feita com First Strand cDNA Kit (Pharmacia) segundo o protocolo do 
fabricante. Resumindo, o RNA utilizado tinha um valor na razão260nm/280nm, leitura em D.O., em 
torno de 1,8. Cerca de 3µg deste RNA total é utilizado para produzir cDNA (ácido 
desoxirribonucleico complementar) numa reação de 33µL com 6mM DTT, 0,2µg primers 
randômicos ou oligos-dT, 11µL mix reaction (First Strand cDNA Kit - Pharmacia). Esta solução 
é incubada 1h/37oC. 
A reação de polimerização em cadeia (PCR) é feita com 2µL da solução resultante da 
reação de retrotranscrição, como sugere o fabricante, ou com 10ng de DNA genômico. As 
condições e o ciclo térmico ideais para cada par de primers variou: 1,75-2,5µM MgCl2, 10µM de 
cada primer, 10µM de cada dNTP e 5U Taq polimerase recombinante (Gibco); e o ciclo térmico: 
4min/95oC, 40 vezes - 1min/94oC, 1min/55-57oC, 1min/72oC - 10min/72oC e 5min/4oC (PTC-
100 Progammable Thermal Controller). São utilizados primers (tabela 4 abaixo) para diferentes 
fatores, dentre eles citocinas e fatores formadores de colônia. 
 
Tabela 4: Primers 
primers sequência tamanho esperado 
β-actina 5´ GTGGGCCGCTCTTAGGCACCA 3´ 
5´ GCTCTTTAGGCTTTCCAGGAAGTC 3´ 
540pb 
GM-CSF 5´ AGAAGCTAACATGTGTGCAGACCCG 3´ 
5´ ATTCCAAGTTCCTGGCTCATCATTACGC 3´ 
313pb 
Cx 40 5´ 
5´ 
 
Cx 43 5´ 
5´ 
 
 
 101 
 
9- RESULTADOS 
 
Cultura e Cocultura de Células da Medula Óssea e do Estroma Uterino 
 O principal objetivo deste projeto é avaliar a capacidade de suporte da diferenciaçãoe/ou 
modulação das células NK por células que compõem o estroma do útero. Sendo assim, o 
primeiro passo foi a tentativa de estabelecer culturas celulares das células uterinas, in vitro. 
Culturas de medula óssea foram feitas em paralelo como um controle positivo desta técnica. 
 Todo material de experimento foi obtido como descrito e mantido em cultura com 
sucesso por mais de três meses. As células do estroma uterino ganharam morfologia de 
miofibroblastos, como esperado, e tinham grande capacidade proliferativa. As células estromais 
da medula óssea eram obtidas da cultura após cinco dias do cultivo de medula total. Depois deste 
período estas células eram repicadas a cada três dias pelo método de tripsinização, até que a 
cultura aparentasse maior homogeneidade morfológica. 
 Estas culturas de células estromais ganhavam confluência em cultivo muito rapidamente. 
Por isso, foi associado a elas um alto índice proliferativo, o que poderia ser prejudicial para um 
acompanhamento a longo prazo de coculturas induzidas para a diferenciação das células NK (a 
partir de precursores concentrados). Então, o próximo passo foi a irradiação gama destas 
culturas, na tentativa de frear esta alta proliferação e manter culturas estromais quiescentes em 
longa duração. Após a irradiação as culturas perderam quase totalmente a capacidade 
proliferativa e permaneceram aparentemente saudáveis durante todo o período acompanhado 
(pelo menos três meses). 
 O laboratório agora possui um protocolo bem estabelecido para obtenção e manutenção a 
longo prazo de cultura das células de suporte para futuros experimentos de cocultivo e 
diferenciação induzida in vitro das células NK. 
 
