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Áreas da Hematologia
Hemoterapia
Hematologia Benigna
Onco-hematologia
Transplante de Células Tronco
O que são Células-tronco?
 São células indiferenciadas que são “produtoras de células” necessárias para geração, homeostasia e reparo tecidual. Caracterizam-se por:
Divisão por longos períodos
Auto-renovação: Capaz de dividir-se sem diferenciar-se originando célula filha que mantém todas as características da célula mãe
Diferenciação: Capaz de produzir progene madura, específica para a necessidade daquele tecido (especializada)
O que são Células-tronco?
 
AUTO-RENOVAÇÃO
DIFERENCIAÇÃO
Divisão da CT
Simétrica
Asimétrica
Atividade da telomerase (não é suficiente)
Encurtamento, pp se divisão sob estresse
Disqueratose congênica => pancitopenia
Finally, the self-renewal potential of HSCs is thought to be partially associated with the activity of telomerase, a reverse transcriptase which makes new telomeric DNA. Telomeric shortening during cell division is secondary to incomplete replication of the lagging strand by the conventional DNA polymerase during chromosomal replication and is associated with replicative senescence.[16] However, despite the fact that HSCs express some telomerase activity, replication of HSCs is finite, as they can be serially transplanted only five to seven times in mice.[17] 
In humans, HSCs also undergo telomeric shortening after repetitive cell division, particularly when occurring under stress, such as during transplantation,[18] though this does not seem to have clinical relevance to date. These observations suggest that the telomerase activity in HSCs, although endowing them with substantial self-renewing potential, may not be sufficient to prevent telomeric shortening during the stress of replication. Further evidence for this comes from disease states such as dyskeratosis congenita where inherited defective telomerase activity is associated with bone marrow failure. In aplastic anemia and paroxysmal nocturnal hemoglobinuria a correlation between telomere shortening and the degree of pancytopenia has also been found; however, whether this is a consequence of increased HSC turnover or caused by a telomere-mediated replicative exhaustion of the HSC pool remains to be answered.
massa cellular interna (30-40 células)  formará o embrião (epiblasto)
Contem cels pluripotentes: cada célula possui o potencial de dar origem a tipos de células que se desenvolvem em cada uma das três camadas embrionárias de células germinativas (mesoderme, endoderme e ectoderme) e se adoptively transferido para um destinatário blastocisto, as células da massa celular interna do doador podem contribuir para a formação de todos os tecidos pertencentes ao embrião quimérico resultante
Categorias de Células Tronco
Tipos CT
Exemplo
Potencial
Fontes
Exemplos
Totipotente
Todas as células embriônicas, extraembriônicas e células adultas
Embrião precoce antes do estágio de 4 células
Zigoto
Cada célula do estágio do embrião de 2 ou 4 células
Pluripotente
Todas as células embriônicas e células adultas
Embrião precoce: mórula e blastocisto
Epiblasto
CT embriônicas (3 camadas)
Células pluripotentes induzidas
Multipotente
Restrita a linhagens específicas
Cordão umbilical
Feto
Corpo do adulto
CT hematopoiéticas
CT Mesenquimais
CT neurais
CT pele
Unipotente
Única linhagem (gamestas)
Linhagem germinativa
Espermatogônia
Ovogônia
Thomas’ Hematopoietic Stem Cell Transplantation, 4th eddition, 2009
Multipotente
autorenova
diferenciac
vários tipos
Tecidos somaticos adultos
Unipotente
-autorenova
-dierenciac
-único tipo
CÉLULA TRONCO HEMATOPOIÉTICA
e Heterogeneidade das Células do Sangue
Fisiologia Médica – UnB
Hematologia – Aula 1
Flávia Dias Xavier
Brasília, 11 de janeiro de 2013
Dr. E. Donnall Thomas
Pai do transplante de medula óssea
Nobel de Medicina em 1990, por ter sido pioneiro no TMO em pacientes com leucemia
 morreu no dia 20 de outubro, em Seattle, nos Estados Unidos, aos 92 anos de idade, 2012.
