Técnicas Moleculares

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Tecnologia do DNA 
recombinante 
• Conjunto de técnicas para manipulação de ácidos 
nucleicos; 
• Clonagem de fragmentos de DNA em plasmídios de 
bactérias; 
• Seqüênciamento de DNA; 
• Amplificação de uma seq. Especifica de DNA pela técnica 
da reação em cadeia da polimerase (PCR); 
• Construção de bibliotecas genômicas e de cDNAs; 
• Vetores de expressão (procariotos e eucariotos); 
• Plantas transgênicas; 
• Animais transgênicos; 
Plasmídeos 
Plasmídeos são moléculas circulares de DNA 
pequenas (de 2.000 a 200.000 pares de bases) 
encontradas em muitas bactérias 
Enzimas de restrição 
Clonagem 
Clonagem 
Biblioteca 
genômica 
Biblioteca de 
cDNA 
Sequenciamento de DNA 
Sequenciamento automático 
Next Generation Sequencing 
Adaptado de Shendure & Ji , Nat. Biotech. 26(10), 2008. 
 in vitro cloning 
454 – PCR em emulsão 
Beads 
Illumina – Bridge PCR 
Flowcell 
Sequenciamento 
por síntese 
454 Pirosequenciamento 
Illumina 
Terminador 
reversível 
Sanger NGS 
Roche 454 – GS FLX 
Titanium 
 Illumina - GA IIx 
Next-generation 
sequencing 
 Pergunta Biológica???? 
Genoma de referência Genoma a ser montado Novo Genoma 
 Pergunta Biológica???? 
Leitura de uma seq de DNA 
0 u.m. 100 u.m. 
H P B H P 
11,9 u.m. 14,7 u.m. 
3.420 pb 
 egt lef-1 
AgMNPV 
Localização e clonagem 
do gene egt de AgMNPV. 
 1 ATTTGGTCCACATTAGTGTACTTGCACGGC 
 31 GCCATGTAGGGCGTCTATAAAATCGGGGTCACGGCTTTTTATTGTACACACTGTTTTAAA 
 91 GAGCAGCAGCAATTGAACTGCATTTACGATGATTTTTATTTTACTAACAACGCTTTTAGC 
 M I F I L L T T L L A - 
 151 AGTAAGCGGAGCAAAAACCGCAAATATTCTAGCGGTGTTACCCACGCCGGCTTATAGCCA 
 V S G A K T A N I L A V L P T P A Y S H - 
 HindIII 
 | 
 211 TCACCTGGTGTATCAAGCGTACGTGCAAGCTTTGGCAGACAAATGCCACAACGTGACCGT 
 H L V Y Q A Y V Q A L A D K C H N V T V - 
 271 GGTCAAGCCGCAACTTTTTGATTACGATGCGGCAAACAAACAACGCTGCGGTCGTATCGA 
 V K P Q L F D Y D A A N K Q R C G R I E - 
R4 
 331 GCAGATCGACGCAGACATGTCTTCGCAGCAATACAAAAAACTGGTGGCAAGTTCGGGCAC 
 Q I D A D M S S Q Q Y K K L V A S S G T - 
 
 
 1111 CGACGCTGTGGCAGCGTCTTTGGTGTTGCCTCGCAACGTAATTGCCCAAAAATGGTTTAA 
 D A V A A S L V L P R N V I A Q K W F N - 
 1171 TCAACGCGGCGTCCTTAACCACCCAAACGTTGTGGCGTTTGTTACGCAGGGCGGCCTACA 
 Q R G V L N H P N V V A F V T Q G G L Q - 
 1231 ATCCAGCGACGAAGCGTTACATGCGCGCGTGCCTATGGTGTGTTTGCCTATGATGGGTGA 
 S S D E A L H A R V P M V C L P M M G D - 
 1291 TCAATTTCACCATTCTGCCAAACTGGAACAATTTGGAGTCGCACGCGCATTAAACACTGT 
 Q F H H S A K L E Q F G V A R A L N T V - 
 PstI 
 | 
 1351 CACCGTTTCTGCAGCGCAACTCGCACTTGCAGTCGGCGACGTGATCGCCAACCGACTGGC 
 T V S A A Q L A L A V G D V I A N R L A - 
 1411 GTATCAATTGCGCATGACTGATTTACTCAACGTTGTAGCCTTCGACGAAGCCACGCCTGC 
 Y Q L R M T D L L N V V A F D E A T P A - 
 1471 TGATAAAGCTATCAAATTCACGGAACGCGTAATTCGATTCGGTCATGACATCACTCGGTC 
 D K A I K F T E R V I R F G H D I T R S - 
 1561 GGCGTGTTCGCTGAAATCACCATCCGCCAACACAGATTATTCAGATTATTTTGTACGCTT 
 A C S L K S P S A N T D Y S D Y F V R F - 
 1591 TCCATTGTAATGATTCATAATTACAGGATAAATTACCTAAATAAATACATGTAATACGCA 
 P L * 
 1651 AACATTGGTTTTTTTTTGCCC 1671 
 