 
ELISA para GM-CSF 
 GM-CSF foi recentemente avaliado na linfopoiese (Muench et al, 2000). Muito já está 
descrito sobre os efeitos deste fator na diferenciação das linhagens mieloides. No entanto, pouco 
foi explorado no desenvolvimento dos linfócitos. 
 Além disso, dados da literatura indicam que o fator GM-CSF parece ser importante no 
processo de supressão imune durante a gravidez de cruzamento de modelos animais (Clark et al, 
1994 e Robertson et al, 1999). Ao mesmo tempo já possuíamos também informações de que 
citocinas como IL-2 são importantes no processo de diferenciação dos linfócitos citotóxicos. 
 102 
Então, para avaliarmos a capacidade secretora nas culturas previamente estabelecidas nas 
condições próximas ao descrito como normal da linfopoiese citotóxica, utilizamos culturas 
estimuladas ou não com IL-2 e dosamos a concentração de GM-CSF no sobrenadante destas 
culturas. 
 Culturas não estimuladas não apresentaram quantidades detectáveis deste fator. As 
estimuladas com interleucina-2 demonstraram uma grande quantidade de GM-CSF. No entanto, 
experimentos adicionais serão necessários para esclarecer se as culturas não estimuladas não 
possuem secreção ou o fator está formando complexos com componentes secretados da matriz 
extracelular. 
 Estas amostras vieram de culturas com quatro dias de cultivo suplementadas com 
interleucina-2, o que simula um dos muitos estímulos já descritos anteriormente como favoráveis 
para a produção de células NK a partir de precursores (King et al, 1999). As concentrações de 
GM-CSF encontradas nos sobrenadantes das culturas em questão estão expressas no gráfico 
abaixo. 
 A cultura de medula óssea total dos modelos animais da linhagem 129/IFNγR-/- e seu 
controle de reação, os “selvagens” 129, não demonstraram níveis detectáveis de GM-CSF em 
ELISA, como visto em 1 e 3. Quando estimuladas com IL-2, citocina ativadora de linfócitos 
citotóxicos, os níveis de GM-CSF subiram consideravelmente, como visto em 2 e 4. Como este 
fator já havia sido descrito como produto de secreção de linfócitos T, utilizamos a técnica de 
produzir células LAK para avaliar o efeito da estimulação nas células destes modelos animais em 
estudo. O sobrenadante da cultura de células LAK do IFNγR-/- possuía uma concentração muito 
maior que os sistemas anteriores e do que as células LAK de outra linhagem murina (Balb/c), 
como visto em 5 e 6. 
 Será necessário repetir estas culturas para confirmar estatisticamente o potencial secretor 
destas células, e adicionar os demais fatores envolvidos na diferenciação das células NK, como 
IL-15 e outros. Além disso, é preciso demonstrar que as culturas sem estímulo não possuem 
secreção deste fator ou se a secreção existe, mas as moléculas produzidas ficam retidas na matriz 
extracelular, geradas na cultura. 
 
 103 
ELISA GM-CSF
0
100
200
300
400
500
1 2 3 4 5 6
sobrenadantes
pg
/m
L
 
 
Imunocitoquímica 
 A hematopoiese medular conta com uma rede complexa de suporte denominada estroma, 
que trabalha em conjunto com as células hematopoiéticas (Dorshkind, 1990). O estroma possui 
componentes importantes como fatores solúveis, células acessórias, matriz mineral etc. Está 
amplamente descrito o grande papel destes coadjuvantes no processo homeostásico da 
diferenciação das células sanguíneas (Mazini et al, 1998). Como um dos nossos objetivos é 
averiguar o potencial do estroma uterino em eventos semelhantes, utilizamos a 
imunocitoquímica para iniciar a caracterização destas células. 
 A importância da composição de um microambiente que suporte a hematopoiese já foi 
exaustivamente confirmada nos diferentes sistemas estudados (Dorshkind, 1990 e Dzierzak et al, 
1998). Sendo assim, utilizamos a técnica de imunocitoquímica para caracterizar os componentes 
que formam este ambiente em nossos sistemas in vitro. Utilizando os anticorpos descritos em 
materiais e métodos, foi demonstrado que moléculas estruturais tanto da matriz extracelular 
quanto intracelular, como α-actina, 4-prolil hidroxilase, colágeno I, e tubulina tinham uma 
expressão bastante difundida na cultura de estroma uterino de animais C57Bl/6. No entanto, 
decorina e fibronectina foram pouco encontradas. Menos ainda trombospondina, colágeno IV e 
laminina. Já havia relatos positivos de imunocitoquímica para laminina na literatura. 
Trombospondina e colágeno IV eram esperados, mas talvez a expressão destes componentes seja 
mais tardia do que o analisado. 
 Estes resultados serão repetidos e acrescidos com novas reações nos diferentes modelos e 
marcadores. Assim, teremos condições de conhecer melhor e explorar experimentalmente o 
microambiente gerado nestas culturas numa futura cocultura de avaliação da influência deste na 
diferenciação das células NK. 
1. Medula óssea de 129 
2. Medula óssea de 129 + IL-2 
3. Medula óssea de IFNγR-/- 
4. Medula óssea de IFNγR-/- + IL-2 
5. LAK IFNγR-/- 
6. LAK Balb/c 
 104 
 