10
Conceitos importantes
Células tronco não é igual a célula tronco hematopoiética (CTH)
A maioria dos estudos CTH são em animais (camundongos, peixe zebrafish, coelho...)
Onde o sangue é produzido?
Saco Vitelínico
Região AGM (aorto-gonodo-mesonefro)
Placenta
MEDULA ÓSSEA
 Óssos chatos (esqueleto axial):
 Esterno
 Crânio
 Costelas
 Vértebras
 Escápula
 Pelvis
 Parte esponjosa da epífise dos óssos longos (fêmur e húmero) 
Medula Óssea Vermelha
Com 5 a 7 anos a MO vermelha dos óssos longos é substituída pela MO amarela, ficando a vermelha restrita às epífises.
Biópsia de Medula Óssea
Avaliar celularidade
Mielograma
Crista ilíaca posterior
Região esternal
Anterior da Tíbia
(<18meses)
O que é Hematopoise?
Processo de formação, desenvolvimento e diferenciação dos elementos formadores do sangue
Origina-se células-tronco hematopoiéticas (CTH)
↓
Auto-renovação
Diferenciação nas linhagens maduras do sangue
Reconstituir hematopoiese no receptores letalmente irradiados
MULTIPOTENTES
ASH-SAP, Chapter 2, 2008
 hematopoietic system comprises a hierarchy of cell types with differing capacities for proliferation and differentiation
16
Sangramento
PTI
Trombose
TE
Infecção
Neutropenia cíclica
LMC
LN
anemia
PV
MM
Linfopenia
HIV
Linfoma T
Linfoma B
Linfopenia
LLA
LMA
Leucemia indiferenciada
Aplasia de MO
HSCs are rare, occurring at a frequency of 1 stem cell per 10,000 to 100,000 bone marrow (BM) cells. Under steady state, HSCs are quiescent (ie, noncycling), and only a fraction of the HSCs enter into the cell cycle to proliferate and give rise to differentiated progenitors. However, in response to hematopoietic stress (eg, infections, acute bleeding, or chemotherapy), HSCs proliferate extensively. Self-renewal and differentiation are tightly regulated processes which ensure homeostasis. Deregulation of these processes will inevitably manifest as myeloproliferative diseases (such as acute myeloid leukemia) or as bone marrow failure syndromes (such as aplastic anemia). Understanding the cellular biology of HSCs is therefore essential.
Fontes
Célula tronco de sangue periférico (aférese)
Célula tronco de medula Óssea
Células tronco de Cordão
CN: 2x108/Kg
CD34+: 2,8x106/Kg
Mínimo: 2x108 TNC/Kg
CN: 9x108/Kg
CD34+: 7x106/Kg
Mínimo: 2x106 CD34/Kg
CN: 0,3x108/Kg
CD34+:0,2x106/Kg
Mínimo:3-5x107 TCN/Kg
Quantificação das Células CD34+ por Citometria de Fluxo
An initial gate (R1) (Figure 1: plot 1) is set on a CD45 vs. SSC dot plot, so as to contain all CD45+ events including CD45dim and CD45bright
This will exclude CD45– events (i.e. red blood cells, platelets and other debris). The events in gate R1 are then displayed on a CD34 vs. SSC dot plot (Figure 1: plot 2) and a second gate (R2) produced to include the cluster of CD34 + events (Figure 1: plot 3). The third plot is obtained by plotting the events that fulfil the criteria of gates R1 and R2 (i.e. sequential gating) (Figure 1: plot 3). Cells forming a cluster with characteristic low SSC and low to intermediate CD45
fluorescence are then gated on this third plot to produce a third region (R3) (Figure 1: plot 3). Ungated data are displayed on a CD34 vs. CD45 histogram to establish the
lower limit of CD45 expression by the CD34+ events (Figure 1: plot 5). Finally, the events fulfilling the criteria of all three gates (R1, R2 and R3) are then displayed on a forward light scatter (FSC) vs. SSC dot plot to confirm that the selected events fall into a generic ‘lymph-blast’ region (R4) (Figure 1: plot 4). This region (R4) is precisely set to include events no smaller than lymphocytes by back scattering a small number of lymphocytes from plot 1 (Figure 1: plot 6) (high CD45 staining low side-scatter). Any events falling outside region R4 are excluded from the final calculation.
