Caracterização de Proteínas do Complexo de Golgi de Tritrichomonas foetus

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DISSERTAÇÃO DE MESTRADO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Caracterização de Proteínas do Complexo de Golgi de Tritrichomonas 
foetus 
 
 
 
IVONE ROSA DE ANDRADE 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO 
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE 
PROGRAMA DE CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS 
 
 
 
 
RIO DE JANEIRO 
 
2009
 
 
 
 
 
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Ivone Rosa de Andrade 
Caracterização de proteínas do complexo de Golgi de Tritrichomonas foetus/ 
 
Dissertação: Mestrado em Ciências Morfológicas 
Universidade Federal do Rio de Janeiro, IB, CCS, Programa de Pós 
Graduação em Ciências Morfológicas 
Rio de Janeiro, 2009 
 
xvi, 116.: il 
Orientador: Dra. Marlene Benchimol 
 
1. Tritrichomonas foetus. 2. Complexo de Golgi. 3. Ultraestrutura. 4. 
Proteômica. 5. Anticorpos 
 
CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS DO COMPLEXO DE GOLGI DE 
Tritrichomonas foetus 
 
 
 
IVONE ROSA DE ANDRADE 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RIO DE JANEIRO 
2009 
Dissertação de mestrado apresentada ao
Programa de Ciências Morfológicas –
UFRJ como parte das exigências para a
obtenção do grau de Mestre em Biologia
Celular 
 
Orientador: Dra. Marlene Benchimol 
 
CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS DO COMPLEXO DE GOLGI DE 
Tritrichomonas foetus 
 
 
IVONE ROSA DE ANDRADE 
 
 Dissertação submetida ao corpo docente do Programa de Pós-Graduação em Ciências 
Morfológicas – PCM, Instituto de Ciências Biomédicas – ICB, Universidade Federal do Rio 
de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre. 
 
Aprovada por: 
 
______________________________________________________________________ 
Prof. Claudia Mermelstein 
Programa de Ciências Morfológicas – UFRJ 
 
______________________________________________________________________ 
Prof. Narcisa Leal de Cunha e Silva 
Instituto de Biofísica – UFRJ 
 
______________________________________________________________________ 
Prof. Fernando Costa e Silva Filho 
Instituto de Biofísica – UFRJ 
 
______________________________________________________________________ 
Prof. Tecia Ulisses de Carvalho (Revisora) 
Instituto de Biofísica – UFRJ 
 
______________________________________________________________________ 
Prof. Manoel Luis Pereira da Silva Costa (Suplente) 
Programa de Ciências Morfológicas – UFRJ 
 
______________________________________________________________________ 
Prof. Marlene Benchimol (Orientadora) 
Programa de Ciências Morfológicas - UFRJ 
 
 
Rio de Janeiro 
2009 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Essa dissertação foi realizada no Laboratório de Ultraestrutura Celular da Universidade 
Santa Úrsula e na Unidade de Espectrometria de Massa e Proteômica – UEMP na 
Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a orientação da Profa. Marlene Benchimol, com 
o apoio financeiro do CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e 
Tecnológico), PRONEX (Programa de Núcleo de Excelência), FAPERJ (Fundação Carlos 
Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro), CAPES (Coordenação de 
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) e AUSU (Associação Universitária Santa 
Úrsula). 
v 
 
Este trabalho é dedicado 
Aos meus pais, Alaide Rosa e Manoel 
Patrocínio, por serem os pilares da 
minha vida, por estarem comigo em 
minha caminhada, segurando minhas 
mãos e me apoiando. Por abrirem meus 
olhos e iluminarem meu caminho. Por 
tudo que me ensinaram, por todo carinho 
que possibilitou que alcançasse meus 
ideais. 
 
vi 
 
AGRADECIMENTOS 
 
Aos familiares 
 
Aos meus pais, por me apoiarem e me incentivarem a cada conquista. Pelo carinho e 
atenção que dedicaram a mim em todos os momentos. 
 
Aos meus primos Sérgio, Eduardo, Célia, Guilherme, Alexandre e Bruna por torcerem 
por mim e principalmente pelas recordações que me fazem valorizar pequenos momentos. 
 
Aos meus tios Jurimar, Gelson, Luzia, Niel (in memórian) por cuidarem de mim nos 
momentos difíceis e por vibrarem comigo nos momentos de alegria. 
 
Aos meus afilhados Bruno, Lorena e Breno por serem as luzes da minha vida, por me 
permitirem ficar encantada a cada nova descoberta de vocês. 
 
