Microbiologia Aula Biotecnologia bacteriana e ética

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Microbiologia - Engenharia genética e bioética
 Conceitos
Biotecnologia: estudo e manipulação dos seres vivos para o proveito humano.
Engenharia genética: modificação dos seres vivos pela manipulação direta do DNA
Biotecnologia é antiga, mas ganhou um impulso muito grande com a engenharia genética.
Biotecnologia antiga: escolha de raças de cães e escolha de colheitas especiais, por exemplo. 
Nascimento da engenharia genética: Junho de 1973. (cohen e colaboradores, na Gordon Conference on Nucleics acids)
Cohen: Bactéria transgênica com diferentes resistências a antibióticos.
(na conferência, foi levantada a questão de segurança: possível engenharia de super-patógenos)
Enzimas de restrição
Endonucleases
Clivam sequências específicas de DNA, nos sítios de restrição ( 4 a 6 pares de base).
Sequências de clivagem são sequências palindrômicas (mesma leitura, não importanto o sentido). 
Enzimas de restrição reconhecem sítios de restrição (sequências palindrômicas) e os clivam de maneira assimétrica, deixando extremidades coesivas. 
(extremidades coesivas são importantes porque permitem a junção de diferentes segmentos de DNA, desde que cortados pela mesma enzima de restrição)
Evidências de enzimas foram as clivagens de fagos invasores de bactérias, que sempre tinham seu DNA cortado nos mesmos locais. Diferentes organismos produzem diferentes enzimas de restrição.
 Enzimas diferentes atuam em sítios de restrição diferentes (enzimas: Eco R1, EcoR V, 2066 Pvu II)
DNA recombinante
As extremidaes coesivas (partes terminais que ficaram após a atuação das enzimas de restrição, e que são complementares á extremidades deixadas por atuação da mesma enzima em qualquer outro pedaço de DNA) podem ser ligadas umas ás outras por atuação de DNAligases.
Vetores
Plasmídios
Vírus
Closmídios (mistura de vírus e plasmídios)
Hoje em dia, presença de catálogos, que permitem que se escolha a enzima de restrição de interesse. 
 
Engenharia genética: programação de que cortes serão feitos onde, com montagem do DNA de interesse. 
Após DNA ter sido aberto por enzima de restrição, pode-se ligar um segmento contendo gene de interesse. 
 (ligação é possível se segmento com gene também tiver sido cortado com a mesma enzima de restrição. Desse modo, existem extremidades coesivas (complementares), que se unem com as extremidades coesivas do DNA original. Uso de DNA ligase faz a ligação das extremidades. 
Usos e aplicações da engenharia genética
Bactérias produtoras de hormônios protéicos e outras proteínas humanas.
(a produção a partir de genes inseridos é protéica).
Plantas e animais transgênicos
Projeto genoma. 
Terapia gênica
 	Biohulin: insulina produzida por E. coli. (produção brasileira, com convênio entre unb e 	Biobrás). Superando o uso de insulina não-humana, há a troca da insulina de porco 	(diferença de 3 aminoácidos em relação a insulina humana, que pode trazer resposta 	imunológica) ou insulina humazinada (troca dos três aminoácidos) pela nova insulina 	humana feita por bactérias.
Biohulin
Insulina produzida a partir de gene sintético para a insulina humana
Gene feito a partir da sequência de aminoácidos da insulina humana, mas bases não são cópias das presentes no humano: gene realmente sintetizado. 
Troca de códons típicos de humanos para códons típicos de bactérias. Embora o código seja o mesmo, há códons específicos de bactéria que contam com mais tRNA , aumentando a eficiência do processo.
Presença de promotor sensível á temperatura (produção pode ser regulada pela temperatura) 
Chega a produzir, a 40 graus celsius, 60% da proteína como insulina. 
A insulina forma um corpo de inclusão no citoplasma, podendo ser purificada. 
É idêntica á humana em todos os aspectos
Insulina tem uma estrutura protéica relativamente simples, tendo sua estrutura espacial formada de maneira idêntica no citoplasma de células bacterianas e no citoplasma de células humanas. 
Promotores sensíveis á temperatura são importantes, permitindo adaptação da transcrição de acordo com as condições ambientais (importante em bactérias heatshock, que transcrevem proteínas diferentes de acordo com a temperatura, e transcrição de determinados elementos protéicos quando temos febre, por exemplo). 
 Projeto genoma
Projeto de pesquisa internacional
Início nos EUA em 1990
Objetivo: mapa de todo o genoma humano
Prentendia localizar entre 50.000 e 100.000 genes que teriam nos cromossomos
Genes reais: cerca de 30.000. 
Sequenciamento
Previsto para 2005, foi concluído em 2001. (desenvolvimento de técnicas mais avançadas, rápidas e eficientes de sequenciamento)
Presença de 3 bilhões de pares de base
Cerca de 160 listas telefônicas de 600 páginas cada, com letra pequena. 
Pequenos trechos já têm interpretação: genes. Para a compreensão do resto falta mais estudo. 
DNA sequenciado: “ser humano virtual”. Usados genes de diferentes pessoas. (pessoas diferentes, genes diferentes, mas com procura de uma linha de normalidade, uma vez que tentou se escolher pessoas fenotipicamente normais para a doação para o estudo – até os próprios pesquisadores doaram). 
Compreendendo os genes
Somente 5% do nosso DNA são genes
Bancos de ESTs (expressed sequence tags : marcadores de sequências expressas). 
Parte-se dos RNAs mensageiros de células em determinadas condições
	