Molécula de adesão sialomucina-like
1-5% mononucleares
CHT e CP
CE vascularesFibroblastos
Enumerar CTH
Dose do transplante  resultado
Pode ser gerada a paritr de CD34-Lin-CD38-CD133+CD7- (muito primitiva e rara (0.02%))
Imunofenótipo das CTH
Não exaure
Exaustão
Explicar expansão LT x ST = reconsitui hematopoiese sem exaustão x com exaustão
Embriologia e Hematopoiese
Gastrulação
Mesoderma extra-embrionário do saco vitelínico (3ª sem) vasos
1ª ONDA: HEMATOPOISE PRIMITIVA
(extra-embriônica)
Mesoderma prolifera  massa mesoderma  ilhotas  cels centrais acumulam Hb já na circulação (epsilon=Beta like feto Ag e Gg  adulto alfa e beta, troca por eritroid kupper like factor/ EKLF)) e perifericas achatam para formar endotelio
1ª onda: hematopoeise primitiva
Mesoderma
Vasos: Grastrulação – 3ª semana
Eritroblastos e macrófagos – 5ª semana
BFU-E & CFU-GM & precursor de mastócitos  migram para fígado onde diferenciam
Não contem células capazes de enxertia em adulto irradiado multi-linhagem por toda a vida (“conceito vem mudando...)
Região 
2ª ONDA: HEMATOPOISE DEFINITIVA
Região para-aorta-esplancnopleura/aorta-gônada-mesonefro
(intra-embriônica) 
CTH: Células endoteliais (endotélio hemogênico) da parte ventral aorta dorsal
Fetal Tardio
2ª onda: hematopoiese definitiva
Endotélio da aorta dorsal (fetal tardio)
Contem células (CTH) capazes de enxertia em adulto irradiado multi-linhagem por toda a vida
Fig 1  
 (a). Within the developing embryo, the first intraembryonic site to exhibit hematopoietic activity is the para-aortic splanchnopleura and subsequent aorta–gonad–mesonephros (AGM) region (days 9.5 to 12.5 postcoitum in mice), which comprises the dorsal aorta and its surrounding splanchnic mesoderm (b). Recent consensus indicates that definitive hematopoietic stem cells (HSCs) emerge from hemogenic endothelium in the aorta's ventral floor. This process may involve budding of HSCs into the aortic lumen (1) or the abluminal bending of endothelial cells into HSCs (endothelial hematopoietic transition), so that they appear in the surrounding mesenchyme (2) [16]. Circulation of the HSC progeny results in robust engraftment in subsequent sites of hematopoiesis (3). In addition, multipotent mesoangioblasts, devoid of hematopoietic potential, reside in the roof and lateral walls of the dorsal embryonic aorta. Although their developmental role is unclear, these cells may accompany newly branching blood vessels into other tissues (4)  http://www.springerimages.com/Images/RSS/1-10.1007_s12265-010-9248-9-0
Teorias da origem da CTH
Hueno H et al. Blood lines from embryo to adult. Nature, v. 446, p. 996-997, 2007.
Samokhvalov IM et al. Cell tracing shows the contribution of the yolk sac to adult haematopoiesis. Nature 446, p. 1056–1061, 2007.
Origens da CTH:
1. Migração a partir do saco vitelínico
Origem transitória x
Maturação (AGM)
2. Tanto saco vitelínico como mesonefro aorto-dorsal dão origem
3. Placenta
ANTES
2007
Hematopoiese
Cell 132, 631–644, 2008
Moore M. Essentials of Stem Cell Biology – Chapter 23, 2009.
