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PRÁTICAS DA 2ª PROVA 1) Controle de microrganismos* por agentes físicos: *LEGENDA = m. Quatro tubos de ensaio: 1 – controle: vai ser o mais infectado 2 – fervido: das técnicas, a menos boa porque os m. podem esporular 3 – autoclave: = mata esporo = mas pode manter toxinas pirogênicas (que resistem ao calor) = endotoxinas (LPS) que a bactéria libera ao morrer. Obs: pode eliminar moléculas de antibiótico (nesse caso, melhor filtrar). 4 – filtrado no sistema de Seitz sob bomba de vácuo: boa porque reteve a terra, onde tinham nutrientes para o crescimento dos m. Foram incubados por 24h em T ambiente 2) Controle de m. por agentes químicos: Experimento 1: Meio LB agar Duas areas: C – controle (vai esfregar bactérias de pele só com cotonete esteralizado com solução salina) T – tratada (vai esfregar bactérias depois de passar no local da pele: álcool 70% (alguns grupos) ou agua oxigenada (outros grupos) ou álcool iodado (outros grupos) Incuba a 37ºC por 18h Experimento 2: 2 soluções com E. Coli: 1 – Controle 2 – Tratado (com formaldeido 18,5%, hipoclorito de sódio a 5% ou etanol 70%) Resultados: No caso, observa-se que as bactérias proliferam onde não foi tratado. No caso do tubo com água oxigenada, houve proliferação bactérias então são resistentes à H2O2 permite inferências das aulas teóricas (mutações, resistência, classificação, etc) 3) Teste de Luz Ultravioleta: E. Coli Metade da placa sofreu incidência de UV e metade, não (cada grupo com tempo diferente, crescentes em segundos) Resultado: UV é rápida e eficiente. Para a E. Coli, bastaram 30segundos para que a superfície fosse toda esterelizada – lembrar que UV forma dímeros de pirimidina e o sistema de reparo das células não dão conta de reparar o dano não quebra o DNA, mas altera as relações das bases perde especificidade de pareamento. OBS: COMO SABER SE DE FATO AS BACTERIAS SÃO RESISTENTES!? Repete o experimento agora só com a colônia resistente! 4) Antibiograma: Espalha as bactérias de forma homogênea e depois coloca discos com diferentes antibióticos de forma eqüidistante Resultado: Depois da incubação, alguns discos terão halos e outros, não. Aqueles sem halos, são de antibióticos que não possuem efeito bactérias resistentes. Onde houver halo, precisa medir o diâmetro e comparar com tabela para verificar se as bactérias são sensíveis ou a inibição (efeito) é apenas intermediária DETALHES: i) a leitura da Tabela Padrão de Antibióticos é tudo ou nada (sim ou não), e não comparativa. ii) o diâmetro do halo depende de 2 fatores: - capacidade de difusão do antibiótico -capacidade de resistência da bactéria iii) as concentrações de antibióticos são diferentes por isso não pode comparar diâmetros de halos diferentes para a mesma bactéria iv) Mas pode halo do mesmo antibiótico para bactérias diferentes! Obs: Amoxicilina tem halo diferente para cada tipo de bactéria: - Gram – e enterococo = halo 13 - estafilococos = halo 26 Tudo isso determina a escolha do antibiótico para determinada bactéria espectro de ação + toxicidade ao ser humano + preço! 5) Transformação de Bactérias: São 2 tubos. 1 contem DNA plasmidial e outro, não. Choque térmico (de 4ºC para 42ºC): serve para que a membrana expanda e apareçam rachaduras que vão permitir a entrada dos plasmídeos. Adiciona LB: serve para recuperar as células do choque térmico, porque, a seguir, serão colocadas em meio com antibiótico Inocula em Placa de Petri: 1 – sem antibiótico = vai haver colônias homogêneas, porque não há antibiotico 2 – com antibiótico e amido: o antibiótico vai marcar o gene contra o antibiótico (gene AMP – anti lipicina), que está nas bactérias que pegaram o plasmideo. E o amido serve para marcar tb, pois o plasmideo possui tb o gene amilase! = vai haver alguns poucos lugares com colônias isoladas isso é sinal de que poucas conseguiram adquirir o plasmideo. Obs: para ver os halos, aplicam-se cristais de iodo amido fica iodade e fica roxo quando entra em contato com essa substancia ao redor das colônias ficará roxo, mas nelas, não, porque o plasmideo tem amilase e, onde tem as bactérias mutadas via mutação induzida por transformação. Anexo: preparo das células competentes: - o meio LB serve para deixar o meio básico porque as células de E. Coli precisam de meio básico para proliferar. - a agitação a A600 de 0,1 a 0,3 serve para iniciar a fase exponencial de proliferação porque é esta que interessa para o experimento (cria a densidade populacional necessária) - a solução de CaCl2 serve para neutralizar o DNA, que é NEGATIVO. O Cálcio neutraliza as cargas de membrana e do DNA e, tb, desestrutura a membrana plasmática (em sua separação entre parte hidrofílica e parte hidrofóbica) isso abre brechas - o resfriamento serve para que os lipídeos da membrana antes desestruturados nao cheguem a romper a membrana a ↓ T serve para recolher os lipideos e enrijecer a m. p., que depois será aberta de novo pelo choque térmico. 6) Titulação de Vírus (esse eu não entendi direito!!!): O meio YT é semi-sólido porque serve para segurar as bactérias e os fagos e não deixar espalhar por toda a placa. Cálculo: Na placa de 10 -7 (10 elevado e menos 7) = 400 placas de lise = em 100µl Logo, há 4.000 placas /ml, que, então, dá 4 x 10 3 (dez elevado a 3) placas / ml Logo, há 4 x 10 10 (dez elevado a dez)* placas / ml * 10 3 dividido por 10 -7 = 10 10(dez elevado a dez).
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