Aula 09 genética (1)

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GENÉTICA
Aula 9 – Diagnóstico Molecular
Tema da Apresentação
Diagnóstico Molecular - Aula 9
GENÉTICA
A prática de diagnóstico de doenças genéticas através da análise de DNA tem se tornado frequente nos últimos 15 anos, graças aos avanços na pesquisa molecular. A transferência das técnicas desenvolvidas dentro do ambiente do laboratório de pesquisa para o consultório médico tem progredido substancialmente e hoje muitas doenças genéticas, tanto as hereditárias como fibrose cística, quanto as não hereditárias, como leucemia mielóide crônica, podem ser diagnosticadas através da análise molecular. 
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O diagnóstico molecular é uma poderosa ferramenta capaz de proporcionar informações fundamentais sobre a condição do paciente e seu prognóstico, podendo também em muitos casos auxiliar o médico na escolha do melhor tratamento para o paciente. Além disso, em muitos casos, o diagnóstico molecular pode indicar quais indivíduos são portadores de um determinado alelo mutante, mesmo que o indivíduo em questão não apresente qualquer sintoma. 
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Conteúdo Programático desta aula:
Diagnóstico molecular.
As etapas da técnica de PCR.
As técnicas moleculares com sua utilização para o diagnóstico.
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Os diagnósticos moleculares estão rapidamente sendo incorporados à prática médica, à medida que os genes responsáveis por doenças estão cada vez mais sendo identificados. Os testes diretos de mutação devem ser desenvolvidos e validados para cada gene. 
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A análise molecular pode ser realizada através de diferentes técnicas, que são definidas a partir de características moleculares específicas da doença em questão tais como ocorrência e frequência de mutações em determinadas populações, localização da mutação, características específicas do gene em questão, tipo de mutação (mutação pontual, grandes deleções, inserções, etc.), entre outras.
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Explorando o tema
Assista o vídeo 1: 
http://www.youtube.com/watch?v=rrkkCSK3QDU
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Uma ampla variação de técnicas é utilizada para a identificação de doenças genéticas. Todos os métodos têm vantagens e desvantagens e requerem considerável habilidade e experiência para serem realizados. Não existe uma padronização ou preferência geral por um método, mas os laboratórios devem ser conhecedores das limitações e sensibilidade dos métodos por eles usados. Para a realização do diagnóstico molecular é essencial que se conheça que gene, ou genes, são responsáveis pela ocorrência da doença.
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Técnicas Moleculares
• amplificação enzimática do DNA (PCR)
• digestão da fita de DNA genômico ou produto de PCR com enzimas de restrição
• separação eletroforética do DNA ou do produto de PCR
• hibridação do DNA ou fragmentos de PCR com sondas oligonucleotídicas.
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Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
O princípio básico da PCR está na capacidade de, a partir de quantidades mínimas de DNA, multiplicar uma determinada sequencia, de modo que esta se torne majoritária na amostra. Numa reação de PCR, o fragmento de DNA que desejamos multiplicar (ou amplificar) é chamado de fragmento alvo ou DNA molde e constituí um pedaço do gene que se pretende estudar (em nosso caso é o gene da beta-globina). 
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Além do DNA molde há também os oligonucleotídeos (também chamados de primers ou iniciadores) que nada mais são do que pequenos fragmentos de DNA complementares às extremidades da região que se pretende amplificar.
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A técnica de PCR tem provocado grande impacto nas principais áreas da biotecnologia: mapeamento gênico, diagnóstico molecular, clonagem, sequenciamento de DNA e detecção da expressão gênica. Atualmente, a PCR é utilizada para o diagnóstico de doenças genéticas, bem como na detecção de material genético presente em pequenas quantidades na amostra em análise. 
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Como exemplo, temos a detecção e identificação de material genético de vírus como o HIV (vírus da AIDS) e HPV (Papiloma vírus), assim como a detecção de organismos geneticamente modificados em produtos alimentícios.
A PCR permite a rápida amplificação de um gene específico ou de um EXON de um determinado gene como a primeira etapa para rastreamento de mutações não caracterizadas.
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Para a realização da técnica de PCR, é necessário os seguintes componentes:
Enzima – uma DNA polimerase termoestável que sintetize duas novas fitas complementares à sequencia alvo (geralmente uma Taq DNA polimerase)
Quatro dNTPs – A, G, C, T ( que funcionam como os “blocos para a construção” do DNA)
Molde ou template – contendo a sequencia alvo da PCR
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Dois pares de iniciadores ou primers – proporcionam os sítios de iniciação para a cópia da sequencia alvo
Solução tampão e sais – proporcionam o pH ideal e a força iônica para a atividade da enzima e da especificidade de hibridização do DNA
Cátion divalente – pode ser o íon Magnésio (Mg++) ou Manganês (Mn++) para ativar a enzima
Termociclador – aparelho capaz de fazer os ciclos térmicos necessários para que haja a amplificação do DNA.