Homing
Fisiológico: CTH AGM  MO  hemotopoiese
Experimental: Animal letalmente irradiado  injeto CTH  MO reconstitui hematopoiese
Clínico: TMO condicionamento (quimioterapia/TBI)  infusão de células CD34+ (MO/SP/CU)  MO reconstitui a hematopoiese
CD34+
Homing
É o tráfego bidirecional entre a medula óssea (MO) e a periferia 
“Steady state egress” (“Saída em estado estacionário”)
Recrutamento induzido por estresse
Mobilização clínica (TMO)
A ausência de CXCL12 (SDF-1: estromal cell derived factor 1) ou CXCR4 = ausência de homing para MO/fígado fetal (“mice”)  PRINCIPAIS ENVOLVIDAS NO TRAFEGO
Homing – Gradiente SDF-1
1º. Sinal: SDF-1 x CXCR4
2º. Adesão e rolamento vascular sinusoidal
3ª. Cruza barreia endotelio-medular-matriz extracelular  cavidade medular 
4º. Ancora nos nichos especializados (endósteo)
A maior quantidade de SDF-1 está nas CAR = quiescência e manutenção
CE
(Barreia endotélio-medular)
CXCR4
CXCR7
SDF-1 
não clivado
circulação
MO
SDF-1
CTH
CXCR4
Homing – Adesão
2º. Adesão e rolamento vascular sinusoidal
3ª. Cruza barreia endotelio-medular-matriz extracelular  cavidade medular 
4º. Ancora nos nichos especializados (endósteo)
A maior quantidade de SDF-1 está nas CAR = quiescência e manutenção
circulação
MO
CTH
VLA4
CD44
PSGL1
VCAM1
E-seletina
P-seletina
CE
(Barreia endotélio-medular)
Integrina α4β1 = VLA4
Homing – Rolamento e Cruzamento da barreira endotélio-medular
4º. Ancora nos nichos especializados (endósteo)
A maior quantidade de SDF-1 está nas CAR = quiescência e manutenção
circulação
MO
CTH
CE
(Barreia endotélio-medular)
Integrina α4β1 = VLA4
Homing – Migração para nicho peri-endosteal
4º. Ancora nos nichos especializados (endósteo)
A maior quantidade de SDF-1 está nas CAR = quiescência e manutenção
circulação
MO
CTH
CE
(Barreia endotélio-medular)
Integrina α4β1 = VLA4
Homing – Ancoragem no Nicho
 Adesão
CTH Estroma
CXCR4 - SDF-1 (estroma,
 CE, Nestin+, OTB)
CD44 - ácido hialurônico/
 osteopontina (vasos/osso)
CD49f
CD9=homing do SDF-1
↓SDF-1  CD34+ secreta MMP2/MMP9  migração e proliferação
↑SDF-1 internalização e dessensibilização CXCR4  quiescência e adesão
Integrina α4β1 = VLA4
CD34+/CD44+ (CTH)  necessária para difusão e adesão ao ácido hialurônico e osteopontina dos vasos e endosteum.
A ligação SDF-1 – CXCR4  aumenta expressãode CD9 na CTH
<CD9 = <homing via SDF-1 e maior adesão à fibronectina e CE
CTH 1:104-5 
endósteo
Ancoragem no Nicho
 Regula negativamente proliferação e diferenciação (interações de adesão)
 Obj: 
 Manter pool de CTH quiescentes
 Com potencial para migrar e se desenvolver
CAR
Estudos em camundongo...
CTH estao preferivelmente localizadas na superficie endosteal, trabecular, das metáfases
Osteoclasto cria a cavidade para a CTH, é necessário para a diferenicação do osteoblasto que mantem o nicho, sem o OCT perda do homing – não se sabe bem os mecanismos entre OCT e OBT.
