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citogenetica humana

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*
 Genética Humana
CITOGENÉTICA
Biólogos (desenvolvimento)
Médicos
Áreas de Ciências da Saúde
Áreas biológicas
Técnicos de laboratório
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*
Genética Humana
Genética Médica
Genética Clínica
Doenças gênicas X Doenças cromossômicas
Diagnósticos das doenças genéticas
 Investigações laboratoriais 
 
 Abordagem clínica
 
 Aconselhamento genético
�
*
Tópicos abordados 
- Citogenética clássica para a citog. molecular
- Cromossopatias estruturais e numéricas 
- Câncer familiar
- Doenças genéticas multifatoriais
- Pesquisas e diagnósticos em Genética Humana
- Alterações cromossômicas induzidas por exposição ambiental a agentes genotóxicos
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*
Progressos da citogenética clássica para a citogenética molecular
 introdução
 Revisão histórica (o nascimento da citogenética humana)
 Avanços em citogenética molecular
 Aspectos gerais da citogen. molecular
 Rearranjos cromossômicos no homem
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*
 1956: Tjio and Levan descreveram o cariótipo humano com 46 cromossomos
 O início da citogenética humana
2n = 48 ou 46 ?
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*
O início da citogenética humana
 Desenvolvimento e domínio da técnica de cultura temporária de linfócitos humanos
 Adição de solução hipotônica e o uso da colchicina
 Técnicas de bandeamento G, C, R, NOR e outras (1970)
 
 Padronização do cariótipo humano através da conferências de Denver (1960), Londres (1963), Chicago (1966) e Paris (1975).
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*
 Os cromossomos humanos têm uma morfologia que permite classificá-los em grupos. As técnicas de bandeamento permitem classificá-los aos pares de homólogos.
ideograma
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*
Classificação morfológica dos cromossomos
Metacêntricos
Submetacêntricos
Acrocêntricos 
Telocêntricos
*
 Rápidamente fizeram-se as associações entre as doenças humanas (síndromes genéticas) e as anormalidades cromossômicas específicas
 
 1959
 Lejeune et al : +21 in Down syndrome
 Ford et al. : 45,X in Turner syndrome
 Jacobs et al : 47,XXY in Klinefelter syndrome
 1960 Nowel and Hungerford
 Philadelphia chromosome in CML
 1973 Rowley: t(9;22)(q34;q11) in CML
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Cariótipo humano
*
 Estrutura da cromatina
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*
*
Processo automatizado
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*
 1963 Deleção terminal no braço curto do croms. 5
 (5p-), síndrome de Cri du chat
 1963 Deleção no braço longo do cromos. 13, 	associado com o retinoblastoma bilateral.
1967 e 1970 Carr e Boué & Boué = 42% dos abortos 	espontâneos tinha algum tipo de alteração 	cromossômica.
Em seguida as descrições das síndromes de Edward (trisomina do 18) e síndrome de Patau (trissomia do 13). Daí em diante, as descrições das demais síndromes conhecidas até hoje.
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*
�
*
www.visembryo.com/baby/hp.html
Prenatal diagnosis 
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*
Principais inovações técnicas
 1968 Caspersson et al
 Estabelecimento do primeiro padrão de bandeamento dos cromossomos humanos com a crinacrina mustadas, que marca as regiões heterocromáticas.
 Os padrões de banda podem diferenciar a composição em pares de bases, a densidade gênica, sequencias de DNA repetitivo, empacotamento da cromatina e regiões de atividade gênica.
O bandeamento facilitou bastante os estudos e classificação das aberrações cromossômicas 
 