RT-PCR 
 Utilizamos a técnica de RT-PCR para complementar os dados do ELISA e da 
imunocitoquímica. Este método nos permitiu demonstrar que existe uma transcrição em níveis 
relativamente semelhantes de GM-CSF nas culturas anteriormente negativas para este fator livre 
no sobrenadante, reforçando a hipótese de que ele pode estar formando um complexo com a 
matriz extracelular. Ou mesmo, que as culturas estimuladas podem estar perdendo a estrutura da 
matriz e liberando o fator para o meio. 
 Outro conceito importante nos processos hematopoiéticos é o da importância das 
interações celulares. Uma das mais importantes destas interações são através das gap junctions. 
Esta técnica também demonstrou que os níveis relativos de expressão das conexinas 40 e 43 
parecem ser os mesmos na cultura de estroma uterino de C57Bl/6. Estes resultados somam na 
importância de caracterizar melhor este sistema in vitro. 
 
Citometria De Fluxo 
 Alcançar o objetivo final deste projeto, que é acompanhar o desenvolvimento das células 
NK num microambiente de estroma uterino,inclui a capacidade de caracterizar os diferentes 
estágios de diferenciação destas células. Para isso, utilizaremos a citometria de fluxo através de 
anticorpos associados a fluorocromos. 
 Em testes preliminares para conhecermos as peculiaridades de se trabalhar com células 
NK, utilizamos tanto células de medula óssea e células do baço como cultura de células LAK. 
Marcadores como CD3, CD4, CD8, CD16, B220, NK1.1 e outros foram testados nas células em 
questão. Entretanto, evidenciar a população de células NK não foi um processo fácil. Células NK 
maduras estão em pequena quantidade nos sistemas citados e não foi possível afirmar uma 
população homogênea destas. Outras fontes conhecidamente ricas nestas células, como fígado 
fetal, serão utilizadas futuramente para tal objetivo. 
Perspectivas 
 Deste ponto em diante pretendemos concretizar os resultados até aqui obtidos e 
prosseguir com as caracterizações celulares iniciadas nos modelos animais propostos. Esperamos 
com este projeto demonstrar que o estroma uterino é capaz de suportar a diferenciação das 
células NK, com todas as suas características fenotípicas maduras e funções citotóxicas normais. 
Além disso, pretendemos evidenciar a capacidade deste mesmo estroma na modulação dos 
marcadores fenotípicos das NKs periféricas. 
 Tudo isso, objetivando entender a relação materno-fetal a nível de tolerância imune, 
tentando explicar imunologicamente o fenômeno da gravidez marsupial e eutéria. 
 105 
 