Nicho: Nestin+ MSC & CTH
J Exp Med. 2011 Mar 14;208(3):421-8. 
 Formar osso, cartilagem e adipócitos
 Perivascular
 Inervação do SNS: 
- Receptores β2 e β3-adrenérgicos
4. Próximas à CTH
5. Expressam genes de retenção no nicho
6. Disfunção autonômica (ex:DM)
7. Estimuladas por macrófagos
Kit-ligante
CXCL12-CXCR4
VCAM-VLA4 (alfa4-beta1)
SCF (ou kit ligante)-Kit
Angio1-Tie2
CAR expressa assim como a Nestin+ genes de rentenção:
SDF-1
SCF
VCAM-1
Osteopontina
angiopontina
Nicho: Nestin+ MSC & CTH
J Exp Med. 2011 Mar 14;208(3):421-8. 
Kit-ligante
β2
β3
O GCSF ativa o SNS que inibe a Nestin+ via B2, downregulando os genes de retenção no nicho. Outro artigo diz que estímulo adrenergico sobre nestin via B3 downregula CXCL12 e leva à moblização (Blood Reviews 2012) 
O GCSF liga-se ap macrófago que desaparece  deixando de estimular a Nestin+  downregulacao dos genes de retençao no nicho
CTH 1:104-5 
endósteo
Nicho
CAR
Estudos em camundongo...
CTH estao preferivelmente localizadas na superficie endosteal, trabecular, das metáfases
Osteoclasto cria a cavidade para a CTH, é necessário para a diferenicação do osteoblasto que mantem o nicho, sem o OCT perda do homing – não se sabe bem os mecanismos entre OCT e OBT.
Nicho: Inervação & CTH
Direta: Ritmo Circadiano (receptor β3)
Escuridão (noite)  SNS  receptor β3  ↓SDF-1 (MO)  mobilização
Sincronizar pode melhorar mobilização
Direta: Sinalização por NT (receptor β2) 
Norepinefrina  receptor B2  ↑SDF-1 rápido para a periferia  rápida mobilização
Estresse (hematopoiético)/GCSF/Regulação imune  β2 -MSC/-OTB  ↓nicho e mobilização
Blood Reviews, 26 (6): 267–278, 2012.
Indireta: via regulação de leptina neuronal-dependente: ̶ osteoblastos  ↓SDF-1 (MO)  mobilização
Causas
Sangramento
Lesão
Inflamação
Dano DNA (radiação, QT)
Consequencia:
Desgruda leucócitos imaturos ciclo celular  aumento da motilidade
Recrutamento maciço de CTH para circulação (defesa e reparo)
Resposta imune  aumento do GCSF/GM-CSF  proliferação, deferenciaçào, recrutamento e mobilização das CTH
Nicho: Sistema Endocanabinódie & CTH
AÇÃO PARÁCRINA
Aumenta ação do GCSF
Células do 
estroma
2-AG
CTH
CB2
CXCR4
downregulação
MOBILIZAÇÃO
CTH 1:104-5 
endósteo
Nicho
CAR
Cálcio
Sensor de cálcio
Receptor sensor de Ca2+
 Deleção: ↓ pool de CTH
 Estímulo: ↑endósteo e CTH
Estudos em camundongo...
CTH estao preferivelmente localizadas na superficie endosteal, trabecular, das metáfases
Osteoclasto cria a cavidade para a CTH, é necessário para a diferenicação do osteoblasto que mantem o nicho, sem o OCT perda do homing – não se sabe bem os mecanismos entre OCT e OBT.
PTH – Osteoblasto e CTH
Mol Cell Endocrinol. 2008 Jun 25;288(1-2):6-10. 