	 	
�
*
Metafase humana - banda G
�
*
*
ISCN 1995
International System for Human Cytogenetic Nomenclature
groep A (1-3)
groep B (4-5)
groep C (6-12, X)
groep D (13-15)
groep E (16-18)
groep F (19-20)
*
Rearranjos cromossômicos
 Rearranjos numéricos /aneuploidias
	resulta de erros de segregação meiótica ou 	mitótica
Rearranjos estruturais
	translocações
	inversões
	insersões
	deleções
	duplicações
�
*
Rearranjos cromossômicos encontrados em indivíduos expostos às radiações ionizantes
*
Aberrações cromossômicas estruturais
*
Determinação cromossômica do sexo e as anomalias de cromossomos sexuais. 
*
 Alterações cromossômicas estruturais
Deleção intersticial
Rearranjos não-equilibrados
�
*
 Alterações cromossômicas estruturais
Translocação simples
 Rearranjos não-equilibrados
�
*
Translocação recíproca
�
*
ISCN 1995
International System for Human Cytogenetic Nomenclature
Translocação recíproca
45,XX,t(13;14)(q10;q10)
Translocação robertsoniana
46,XY,t(6;9)(q24;p23)
*
ISCN 1995
International System for Human Cytogenetic Nomenclature
Translocação recíproca (não-balanceada)
46,XY,t(6;9)(q24;p23)
46,XY,t(6;9)(q24;p23)
*
ISCN 1995
International System for Human Cytogenetic Nomenclature
inversão
46,XX,inv(9)(p13q13)
inserção
46,XY,ins(5;2)(p14;q22q32)
*
ISCN 1995
International System for Human Cytogenetic Nomenclature
duplicação
deleção
46,X,dup(X)(p11.2p22.1)
del(18)(pterp11.2)
del(18)(p11.2)
*
 Citogenética do câncer
Leucemia mielóide crônica
t(9;22)(q34;q11.2)
�
*
 Leucemia promielocitica aguda
 t(15;17)(q22;q11.2)
�
*
Inovações técnicas na citogenética
Mapeamento de genes (doenças) basedo
nos rearranjos cromossômcos
 FISH - Fluorescent in situ hybridisation
�
*
Variações cromossômicas poliplóides no homem
*
Cariótipo humano
*
Numéricas
Estruturais
Poliploidia: um ou mais conjuntos completos de cromossomos
Aneuploidia: ganho ou perda de um ou mais cromossomos, mas não do conjunto inteiro
Não-balanceadas: ganho ou perda de informação genética
CLASSIFICAÇÃO
Balanceadas: manutenção da informação genética
*
Poliploidia
 Inviável em humanos
 Triploidia (69,X--)
 Conjunto extra paterno: mola hidatiforme
 Conjunto extra materno: desenvolve mas raramente nasce
 Tetraploidia (92,X---)
 Geralmente falha na clivagem inicial do zigoto. Inviável 
*
Cromossomopatias autossômicas: características fenotípicas mais comuns
 Baixo peso ao nascer
 Retardo no desenvolvimento físico e neuropsicomotor
 Microcefalia
 Baixa estatura
 Orelhas e olhos mal posicionados
 Anomalias esqueléticas
 Anomalias de pés e mãos
 Padrões dermatográficos não usuais
 Cardiopatias congênitas
 Malformações cerebrais
 Malformações no aparelho geniturinário
*
*
FREQÜÊNCIA DE ANOMALIAS CROMOSSÔMICAS EM HUMANOS
*
Mutation Research 504 (2002) 137–148
*
Disponível na plataforma Moodle
*
Mutation Research 504 (2002) 137–148
*
*
Alteração do conjunto de cromossomos (3n - Triploidia; 4n - Tetraploidia).
*
Causas mais comuns
 Poli-espermia
 Não expulsão do segundo corpúsculo polar após a fecundação
 Meiose não-reducional
 Endoreduplicação = distúrbio no fuso
*
*
 TRIPLOIDIA
Aberração cromossômica mais freqüente (20%) em abortos espontâneos. 
Retardamento severo do crescimento, letalidade precoce (máximo 5 meses). 
Nascimento de crianças com malformações severas é muito raro.
Geralmente causada pela dispermia (dois espermatozóides - 1 óvulo) 
*
Inovação técnica molecular
 FISH - introduzida no final dos anos 80
 aumento significativo da sensibilidade (10.000x)
 possibilita o estudo cromossômico em células interfásicas
 varias aplicações no mapeamento gênico, diagnósticogenético e pesquisa 
 	