Genoma AgMNPV 
Genoma AgMNPV 
Tabela de ORFs 
32 sod 25085 25537 > 150 29 147/150 (98%) 150
HR?
33 bro-d 25993 27012 > 340 101 247/333 (74%) 339
59 142/326 (43%) 320
34 iap-3 27053 27915 < 287 30 227/290 (78%) 280
35 27993 28670 > 242 31 184/225 (81%) 225
36 28708 29271 < 187 32 159/187 (85%) 187
37 29270 30652 > 460 33 434/460 (94%) 460
38 ac29 30687 30906 > 69 34 69/69 (100%) 69
ORF Name pos pos dir Size Def CfDEFNPV Def
aa orf Identity aa
1 polyhedrin 1 738 < 245 1 238/245 (97%) 245
2 829 1179 < 116 2 105/113 (92%) 130
3 lef-2 1247 1861 < 204 3 183/201 (91%) 203
4 1864 2130 < 88 4 26/96 (27%) 87
5 2178 2615 > 145 5 136/145 (93%) 145
6 bro-a 2674 3405 > 243 6 71/122 (58%) 336
7 bro-b 3417 4406 > 329 6 276/341 (80%) 366
8 ptp-2 4435 4917 < 160 7 147/159 (92%) 160
9 ptp-1 4904 5428 < 174 8 164/174 (94%) 173
hr?
10 5686 6669 > 327 9 297/328 (90%) 328
11 bro-c 6704 7735 < 343 101 274/359 (76%) 339
hr?
12 pif-2 (ac22) 8381 9529 < 382 10 369/382 (96%) 382
13 arif-1 9556 10536 > 326 11 283/311 (90%) 321
14 10657 10971 < 104 12 98/104 (94%) 104
15 10989 12032 > 347 13 328/347 (94%) 347
16 12107 12742 < 211 14 201/211 (95%) 211
17 odv-e26 12708 13355 < 215 15 200/212 (94% ) 215
18 egt 13532 15013 < 493 16 472/493 (95%) 439
19 lef-1 15097 15858 > 253 17 234/250 (93%) 251
20 38.7k (ac13) 15789 16763 > 324 18 310/324 (95%) 322
21 16787 17230 > 147 19 43/46 (93%) 60
20 58/129 (44%) 129
hr?
22 F protein 17612 19570 > 652 21 602/652 (92%), 652
23 ac38 19697 20344 > 215 22 189/200 (94%) 201
24 lef-11 20274 20690 > 138 23 113/121 (93%) 129
25 39k/pp31 20630 21427 > 265 24 254/265 (95%) 263
26 ubi 21555 21791 < 78 25 73/76 (96%) 77
27 21808 22419 > 203 26 190/203 (93%) 203
28 hisP 22422 22968 > 181 27 170/181 (93%) 181
29 fgf 23022 23577 > 184 28 165/183 (90%) 184
30 ctl 23607 23799 > 64 NF
31 parp-like 23857 24966 < 369 NF
L polymerase 
NSM movement protein 
G1/G2 glycoproteins 
N nucleocapsid 
NSS supressor 
silenciamento 
 