 
Aos colaboradores 
 
Ao Prof. José Morgado por me ensinar as técnicas de isolamento do complexo de 
Golgi, eletroforese e immunoblotting que foram essenciais para o desenvolvimento deste 
trabalho. 
 
A Profª. Narcisa, pela atenção que sempre me dá nos momentos que necessito de 
alguma ajuda científica, por ter aceitado fazer parte da minha banca de projeto e dissertação 
de mestrado e principalmente pelas dicas de imunoprecipitação que aperfeiçoaram e muito os 
nossos resultados. 
 
Ao Prof. Peralta, por permitir que eu acompanhasse o processamento de obtenção de 
anticorpos monoclonais, para que assim eu tivesse um melhor entendimento deste 
procedimento que foi realizado no trabalho, porém não foi desenvolvido por nós. 
 
Ao Dr. Jorge Luiz da Chron Epigen, pela paciência em explicar as etapas do processo 
de obtenção dos anticorpos monoclonais e por tirar minhas dúvidas em relação ao 
procedimento. 
 
A Diva da Cruz, pela atenção e dedicação que demonstrou nos dias de observação das 
etapas do processo de obtenção de anticorpo monoclonais. 
 
A Ana Lúcia e Patrícia, pelas dicas e conselhos de como proceder nas técnicas 
proteômicas. 
 
Aos Profs. Cláudia Mermelstein, Manoel Luis Costa e Fernando Costa e Silva por 
terem aceitado o convite para fazer parte da banca julgadora da minha dissertação de 
mestrado. 
 
A Profª. Tecia pelas dicas e ótima revisão da minha dissertação de mestrado. 
vii 
 
A Juliana pela paciência e pelas várias técnicas que me ensinou durante minha 
iniciação científica, principalmente a ultramicrotomia. 
 
A todos que me ajudaram a romper 2 L de célula para os experimentos de isolamento 
do Golgi e a fazer as inúmeras imunofluorescências durante a seleção dos anticorpos. 
Obrigada é pouco para vocês. 
 
Aos Amigos 
 
A minha amiga Marjolly por esses 7 anos de amizade, pelas conversas (às vezes 
monólogos nos seus momentos de raiva e que você não deixa ninguém falar, né?) pelas 
palavras de incentivo e muitas vezes de consolo (quando você vinha com a frase “Amiga! 
Você quer um consolo? O meu material não voa, o seu voou!!!! rsrsrs”) só você para me fazer 
rir nos momentos em que tudo estava dando errado. E principalmente muito obrigada pela 
atenção e dedicação que você deu a esse trabalho, estando comigo em todos os experimentos 
de proteômica. 
 
Ao Antonio, por ser essa pessoa única, que me ensinou a compreender coisas 
essenciais para manter um bom relacionamento com as pessoas. Por ser essa pessoa bem 
humorada, sempre de bem com a vida que torna nossos dias no laboratório sempre mais 
agradáveis. Obrigada pelas discussões científicas e ajuda em experimentos. Pela energia 
positiva e pelo carinho que você transmite em seus abraços de todas as manhãs. Deixe que as 
pessoas sintam ciúmes da nossa amizade, seremos sempre “amiguinhos” e por isso você vai 
poder apertar quando quiser. 
 
A Gladys, pela amizade construída no dia-a-dia que foi tomando força e hoje você se 
tornou minha irmãzona. Tantos momentos que passamos juntas, muitos bons, alguns ruins, 
mas você sempre cuidando de mim, preocupada comigo. Mesmo distante não me esqueço de 
você, obrigada por tudo. 
 
Ao Victor, meu irmãozinho adotivo, por ser esse menino moleque, às vezesingênuo, 
mas isso é porque seu coração é enorme e eu admiro isso em você. Obrigada pela ajuda no 
laboratório, pelas conversas, pela força no momento de tristeza e pelos chopps de sexta que 
você agitava depois de uma semana exaustiva. 
 
Ao Vilela (Hai!!!), por suas reações e frases inesperadas que sempre quebram o 
silêncio do laboratório... Mas tudo bem!!! Ás vezes um momento de descontração faz bem 
mesmo. Obrigada pelas ajudas nos experimentos e pelo carinho que tem por mim. 
 
A Fernanda (ou devo dizer as Fernandas), porque às vezes você está fazendo 1001 
coisas ao mesmo tempo, mas sempre tem um tempinho para nos ajudar nos experimentos, nas 
culturas de células, nas compras de reagentes. Obrigada por tudo, principalmente pela 
amizade nos últimos tempos. 
 