�
*
*
FISH (fluorescent in situ hybridization)
�
*
Exemplo do preparo de uma sonda para FISH
*
Sondas de DNA repetitivo em tandem: DNA satélite, DNA telomérico e DNA centromérico
Sondas de sequência única: RNAm. (Tamanho ideal entre 50-500 nucleotídeos)
Sondas Genômicas: construídas com grande número de seq. Repetitivas dispersas pelo genoma todo. Marca todos os cromossomos igualmente.
Sondas cromossômo específicas (chromosome painting): seq. Específicas de uma dado cromossomo.
Sondas de DNA repetitivo disperso: derivadas de transposons, sequencias intercalantes repetidas como seq. Alu
*
*
Sondas para marcação telomérica
*
Fluorescence in situ hybridization 
Labeling: nick translation
DNA
Denaturation and incubation at 37°C
Mix
Denaturation
Hybridisatie o/n
Commercial Cot1 DNA
Wash, detection
and counterstain
10ml culture
*
Control
lymphocytes
(FISH 952-35)
*
*
*
*
FISH com marcação por 24 sondas de cores distintas (m-FISH). Cromossomo 5 humano mostrando a imagem direta (a) e a imagem re-processada (b), ambas esteroscópicas. Qualquer alteração pode ser detectada por este sistema, empregado no estudo de alterações cromossômicas “espontâneas” e induzidas. 
*
*
Comparative Genomic Hybridization
CGH
part I
*
 Comparative Genomic Hybridization (CGH)
 permite a análise compreensiva do genoma inteiro, delineada para a identificação de ganhos ou perdas genômicas.
 O DNA total (ex: célula tumoral) é hibridizado em uma metáfase normal. Permite a localização de sequências em excesso ou ausentes no genoma tumoral.
 Não há necessidade de preparações cromossômicas de amostras tumorais. 
*
CGH
part I
Comparative Genomic Hybridization
*
CGH
vantagens
Análise do genoma todo em 1 experimento
Não necessita de culturas de células tumorais
Sensível na detecção de amplificação gênica
part I
Permite fazer uma análise retrospectiva
Comparative Genomic Hybridization
*
Spectral Karyotyping (SKY): usa imagem spectral para distinguir interações múltiplas entre diferentes fluorocromos 
*
Análise por SKY da síndrome Wolf-Hirschhorn. Microdeleção
(a) Padrão de banda não-usual - 4p16.3
(b) SKY revela uma translocação não-balanceada entre crom.4 & 8
Citogenética clínica
*
 Os rearranjos cromossômicos requerem a formação de
quebras duplas no DNA e subsequente junção as duas extremidades quebradas
 Causas exógenas das aberrações estruturais
 raios-X, raios- e outras formas de radiações ionizantes
 Ação direta e indireta sobre o DNA e cromossomos. 
 Lesões oxidativas 
 
 Dependente da dose recebida e tempo de exposição
*
 Causas exógenas das aberrações estruturais
 Agentes químicos: agentes alquilantes, análogos de bases,
alquil epóxidos, aminas aromáticas, compostos nitrosos e metais pesados
Tais aberrações originam-se com maior frequência na fase G2 do ciclo celular
 infecções virais
 Deficiências no reparo de lesões ou lesões reparadas erradamente - Ex: Xeroderma Pigmentoso, Sindrome de Blum, Anemia da Fanconi.
*
 Outras causas das aberrações estruturais
 
 Transposons
 Sequencias intervinientes curtas e longas. Elementos de Inserção (LINE, SINE): 300 bp Alu (a cada 4 kb)
 Duplicação de segmentos cromossômicos, amplificação gênica
 sítios frágeis nos cromossomos
*
Duplicações segmentais: expansão do genôma levando a instabilidade e doenças. 
 Duplicações segmentais = regiões específicas do cromossomo com cópias de DNA repetitivas
 
 Aumentam a ocorrência de crossing-over desigual, causando: 
deleções
amplificações de segmentos de DNA
translocações
inversões
cromossomos marcadores (novas subbandas)
*

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