Genome and expression strategy of TSWV 
BR-01 (Brazilian isolate) 
Type species - Tospovirus 
Análise filogenética 
AgMNPV
CfDEFNPV
EppoMNPV
OpMNPV
CfMNPV
RoNPV
AcMNPV
BmMNPV
MacoMNPVA
MacoNPVB
SeMNPV
HaNPV
HaSNPV
HzNPV
LdMNPV
SpltNPV
AhNPV
CpGV
CrleGV
PoGV
AdorGV
PxGV
XnGV
NlNPV
NsSNPV
CuniNPV
Hze1
GV
Group II NPV
Group I NPV
Lepidoptera
Lepidoptera
Hymenoptera
Diptera
 Brazil: Paradise of Tospovirus 
 BA-Ju1 
 PE-Pt6 
 PE-Pt5 
 PB-Cg1 
 PB-Cg3 
 PE-Pt2 
 PE-Pq2 
 RN-Mo1 
 PB-Cg2 
 PE-Pt7 
 PE-Pt1 
 PE-Pt3 
 PE-Pq3 
 MG-Ig1 
 BA-Se1 
 RJ-Sf1 
 BA-Ju2 
 PE-Be1 
 PE-Pq1 
 PE-Pt4 
 MG-Ig2 
 TYVSV 
 CGMV 
 BGMV 
 LBGMV 
 MG-Bi1 
 MGMV 
 SGMV 
 DF-Br1 
 TGMV 
 MG-Ub1 
96 
96 
75 
96 
95 
96 
96 
96 
90 
79 
95 
92 
92 
96 
52 
92 
93 
96 
95 
96 
96 
49 
90 
69 
54 
92 
74 
56 
Tomato chlorotic vein virus (TClVV) 
Tomato crinkle virus (ToCrV) 
Tomato severe mosaic virus (TSMV) 
Tomato chlorotic mottle virus (ToCMV) 
Tomato mottle leaf curl virus (TMoLCV) 
Tomato rugose mosaic virus (ToRMV) 
Tomato infectious yellows virus (TIYV) 
Begomovirus Survey
Seabra
Petrolina
Juazeiro
Campina Grande
Mossoró
Pesqueira
Belmonte
Bicas
Igarapé
Brasília
Uberlândia
São Fidélis
Várzea Alegre
Paty do Alferes
 BA-Ju1 
 PE-Pt6 
 PE-Pt5 
 PB-Cg1 
 PB-Cg3 
 PE-Pt2 
 PE-Pq2 
 RN-Mo1 
 PB-Cg2 
 PE-Pt7 
 PE-Pt1 
 PE-Pt3 
 PE-Pq3 
 MG-Ig1 
 BA-Se1 
 RJ-Sf1 
 BA-Ju2 
 PE-Be1 
 PE-Pq1 
 PE-Pt4 
 MG-Ig2TYVSV 
 CGMV 
 BGMV 
 LBGMV 
 MG-Bi1 
 MGMV 
 SGMV 
 DF-Br1 
 TGMV 
 MG-Ub1 
96 
96 
75 
96 
95 
96 
96 
96 
90 
79 
95 
92 
92 
96 
52 
92 
93 
96 
95 
96 
96 
49 
90 
69 
54 
92 
74 
56 
Tomato chlorotic vein virus (TClVV) 
Tomato crinkle virus (ToCrV) 
Tomato severe mosaic virus (TSMV) 
Tomato chlorotic mottle virus (ToCMV) 
Tomato mottle leaf curl virus (TMoLCV) 
Tomato rugose mosaic virus (ToRMV) 
Tomato infectious yellows virus (TIYV) 
Reação em cadeia da polimerase 
(“PCR”) 
Análise da Reação de PCR em Gel 
 Design of a Polymerase Chain 
Reaction 
for Specific Detection of Corn Stunt 
Spiroplasma. 
PCR MRFV PCR MBSP PCR CSS ???? 
Detection of Corn Stunt Complex 
Amplification of Spiralin gene 
sequences from in vitro cultivated 
strains of S. kunkelii. 
M
 
M
B
S
 +
 C
S
S
 
M
B
S
 +
 C
S
S
 
M
B
S
 
M
B
S
 
C
S
S
 
C
S
S
 
Specific detection of MBS and CSS in 
Multiplex PCR. 
Análise de restrição 
Maruinak et al., (1999) 
CARACTERIZACION BIOLÓGICA Y MOLECULAR DE 
AISLAMIENTOS DEL VIRUS DEL MAL DE RÍO 
CUARTO 
 
 
 
María de la Paz Giménez Pecci, MSc. 
 
• IFFIVE, INTA: Dra. Irma G. Laguna; Dr. Luis Conci; Dra. Graciela Truol. 
• U.N.Brasilia, Brasil: Dr Renato Resende. 
• JICA. Japón: Dr Seiji Kanematsu. 
• INIA, España: Dr. Fernando Ponz Ascaso. 
 
 
Variabilidad del virus del Mal de Río Cuarto MRCV 
 
 
 
 
 
Es variable el MRCV ? 
Hay variantes biológicas ? 
Cuál es la diversidad genética ? 
 
Aislados tipo del virus 
del Mal de Río Cuarto 
Tafí del Valle 
Jesús María 
Río Cuarto 
Pergamino 
dsRNA PAGE 
de los 4 “aislados tipo” mantenidos en 
invernadero 
 M JM RC P TV 
 
20000 pb 
 
2000 pb 
 
4000 pb 
 
6000 pb 
 
 M JM RC P TV M JM RC P TV 
 20000 pb 
 
2000 pb 
 
4000 pb 
 
6000 pb 
 
Jesús María 
 Variabilidad de poblaciones del MRCV 
 Geles de muestras de maíz de Campo 
2002 
2003 
Villa del Rosario 
2000 
Realicó 
2003 
2003 
Tafí del Valle 
Río Cuarto 
2000 
2001 
 
1997 
Hibridização 
• Ácido nucleico em suporte sólido 
(nitrocelulose ou náilon) 
• fixar ácido nucleico (80C ou UV) 
• pré-hibridização 
• hibridização (65C, ON) 
• lavagem 
• detecção 
Hibridização 
T C G G C G T 
T C G G C G T 
A G C C G C A 
T G A A A T C 
* 
* 
DNA viral 
DNA da planta 
Sonda 
Sonda 
Nitrocelulose/náilon 
Hybridization 
Southern and Northern-blot 
“dot-blot hybridization 
Eletroforese 
Agarose 
Poliacrilamida 
- 
+ 
corrente 
Visualização: 
 
Et-br 
cristal violeta 
SYBR 
Prata 
Northern blotting 
 
RNA 
Southern blotting 
 
DNA 
Vetor de expressão 
Plantas transgênicas 
Using R genes as transgenes in other plant species. 
Example: tomato Sw-5 gene in tobacco 
control 
Transgenic resistance 
Resistant Genotypes to 
PepYMV 
Animais Transgênicos