10- REFERÊNCIAS 
ALVAREZ-SILVA, M.; PINAZO, A. C.; EL-CHEIKH, M. C.; BOROJEVIC, R. Myelopoietic 
competence of stroma composed of hepatic granuloma-derived connective tissue cells or skin 
fibroblasts. Braz. J. Biol. Res., 27: 2143-2152. 1994. 
ASHKAR, A.; CROY, A. Interferon gama contributes to the normalcy of murine pregnancy. 
Biol. Reprod., 61: 493-502. 1999. 
______. DI-SANTO, J.; CROY, A. Interferon gama contributes to initiationof uterine vascular 
modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine 
pregnancy. J. Exp.Med, 192(2): 259-269. 2000. 
BOROJEVIC, R.; SANTOS-DA-SILVA, C.; CARVALHO, E. A. Chronic schistossomiasis 
mansoni: splenic myelopoiesis and inhibition of neutrophil granulocytopoiesis mediated by sera 
of patients. J. Inf. Dis., 148(3): 422-426. 1983. 
BURKE, B.; GRITTIMS, REGGIO, M.; LOUVARD, D. & WARREN, G. A monoclonal 
antibody against a 135 K Golgi membrane protein. European Molecular Biology Organization 
Journal, 1982. 
CLARK, D.; CHAOUAT, G.; Mogil, R.; WEGMAN, T. Prevention of spontaneous aborption 
in DBA/2-mated CBA/J mice by GM-CSF involves CD8 T cell-dependent suppression of natural 
killer cytotoxicity against trophablast target cells. Cell. Immunol., 154: 143-152. 1994. 
CUMANO, A.; GODIN, I. Pluripotent hematopoietic stem cell development during 
embryogenesis. Curr. Opin. Immunol., 13: 166-171. 2001. 
DORSHKIND, K. Regulation of hemopoiesis by bone marrow stromal cells and their produts. 
Annu.Rev.Immunol., 8: 111-137. 1990. 
DZIERZAK, E.; MEDVINSKY, A.; BRUIJN, M. Qualitative and quantitative aspects of 
heamatopoietic cell development in the mammalian embryo. Imm. Tod., 19(5): 228-236. 1998. 
HEYWORTH et al. Response of Haemopoietic cells to growth factors: developmental 
implications of synergistic interactions cells. SCI, 1998. 
HUNT, J.; PETROFF, M.; BURNETT, T. Uterine lymphocytes: key players in pregnancy. 
Semin. Cell Dev. Biol., 11: 127-137. 2000. 
KING, A. Uterine Leukocytes and decidualization. Hum. Reprod. Up., 6(1): 28-36. 2000. 
______. GARDNER, L.; LOKE, Y. Co-stimulation of human decidual natural killer cells by 
interleukin-2 and stromal cells. Hum. Reprod., 14(3): 656-663. 1999. 
MAZINI, L.; WUNDER, E.; SOLAVAT, H.; BOURDERONT, D.; BAEREZUNG, M.; 
BACHORZ, J.; HÉNON, P. Mature acessory cells influence long-term growth of human 
hematopoietic progenitors on a murine stromal cell feeder layer. Stem Cells, 16:404-412. 1998. 
 106 
MELLOR & MUNN. Immunology at the maternal-fetal interface: lessons for T cell tolerance 
and suppression, 2000. 
MORRISON, S. Stem cell potential: can anything make anything? Curr.Biol., 11: R7-R9. 2001. 
MUENCH, M.; HUMEAU, L.; PAEK, B.; OHKUBO, T.; LANIER, L.; ALBANESE, C.; 
BÁRCENA, A. Differential effects of interleukyne-3, 7, 15 and granulocyte-macrophage colony-
stimulating factor in the generation of natural killer and B cells from primitive humanfetal liver 
progenitors. Exp. Hem., 28: 961-973. 2000. 
PEREZ, S. A. C.; SILVA, P. M. R.; MARTINS, M. A.; EL-CHEIKH, M. C.; CORDEIRO, R. S. 
B.; BOROJEVIC, R. Eosinophil granolocyte proliferation induced by an intermediate factor 
generated in the pleural cavityof PAF-acether-injected rats. Int. Arch. Aler. Immunol., 102: 368-
374. 1993 
ROBERTSON, S.; ROBERTS, C.; FARR, K.; DUNN, A.; SEAMARK, R. Fertility impairment 
in granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-deficient mice. Biol. Reprod., 60: 251-261. 
1999. 
STEVENS, A.; LOWE, E. Células do sangue. In: Histologia. Chapte.r 6: 67-81. 1995. 
TILL, J. E.; Mc CULLOCHE, A. Hemopoietic stem cell differentiation. Biochimica et 
Biophysica, Acta, 1980. 
WILKINS, B. S. Histology of normal haematopoiesis: bone marrow histology I. J.Clin.Pathol., 
45: 645-649. 1992. 
YOKOYAMA, W. Natural killer cells. In: Paul, W. Fundamental Immunology. 4th Ed. Chapter 
17: 575-603. 1999. 
 
	1- INTRODUÇÃO
	2- HEMATOPOIESE CENTRAL OU MEDULAR
	3- HEMATOPOIESE PERIFÉRICA OU EXTRAMEDULAR
	4- MICROAMBIENTE HEMATOPOIÉTICO
	5- O FENÔMENO DA GRAVIDEZ E A LINFOPOIESE
	Células NK e o IFN-(
	6- MODELOS ANIMAIS
	7- OBJETIVOS
	Animais
	Obtenção de Células do Estroma Uterino
	Obtenção de Células Não Aderentes de Medula Óssea e Coculturas
	Obtenção de Esplenócitos e Produção de Células Lak
	Citometria de Fluxo
	Tabela 1: Marcadores para Citometria
	Irradiação ( das Culturas Celulares
	ELISA para GM-CSF de Sobrenadante das Culturas
	Imunocitoquímica
	Tabela 2: Anticorpos Primários
	Tabela 3: Anticorpos Secundários
	RT-PCR:
	Tabela 4: Primers
	9- RESULTADOS
	Cultura e Cocultura de Células da Medula Óssea e do Estroma Uterino
	ELISA para GM-CSF
	Imunocitoquímica
	RT-PCR
	Citometria De Fluxo
	Perspectivas
	10- REFERÊNCIAS