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PRÁTICAS DA 2ª PROVA (Gustavo)

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PRÁTICAS DA 2ª PROVA 
 
1) Controle de microrganismos* por agentes físicos: *LEGENDA = m. 
 
Quatro tubos de ensaio: 
1 – controle: vai ser o mais infectado 
2 – fervido: das técnicas, a menos boa porque os m. podem esporular 
3 – autoclave: 
 = mata esporo 
 = mas pode manter toxinas pirogênicas (que resistem ao calor) = 
endotoxinas (LPS) que a bactéria libera ao morrer. 
Obs: pode eliminar moléculas de antibiótico (nesse caso, melhor filtrar). 
4 – filtrado no sistema de Seitz sob bomba de vácuo: boa porque reteve a 
terra, onde tinham nutrientes para o crescimento dos m. 
 
Foram incubados por 24h em T ambiente 
 
2) Controle de m. por agentes químicos: 
 
Experimento 1: 
Meio LB agar 
 
Duas areas: C – controle (vai esfregar bactérias de pele só com cotonete 
esteralizado com solução salina) 
 T – tratada (vai esfregar bactérias depois de passar no local 
da pele: álcool 70% (alguns grupos) ou agua oxigenada (outros grupos) ou 
álcool iodado (outros grupos) 
 
Incuba a 37ºC por 18h 
 
Experimento 2: 
 
2 soluções com E. Coli: 
 1 – Controle 
 2 – Tratado (com formaldeido 18,5%, hipoclorito de sódio a 5% ou 
etanol 70%) 
 
Resultados: 
 No caso, observa-se que as bactérias proliferam onde não foi tratado. No 
caso do tubo com água oxigenada, houve proliferação  bactérias então são 
resistentes à H2O2  permite inferências das aulas teóricas (mutações, 
resistência, classificação, etc) 
 
3) Teste de Luz Ultravioleta: 
 
E. Coli 
 
Metade da placa sofreu incidência de UV e metade, não (cada grupo com 
tempo diferente, crescentes em segundos) 
 
Resultado: 
 UV é rápida e eficiente. Para a E. Coli, bastaram 30segundos para que a 
superfície fosse toda esterelizada – lembrar que UV forma dímeros de pirimidina 
e o sistema de reparo das células não dão conta de reparar o dano  não quebra 
o DNA, mas altera as relações das bases  perde especificidade de pareamento. 
 
OBS: COMO SABER SE DE FATO AS BACTERIAS SÃO RESISTENTES!? Repete 
o experimento agora só com a colônia resistente! 
 
4) Antibiograma: 
 
Espalha as bactérias de forma homogênea e depois coloca discos com 
diferentes antibióticos de forma eqüidistante 
 
Resultado: 
 Depois da incubação, alguns discos terão halos e outros, não. Aqueles 
sem halos, são de antibióticos que não possuem efeito  bactérias resistentes. 
Onde houver halo, precisa medir o diâmetro e comparar com tabela para 
verificar se as bactérias são sensíveis ou a inibição (efeito) é apenas 
intermediária 
 DETALHES: 
i) a leitura da Tabela Padrão de Antibióticos é tudo ou nada (sim 
ou não), e não comparativa. 
ii) o diâmetro do halo depende de 2 fatores: 
 - capacidade de difusão do antibiótico 
 -capacidade de resistência da bactéria 
iii) as concentrações de antibióticos são diferentes  por isso não 
pode comparar diâmetros de halos diferentes para a mesma bactéria 
iv) Mas pode halo do mesmo antibiótico para bactérias diferentes! 
 
Obs: Amoxicilina tem halo diferente para cada tipo de bactéria: 
 - Gram – e enterococo = halo 13 
 - estafilococos = halo 26 
 
  Tudo isso determina a escolha do antibiótico para determinada 
bactéria  espectro de ação + toxicidade ao ser humano + preço! 
 
 
5) Transformação de Bactérias: 
 
São 2 tubos. 1 contem DNA plasmidial e outro, não. 
 
Choque térmico (de 4ºC para 42ºC): serve para que a membrana expanda e 
apareçam rachaduras que vão permitir a entrada dos plasmídeos. 
 
Adiciona LB: serve para recuperar as células do choque térmico, porque, a 
seguir, serão colocadas em meio com antibiótico 
 
Inocula em Placa de Petri: 
 1 – sem antibiótico = vai haver colônias homogêneas, porque não há 
antibiotico 
 2 – com antibiótico e amido: o antibiótico vai marcar o gene contra o 
antibiótico (gene AMP – anti lipicina), que está nas bactérias que pegaram o 
plasmideo. E o amido serve para marcar tb, pois o plasmideo possui tb o gene 
amilase! = vai haver alguns poucos lugares com colônias isoladas  isso é sinal 
de que poucas conseguiram adquirir o plasmideo. 
 Obs: para ver os halos, aplicam-se cristais de iodo  amido fica 
iodade e fica roxo quando entra em contato com essa substancia  ao redor das 
colônias ficará roxo, mas nelas, não, porque o plasmideo tem amilase e, onde 
tem as bactérias mutadas via mutação induzida por transformação. 
 
Anexo: preparo das células competentes: 
 - o meio LB serve para deixar o meio básico porque as células de E. Coli 
precisam de meio básico para proliferar. 
 - a agitação a A600 de 0,1 a 0,3 serve para iniciar a fase exponencial de 
proliferação porque é esta que interessa para o experimento (cria a densidade 
populacional necessária) 
 - a solução de CaCl2 serve para neutralizar o DNA, que é NEGATIVO. 
O Cálcio neutraliza as cargas de membrana e do DNA e, tb, desestrutura a membrana 
plasmática (em sua separação entre parte hidrofílica e parte hidrofóbica)  isso abre 
brechas 
 - o resfriamento serve para que os lipídeos da membrana antes 
desestruturados nao cheguem a romper a membrana  a ↓ T serve para recolher os 
lipideos e enrijecer a m. p., que depois será aberta de novo pelo choque térmico. 
 
 
6) Titulação de Vírus (esse eu não entendi direito!!!): 
 
 O meio YT é semi-sólido porque serve para segurar as bactérias e os fagos e 
não deixar espalhar por toda a placa. 
 
 Cálculo: 
 
 Na placa de 10 -7 (10 elevado e menos 7) = 400 placas de lise = em 100µl 
 Logo, há 4.000 placas /ml, que, então, dá 4 x 10 3 (dez elevado a 3) placas / ml 
 Logo, há 4 x 10 10 (dez elevado a dez)* placas / ml 
 
* 10 3 dividido por 10 -7 = 10 10(dez elevado a dez).

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