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Termociclador para PCR
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A técnica de PCR se baseia em três etapas, que são:
1- Desnaturação: 94º C – 96º C: o molde de DNA, que é dupla fita, sofre desnaturação, formando duas fitas simples;
2- Anelamento: 37º C a 65º C: Quando a temperatura abaixa, os primers se ligam nos sítios de ligação específicos nas fitas simples de DNA para iniciarem a cópia;
3- Extensão: 72º C: a Taq DNA polimerase utiliza os dNTPs disponíveis na reação para adiciona-los nas fitas em crescimento, (A-T; G-C).
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Explorando o tema
Veja a o vídeo 2:
http://www.youtube.com/watch?v=_tXEX1WPDGo
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Como vamos analisar os resultados da PCR?
Bom, para analisar os resultados precisaremos realizar uma eletroforese em gel de agarose.
Explorando o tema
Veja a o vídeo 3.
http://www.youtube.com/watch?v=5ppWF0Y16r4
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A técnica de PCR apresenta várias aplicações, entre elas podemos citar: 
• A PCR permite a rápida amplificação de um gene específico, como a primeira etapa para rastreamento de mutações não caracterizadas;
• A PCR permite a rápida genotipagem de marcadores polimórficos;
• A PCR pode ser usada para ensaio de mutações conhecidas; 
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• A PCR pode ser usada para ensaio de mutações conhecidas 
• PCR alelo-específico
• A PCR pode ser usada para rastreamento de mutações e polimorfismos de DNA, a detecção de variação de sequencias no DNA é importante para a identificação de mutações que causam doenças em um determinado gene, bem comopara a detecção de polimorfismos de DNA.
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Análise com Enzimas de Restrição
Endonucleases também chamadas enzimas de restrição, são proteínas bacterianas que cortam em fragmentos a longa molécula linear de DNA. As enzimas de restrição são as principais ferramentas da tecnologia do DNA recombinante, usadas pelos biólogos moleculares na manipulação do DNA. São encontradas nas bactérias e são utilizadas para cortar o DNA de vírus que possam penetrar em seu citoplasma. 
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São proteínas que reconhecem e cortam o DNA em pontos específicos, geralmente em sequencias de 4 a 8 pares de bases, chamados palíndromos. Elas reconhecem sequencias curtas de bases nitrogenadas e clivam o DNA dentro ou na proximidade da sequencia de reconhecimento. Diferentes enzimas de restrição reconhecem e clivam diferentes sítios de restrição. Elas são indispensáveis na análise da estrutura dos cromossomos, no sequenciamento de DNA, no isolamento de genes, na criação de moléculas novas de DNA que podem ser clonadas e em técnicas como RFLP. 
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Uma característica marcante de muitos desses sítios de clivagem é que eles possuem uma dupla simetria rotacional, isto é, a sequencia de reconhecimento é palindrômica e os sítios de clivagem são simetricamente posicionados. 
Há 2 tipos distintos de clivagens: 
os dois cortes ocorrem no eixo de simetria da sequencia específica, gerando extremidades abruptas, ou 
os cortes são feitos simetricamente, porém, fora do eixo de simetria, gerando extremidades coesivas. 
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Os dois cortes ocorrem no eixo de simetria da sequencia específica, gerando extremidades abruptas.
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Os cortes são feitos simetricamente, porém, fora do eixo de simetria, gerando extremidades coesivas. 
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As setas indicam a ponte fosfodiester clivada pelas enzimas EcoRI e HindIII. 
A linha pontilhada indica o eixo de simetria do palíndromo. A linha laranja mostra o corte oblíquo das duas enzimas, que geram extremidades coesivas.
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Ação da enzima de restrição EcoR1, com geração de extremidades colantes e união de fragmentos de DNA de origens distintas.
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Explorando o tema
Assista os vídeo 4:
 http://www.youtube.com/watch?v=63rlngNR6_o
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Técnica de eletroforese de DNA
Os fragmentos gerados através da digestão por enzimas de restrição podem ser analisados através da técnica de eletroforese de agarose. Eletroforese é a técnica pela qual, fragmentos de DNA de diferentes tamanhos são separados. O DNA é carregado em um poço do gel (que tem aspecto de gelatina) e este é submetido a um campo elétrico. O DNA irá se mover na direção do polo positivo, uma vez que a molécula de DNA é negativa devido à presença de grupamentos de fosfato. 
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Durante a corrida eletroforética, os fragmentos de menor tamanho correm mais rapidamente que os fragmentos maiores e, deste modo, a posição relativa dos fragmentos no gel depende dos tamanhos dos mesmos. Após a corrida eletroforética, o gel deve ser tratado com um corante específico para que se possam observar os fragmentos de DNA.
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RESUMINDO...
Nesta aula vimos:
Um pouco sobre diagnóstico molecular das doenças genéticas; 
Algumas técnicas utilizadas no diagnóstico molecular.
Tema da Apresentação
A Psicologia e sua importância nas relações humanas 
A Psicologia e sua importância nas relações humanas