2. PTH  PTHR no osteoblasto  GCSF/GMCSF
3. >formação óssea = > pool CTH (osteopontina)
4. 6. Ausência de OTB maduro = não mobiliza com GCSF
quiescência
Aumento pool
TPO-cmpl
↑OBT (osteopontina)  ↑pool CTH
↓OTB imaturos ↓hematopoiese
CXCL12-CXCR4
Expansão
(osteopontina)
C-Kit
GMCSf/GCSF
Administrar PTH no TMO mieloablativo  >celularidade MO e sobrevida
Fig. 1. The hematopoietic stem cell (HSC) niche. In murine bone marrow, HSC are found adjacent to endosteal N-cadherin+ osteoblasts. Molecules expressed by osteoblasts, such as osteopontin (OPN) and angiopoietin-1 (Ang-1), as well as Notch on the surface of HSC have been demonstrated to play important roles in regulating HSC activity. Paraythyroid hormone (PTH), signaling through the PTH/PTHrP receptor (PPR), has been demonstrated to increase the numbers of HSC in the bone marrow and to increase their engraftment in recipients. Data produced by others and presented in this document suggest that PTH may work through osteoblasts, increasing their expression of cytokines, Notch ligands, and insulin-like growth factors (IGF). 
The role of parathyroid hormone and insulin-like growth factors in hematopoietic niches: Physiology and pharmacology
R.W. Garretta,  ,  , 
S.G. Emersona, b
Molecular and Cellular Endocrinology
Volume 288, Issues 1–2, 25 June 2008, Pages 6–10
Expansao estimulada pela ligacao Jag-1 – Notch na presenca de osteopontina
 
Angiopoetina 1 interage com o receptor tirosino quinase Tie-2 e inibe a proliferação da CTH, induzindo quiescencia, para ciclo celular, causa adesao  protege do estresse mielossupresor
Osteoblasto  TPO  c-mpl-HCS e induz quiescencia
PTH  FGF2  > SCF e c-kit  expansão CTH
Interação com Tie1, mpl e c-kit  manutenção da populacao de CTH-LP (quiescencia e autorenovacao)
Nicho: Osteoblasto, Osteoclasto, PTH & CTH
Nature Reviews, v.11, 2011.
PTH
(Nestin+)
Estresse/dano/GCSF
OCT TRAP+  romper conexinas 43/45 das junções intercelulares  Inibe secreção de SDF-1
mobilização
↓osteopontina
(Runx2+/osterix+)
(osteocalcina+)
G-CSF
GM-CSF
IL-6
Endósteo = zona que preferencialmente se localiza a CTH
OTB= produz GCSF/GMCSF  proliferacao in vitro hematopoietica 
CTH 1:104-5 
endósteo
Nicho
CAR
Nicho: Macrófato & CTH
Depleção = Mobilização...
GCSF
O macrófago suporta os nichos do OTB e Nestin+. Sua depleção depleta nicho e leva a mobiliazação
GCSF inibe macrófago
GCSF é produzido por macrófagos naturalmente 
Nicho: Adipócito & CTH
Lipoatrofia associa-se com melhor recuperação medular
Nicho: Reticular (CAR) & CTH
Deleção de CXCL12 
Inibe formação osso/adiposo
<número de CTH
afeta desenvolvimento linfóide
Genes de retenção:
SDF-1(*)
SCF
VCAM-1
Osteopontina
Angiopontina
No humano reticular CD146+ sustenta nicho
CAR são precursores adipo-osteogênico
Nicho metabólico: Hipóxia e CTH (homing)
Hipóxia  ↑HIF1-alfa  ↑SDF-1  Homing da CTH para MO
Hipóxia  ↑HIF1-alfa  ↑VEGF1  osso e angiogênese  nicho
Metabolismo anaeróbio:
Auto-renovação ou
Proteção estresse oxidativo = promove quiescência
Hiperbárico = mobilização
Oxigênio
HIF = hipoxic inducible factors ....