	(idéia de que, embora todas as células de um mesmo organismo tenham o mesmo material 	genético, há diferença no conjunto de genes expressos, determinando assim morfologia e 	função da célula. Assim, bancos de mRNA (ESTs) dizem o que está geneticamente ativo). 
	ESTs são imporantes para avaliação da atividade de expressora de certos segmentos gênicos 	quando, por exemplo, se tem alguma doença ou disfunção. (ESTs: banco de RNA 	informando genes efetivamente expressos, determinando conjuntivo de genes 	transcrionalmente ativos, que contribuem para a morfologia e função da célula)
Bioinformática 
	
Comparam-se as sequências obidas com o mapa geral, para localizá-las nos cromossomos.
Comparam-se também com genes conhecidos de outros organimos
Deduzem-se sequências de proteínas e forma secundária possivelmente obtida. 
Resultado final: projeto genoma
O resultado final almejado é conhecer cada gene: onde está, qual a sua sequência e qual a sua função.
Conhecer variações nos genes, especialmente as relacionadas a doenças, mas também a etnias (filogenia humana). Herança mitocondrial: herança materna (filogenia feminina)
“Cartão genético”, com genomas individuais listados. Seguro saúde? (como fica a questão da discriminação por riscos aumentados de desenvolvimento de doenças). Oferta de empregos? Casamento? 
 Estudo do DNA mitocondrial levou á filogenia ancestral materna comum, com origem na África (origem comum e única dos seres humanos). 
Mapeamento a partir de genes do cromossomo Y (filogenia paterna) levou também á ancestralidade comum na África. 
Patentes
O genoma humano é patrimônio do homem e não uma invensão patenteável
Contudo, proibição da patente também dificulta a questão do capital privado investido na pesquisa: porque o capital privado vai investir se não há perspecitva de lucro?
Nerck e Universidade de Washington: montagem de banco de dados públicos a partir de grupos de RNA: dbEST.
EST: expressed sequence tags (mapeamento do conjunto de RNA realmente expresso)
Perspectivas:
 
Diagnósticos precoces
Tratamento preventivos
Terapia gênica
Possíveis problemas
Práticas discriminatórias (diferenças podem surgir por diferentes expectativas de vida, de saúde, etc.)
Eugenia (possível eliminação dos genomas mais frágeis e susceptíveis a problemas, e.g.)
Questões bioéticas
Surgidas desde o início da engenharia genética(1973). 
Aberta uma seção especial de discussão para debate das questões éticas. 
Preocupação: segurança (possível formação de super-patógenos).
Pesquisas encaminhadas a órgãos de segurança (unanimidade)
Comissão
Presidida por Paul Berg (trabalho com vírus).
Presença de Watson (DNA) e Cohen (engenharia genética).
Comissão propôs uma moratória: proibição das pesquisas até formação de uma reunião maior e com mais elementos para informações corretas poderem ser alcançadas. 
 Cientistas pararam por algum tempo suas pesquisas (mesmo sendo cientistas de ponta trabalhando em descobertas que poderiam trazer muito dinheiro e muito nobel) (questão de garantia: os outros cientistas também estariam seguindo a moratória, não apareceriam depois que tudo estivesse bem com resultados completos, como se os tivessem obtido em um mês de pesquisa?).
Conferência de Asilomar: 
1975 (2 anos depois do primeiro resultado de engenharia genética)
86 cientistas americanos
53 cientistas de outros 16 países
Advogados (responsabilidade pelas descobertas).
Estabelecimento de normas de segurança
Classificação de laboratórios (P1 a P4)
P1: laboratório comum de pesquisa em microbiologia
P4: laboratórios com segurança total para manipulação de patógenos perigosos.
Organismos de EK1 a EK3 (bactérias com genes perigosos feitas de maneira que tenham metabolismo debilitado: dependentes de condições controladas, com baixa sobrevida no ambiente)
Normas sendo regulamentadas em leis nos diferentes países.
Formação de Comissões de Biosegurança nacionais (que podem ser tendenciosas. Mais técnicas (risco de pesquisadores pondo poucos limites para suas próprias pesquisas) ou mais políticas (pouco conhecimento técnico)?)
 Brasil levou 30 anos para regulamentar suas leis de biosegurança (de 1975 nos EUA para 2005 no Brasil)