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* Genética Humana CITOGENÉTICA Biólogos (desenvolvimento) Médicos Áreas de Ciências da Saúde Áreas biológicas Técnicos de laboratório � * Genética Humana Genética Médica Genética Clínica Doenças gênicas X Doenças cromossômicas Diagnósticos das doenças genéticas Investigações laboratoriais Abordagem clínica Aconselhamento genético � * Tópicos abordados - Citogenética clássica para a citog. molecular - Cromossopatias estruturais e numéricas - Câncer familiar - Doenças genéticas multifatoriais - Pesquisas e diagnósticos em Genética Humana - Alterações cromossômicas induzidas por exposição ambiental a agentes genotóxicos � * Progressos da citogenética clássica para a citogenética molecular introdução Revisão histórica (o nascimento da citogenética humana) Avanços em citogenética molecular Aspectos gerais da citogen. molecular Rearranjos cromossômicos no homem � * 1956: Tjio and Levan descreveram o cariótipo humano com 46 cromossomos O início da citogenética humana 2n = 48 ou 46 ? � * O início da citogenética humana Desenvolvimento e domínio da técnica de cultura temporária de linfócitos humanos Adição de solução hipotônica e o uso da colchicina Técnicas de bandeamento G, C, R, NOR e outras (1970) Padronização do cariótipo humano através da conferências de Denver (1960), Londres (1963), Chicago (1966) e Paris (1975). � * Os cromossomos humanos têm uma morfologia que permite classificá-los em grupos. As técnicas de bandeamento permitem classificá-los aos pares de homólogos. ideograma � * Classificação morfológica dos cromossomos Metacêntricos Submetacêntricos Acrocêntricos Telocêntricos * Rápidamente fizeram-se as associações entre as doenças humanas (síndromes genéticas) e as anormalidades cromossômicas específicas 1959 Lejeune et al : +21 in Down syndrome Ford et al. : 45,X in Turner syndrome Jacobs et al : 47,XXY in Klinefelter syndrome 1960 Nowel and Hungerford Philadelphia chromosome in CML 1973 Rowley: t(9;22)(q34;q11) in CML � * � * Cariótipo humano * Estrutura da cromatina � * * * Processo automatizado � * * 1963 Deleção terminal no braço curto do croms. 5 (5p-), síndrome de Cri du chat 1963 Deleção no braço longo do cromos. 13, associado com o retinoblastoma bilateral. 1967 e 1970 Carr e Boué & Boué = 42% dos abortos espontâneos tinha algum tipo de alteração cromossômica. Em seguida as descrições das síndromes de Edward (trisomina do 18) e síndrome de Patau (trissomia do 13). Daí em diante, as descrições das demais síndromes conhecidas até hoje. � * � * www.visembryo.com/baby/hp.html Prenatal diagnosis � * Principais inovações técnicas 1968 Caspersson et al Estabelecimento do primeiro padrão de bandeamento dos cromossomos humanos com a crinacrina mustadas, que marca as regiões heterocromáticas. Os padrões de banda podem diferenciar a composição em pares de bases, a densidade gênica, sequencias de DNA repetitivo, empacotamento da cromatina e regiões de atividade gênica. O bandeamento facilitou bastante os estudos e classificação das aberrações cromossômicas � * Metafase humana - banda G � * * ISCN 1995 International System for Human Cytogenetic Nomenclature groep A (1-3) groep B (4-5) groep C (6-12, X) groep D (13-15) groep E (16-18) groep F (19-20) * Rearranjos cromossômicos Rearranjos numéricos /aneuploidias resulta de erros de segregação meiótica ou mitótica Rearranjos estruturais translocações inversões insersões deleções duplicações � * Rearranjos cromossômicos encontrados em indivíduos expostos às radiações ionizantes * Aberrações cromossômicas estruturais * Determinação cromossômica do sexo e as anomalias de cromossomos sexuais. * Alterações cromossômicas estruturais Deleção intersticial Rearranjos não-equilibrados � * Alterações cromossômicas estruturais Translocação simples Rearranjos não-equilibrados � * Translocação recíproca � * ISCN 1995 International System for Human Cytogenetic Nomenclature Translocação recíproca 45,XX,t(13;14)(q10;q10) Translocação robertsoniana 46,XY,t(6;9)(q24;p23) * ISCN 1995 International System for Human Cytogenetic Nomenclature Translocação recíproca (não-balanceada) 46,XY,t(6;9)(q24;p23) 46,XY,t(6;9)(q24;p23) * ISCN 1995 International System for Human Cytogenetic Nomenclature inversão 46,XX,inv(9)(p13q13) inserção 46,XY,ins(5;2)(p14;q22q32) * ISCN 1995 International System for Human Cytogenetic Nomenclature duplicação deleção 46,X,dup(X)(p11.2p22.1) del(18)(pterp11.2) del(18)(p11.2) * Citogenética do câncer Leucemia mielóide crônica t(9;22)(q34;q11.2) � * Leucemia promielocitica aguda t(15;17)(q22;q11.2) � * Inovações técnicas na citogenética Mapeamento de genes (doenças) basedo nos rearranjos cromossômcos FISH - Fluorescent in situ hybridisation � * Variações cromossômicas poliplóides no homem * Cariótipo humano * Numéricas Estruturais Poliploidia: um ou mais conjuntos completos de cromossomos Aneuploidia: ganho ou perda de um ou mais cromossomos, mas não do conjunto inteiro Não-balanceadas: ganho ou perda de informação genética CLASSIFICAÇÃO Balanceadas: manutenção da informação genética * Poliploidia Inviável em humanos Triploidia (69,X--) Conjunto extra paterno: mola hidatiforme Conjunto extra materno: desenvolve mas raramente nasce Tetraploidia (92,X---) Geralmente falha na clivagem inicial do zigoto. Inviável * Cromossomopatias autossômicas: características fenotípicas mais comuns Baixo peso ao nascer Retardo no desenvolvimento físico e neuropsicomotor Microcefalia Baixa estatura Orelhas e olhos mal posicionados Anomalias esqueléticas Anomalias de pés e mãos Padrões dermatográficos não usuais Cardiopatias congênitas Malformações cerebrais Malformações no aparelho geniturinário * * FREQÜÊNCIA DE ANOMALIAS CROMOSSÔMICAS EM HUMANOS * Mutation Research 504 (2002) 137–148 * Disponível na plataforma Moodle * Mutation Research 504 (2002) 137–148 * * Alteração do conjunto de cromossomos (3n - Triploidia; 4n - Tetraploidia). * Causas mais comuns Poli-espermia Não expulsão do segundo corpúsculo polar após a fecundação Meiose não-reducional Endoreduplicação = distúrbio no fuso * * TRIPLOIDIA Aberração cromossômica mais freqüente (20%) em abortos espontâneos. Retardamento severo do crescimento, letalidade precoce (máximo 5 meses). Nascimento de crianças com malformações severas é muito raro. Geralmente causada pela dispermia (dois espermatozóides - 1 óvulo) * Inovação técnica molecular FISH - introduzida no final dos anos 80 aumento significativo da sensibilidade (10.000x) possibilita o estudo cromossômico em células interfásicas varias aplicações no mapeamento gênico, diagnósticogenético e pesquisa � * * FISH (fluorescent in situ hybridization) � * Exemplo do preparo de uma sonda para FISH * Sondas de DNA repetitivo em tandem: DNA satélite, DNA telomérico e DNA centromérico Sondas de sequência única: RNAm. (Tamanho ideal entre 50-500 nucleotídeos) Sondas Genômicas: construídas com grande número de seq. Repetitivas dispersas pelo genoma todo. Marca todos os cromossomos igualmente. Sondas cromossômo específicas (chromosome painting): seq. Específicas de uma dado cromossomo. Sondas de DNA repetitivo disperso: derivadas de transposons, sequencias intercalantes repetidas como seq. Alu * * Sondas para marcação telomérica * Fluorescence in situ hybridization Labeling: nick translation DNA Denaturation and incubation at 37°C Mix Denaturation Hybridisatie o/n Commercial Cot1 DNA Wash, detection and counterstain 10ml culture * Control lymphocytes (FISH 952-35) * * * * FISH com marcação por 24 sondas de cores distintas (m-FISH). Cromossomo 5 humano mostrando a imagem direta (a) e a imagem re-processada (b), ambas esteroscópicas. Qualquer alteração pode ser detectada por este sistema, empregado no estudo de alterações cromossômicas “espontâneas” e induzidas. * * Comparative Genomic Hybridization CGH part I * Comparative Genomic Hybridization (CGH) permite a análise compreensiva do genoma inteiro, delineada para a identificação de ganhos ou perdas genômicas. O DNA total (ex: célula tumoral) é hibridizado em uma metáfase normal. Permite a localização de sequências em excesso ou ausentes no genoma tumoral. Não há necessidade de preparações cromossômicas de amostras tumorais. * CGH part I Comparative Genomic Hybridization * CGH vantagens Análise do genoma todo em 1 experimento Não necessita de culturas de células tumorais Sensível na detecção de amplificação gênica part I Permite fazer uma análise retrospectiva Comparative Genomic Hybridization * Spectral Karyotyping (SKY): usa imagem spectral para distinguir interações múltiplas entre diferentes fluorocromos * Análise por SKY da síndrome Wolf-Hirschhorn. Microdeleção (a) Padrão de banda não-usual - 4p16.3 (b) SKY revela uma translocação não-balanceada entre crom.4 & 8 Citogenética clínica * Os rearranjos cromossômicos requerem a formação de quebras duplas no DNA e subsequente junção as duas extremidades quebradas Causas exógenas das aberrações estruturais raios-X, raios- e outras formas de radiações ionizantes Ação direta e indireta sobre o DNA e cromossomos. Lesões oxidativas Dependente da dose recebida e tempo de exposição * Causas exógenas das aberrações estruturais Agentes químicos: agentes alquilantes, análogos de bases, alquil epóxidos, aminas aromáticas, compostos nitrosos e metais pesados Tais aberrações originam-se com maior frequência na fase G2 do ciclo celular infecções virais Deficiências no reparo de lesões ou lesões reparadas erradamente - Ex: Xeroderma Pigmentoso, Sindrome de Blum, Anemia da Fanconi. * Outras causas das aberrações estruturais Transposons Sequencias intervinientes curtas e longas. Elementos de Inserção (LINE, SINE): 300 bp Alu (a cada 4 kb) Duplicação de segmentos cromossômicos, amplificação gênica sítios frágeis nos cromossomos * Duplicações segmentais: expansão do genôma levando a instabilidade e doenças. Duplicações segmentais = regiões específicas do cromossomo com cópias de DNA repetitivas Aumentam a ocorrência de crossing-over desigual, causando: deleções amplificações de segmentos de DNA translocações inversões cromossomos marcadores (novas subbandas) *
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