Papel do Gradiente Químico
Maior gradiente no endósteo:
SDF-1: adesão, homing, mobilização
Cálcio: OTC liberam Ca2+
Esfingofosfolípidos (S1P e C1P)
Receptor de S1P (S1P1) na CTH: mobilização via antagonista de CXCR4 (se deletado não estimula, se estimulado melhora mobilização)
GCSF aumenta S1P no SP e reduz na MO (inverte o gradiente)
S1P (esfingosina) e C1P (ceramida)  homing por maior adesão ao estroma
Outros fatores que interferem no Homing/pega
1. Aumento da expressão de CXCR4 na CTH:
CTH mobilizada
PGE2
2. Redução na degradação (clivagem) do SDF-1
Inibição do CD26 (dipeptidil peptidase, serina protease ligada à membrana extracelular)
3. CDC42 (regulador do ciclo celular)
Deficiência CDC42 ↑ciclo, ↓homing/retenção mobilização maciça
4. Robo4 na CTH:
Deficiência: menor retenção e menor capacidade de repovoamento
5. Anexina A2 na CTH:
Auxilia na localização no endósteo, por ligação ao SDF-1
Deficiência: prejuizo da pega
6. Dano e sangramento  Trombina  Receptor de trombina (receptor ativador de protease-1/PAR-1)  induz rápida secreção de SDF-1 para SP (Nestin+ que têm PAR-1) rápida mobilização e aumento CXCR4 na CTH
Homing normal, mas não localizada CTH, pobre repovoamento:
Def. da proteína G Rac1 na CTH (Tb não adere = mobilização)
Def. Fator de troca Vav-1 guanina nucleotideo na CTH
Fatores que interferem no Homing/pega: Irradiação/QT x CTH (condicionamento mieloablativo)
Barreira endotelio-medular:
GCSF: ↑permeabilidade  ↑ mobilização e homing
QT/TBI: destrói barreira
Torna o nicho mais receptivo para CTH
↑produção e secreção de CXCL12 (SDF-1) pelo estroma MO:
Célula endotelial/ Osteoblasto/ MSC Nestin+ (***)  atração CD34+/CXCR4+
Aumenta número de nichos disponíveis
Células CD34-/CD38-/CXCR4 lo  problema no homing  TMO intra-ósseo ou maturar para CD34+ 
Mecanismo Reguladores do Nicho da CTH
The EBMT hand book, 2008
Mecanismos Intrínsecos
Regulam auto-renovação:
GATA2
GFI1
JanB
PU.1
Myb
Proteína ligadora de CREB
Smad4
ZFX
Del ↑P21 CTH-LP
Del PTEN (-PI3-AKT) ↑CTH-CP e ↓CTH-LP
Del p16ink4a, p19Arf, p53↑CTH-LP
HoxB4
HOXA9, A10, A7 (tb leucemia)
CDX, PBX, MEIS1  regulam Hox
Difrenciação
PU.1  mielóide
GATA1 eritróide
Epigenéticos
↑OCT4, SOX2, c-Myc, KLF4 em cels somáticas  geração de cels pluripotentes
Lck  SRC quinase  sinal T
Metilada CTH
Desmetilada no CLPC
MPO
Metilada CTH
Desmetilada CPGM
Metilação do DNA regula autorenovação
Def. DNMT1= depleção grave CTH (bloqueia auto-renovação)
↑BMI1(-p16) ↑auto-renovação CTH
Regulação por microRNA
miR-155  Ly e My
miR-223  My
miR-181/150/17-92  Ly
miR-125a  inibe pró-apoptótico BAK-1  expansão CTH 
CLPC cel linfoide progeniutora comum
CPGM cels progenitoras de granulocitos e monocitos
 epigenéticos: mecanismos moleculares por meio dos quais o meio ambiente controla a atividade genética 
Mecanismos Extrínsecos
Sinalização do Notch
Receptor na CTH: 
Nocht 1
Nocht 2
Nocht 3
Nocht 4
Cliva NICD  para núcleo  liga-se ao CSL (CBF1/RBPJk) HES1 e HES5  inibe diferenciação my e ly
Ligante: 
Jagged 1  ↑ expansão (ex:OTB)
Delta 1  ↑ expansão
Jagged 2  ↓ diferenciação
Delta 2
Delta 3
M = my
NICD = dominio intracelular NOTCHT
Mecanismos Extrínsecos
Sinalização do Wnt
Regula auto-renovação e diferenciação
B-catenina (via Wnt)  ↑HoxB4 e ↑Nocht1
Wnt  expansão/ auto-renovação
Sinalização Smad
TGF-β  inibe ciclo celular (↑ p21 e ↑57 e ↓receptor de ciclina inibe CTH  quiescência
Del. TGF-β  ↑↑CTH  my
Sonic hedgehog  BMP4  CTH capaz de repovoar multilinhagem
Smad4  autorenovação
M = my
Mecanismos Extrínsecos
Novos Fatores de Crescimento Hematopoiético:
Angptl5 + IGEFBP2 = homing?  + SCF + TPO + GF1  20x CBh
TPO + SCF + FLT3L + IL6 + stemRegenina1 (CBh)  ↑17x repopulação  inibe AhR nas CTH
Fator de cresciemtno
Função na Auto-renovação da CTH
Notch ligantesSuficiente, não necessário
Wnt proteínas
Suficiente, ? Necessário
BMPs
? Suficiente, Smad4 necessária
SCF
Necessária, não suficiente
TPO
Necessária, não suficiente
RAR-γ
Necessária
Ang-PTL (2 e 3)
Suficiente
↑24-30x CTH-LPh
PGE2
Suficiente
↑CXCR4 (CB) homing
Regula Wnt  repopulação
PTN (pleiotrofina)
Suficiente, ? Necessária
Expansão CTH(-LP)
↑PI3K/AKT
↑HES1
Expansão/regeneração exaustão
AhR antagonista
Suficiente
StemRegenina 1 (derivado de purina):
 inibe Ahr
 Expansão CB in vivo
M = my
BCL-2 anti-apoptótico
Aplicação prática do conhecimento
Mobilização para Transplante de Medula Óssea
Ex: TMO alogênico...
Quebrar mecanismos de adesão...
Alterar gradiente quimiotático...
GCSF
↑transitório SDF-1 (secreção células estromais)  liberação para circulação
+OTC maduros  MMP-9 e catepsia K  cliva SDF-1, osteopontina, SCF 
↓ macrófagos, OTB, nestin  ↓SDF-1 e outras
+ SNS  - Nestin e OTB
↑Mielóides MMP-9, catepsina G e elastase neutrofílica  cliva c-KitL, VCAM, SDF-1
↑CD26  cliva SDF-1
↑MMP-9  altera barreira endotelio-medular
↑Aumenta CXCR4 na CTH
↓SDF-1  CTH  MMP2/MMP9
↑SP1 no SP
PMN  HGF  +eixo HGF-cMet  ↑ROS intracelular
↑MT1-MMP (CD34+)  ↓inibidores endógenos RECK e CD44
↑trombinaPAR1 secreção SDF-1 para SP e ↑CXCR4 na CTH
Proliferação
Diferenciação
Exposição a extresse O2
Mobilização = 4-5 dias
Falar que receptor tem dano tecidual que aumenta SDF-1 e atrae CXCR4
Pralixafor (ADM3100) e GCSF
Mobilização rápida (min/h), sem proliferação
Antagonista (transitório) do CXCR4: bloqueio reversível da ligação SDF-1-CXCR4
Agonista CXCR4 (estroma): rápida secreção SDF-1 (mediada por conexina 43/45 junções) para circulação gradiente para circulação
Associada à secreção de MMP-9
A célula mobilizada pelo ADM3100 tem alta quimiotaxia pelo SDF-1, assim a ligação ao ADM3100 foi transitória
ADM3100: rápido aumento de SDF-1  rápida secreção para circulação
GCSF: secreção SD-1 e degradação
“In order to keep your balance, 
you must keep moving.
Albert Eintein

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