A Débora (Deb), você conseguiu tirar meu posto de pequininha do laboratório... É, 
realmente esse posto tem muito mais sua cara do que a minha. Mas fico muito feliz por isso, 
pois estou tendo a oportunidade de conhecer a cada dia mais essa pessoa meiga e sempre 
prestativa que você é. 
 
viii 
 
Ao Eli (papai), por todo carinho e cuidado que teve e continua tendo por mim, mesmo 
não trabalhando mais juntos. Obrigada também pelas ajudas no MET. 
 
Ao Rodrigo, que quando estava defendendo sua dissertação de mestrado disse que era 
para eu deixar de trabalhar com Giardia e passar a trabalhar com Trichomonas que era muito 
mais legal. Acho que isso ficou no meu subconsciente. Pois bem, não foi escolha minha, mas 
os caminhos me levaram a trabalhar com Trichomonas e estou muito feliz. Obrigada também 
pelo carinho, atenção e pela ajuda que você me deu durante as visualizações no Multifoton, 
que apesar de não terem sido para este trabalho, ajudaram a responder perguntas de um 
trabalho desenvolvido paralelamente. 
 
Ao Fabio, por me compreender e me dar razão em alguns momentos... Hum!!!! Será 
porque somos muito parecidos... Taurinos!!!! Fome sempre!!! rsrsrs Obrigada pelo 
companheirismo da época de faculdade e pela amizade fora dela. 
 
A Karine, minha amiga de infância, às vezes cabeça dura demais, mas adoro esse seu 
jeito. Finge que é durona nos momentos difíceis e sempre vê o que tem de melhor em cada 
situação. Com certeza sem você na minha vida, ela teria muito mesmo graça. 
 
A equipe do Museu Espaço Ciência Viva, principalmente ao Pedro Persechini, 
Eleonora Kurtenbach, Robson Coutinho, Dona Lurdes e Gustavo Rubini e Sônia, por me 
ensinarem que existe outro jeito de ensinar bem diferente das tradicionais salas de aula. 
Aprendi muito com vocês. A motivação de vocês em ver esse museu crescer e dar certo é 
contagiante. Obrigado por torcerem por mim. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ix 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS 
 
A Prof. Marlene Benchimol, primeiramente pela oportunidade que a senhora me deu 
de poder crescer profissionalmente, me aceitando para fazer parte da sua equipe. Pela 
confiança que depositou em mim e pelo carinho praticamente de mãe que tem demonstrado 
durante esses 5 anos que estamos trabalhando juntas. Por me tranqüilizar no momento difícil 
que passei, por todas as conversas e broncas também, que mesmo sendo poucas me fizeram 
refletir e contribuíram para o meu crescimento profissional e pessoal. Obrigada pela senhora 
ser este exemplo de seriedade e dedicação. 
 
A Prof. Lina Zingali, por aceitar que desenvolvêssemos parte deste trabalho na UEMP, 
pela oportunidade de aprendizado das técnicas bioquímicas e proteômicas. Por vibrar conosco 
a cada resultado obtido e pelas ótimas sugestões para a otimização de nossos resultados. 
 
Ao Rafael, meu anjo protetor que tem estado todo tempo ao meu lado me ajudando e 
cuidando de mim, literalmente segurando em minhas mãos nos momentos difíceis. Pessoa 
especial, dedicada, carinhosa e amiga, você trouxe alegria a minha vida em um momento em 
estava precisando. Simplesmente obrigada por você ser quem você é. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Sei que meu trabalho é uma gota no 
oceano. Mas sem ele, o oceano seria 
menor... (Madre Teresa de Calcutá) 
xi 
 
ÍNDICE 
 
Dedicatória v 
Agradecimentos vi 
Epígrafo x 
Indice xi 
Publicações xiii 
Resumo xiv 
Abstract xv 
Abreviaturas xvi 
1. INTRODUÇÃO 1 
1.1 Tritrichomonas foetus e Tricomonoses 1 
1.1.1 Tricomonose felina 1 
1.1.2. Tricomonose suína 1 
1.1.3 Tricomonose canina 2 
1.1.4 Tricomonose bovina 2 
1.1.5 Tritrichomonas foetus em humanos 4 
1.1.6 Ultraestrutura Celular 5 
1.1.6.1 Superfície Celular 5 
1.1.6.2 Citoesqueleto 6 
1.1.6.2.1 Complexo Pelta-Axóstilo 7 
1.1.6.2.2 Filamentos Parabasais 8 
1.1.6.2.3 Corpúsculos Basais e Filamentos Associados 9 
1.1.6.2.4 Flagelos 10 
1.1.6.3 Vacúolos e Lisossomos 10 
1.1.6.4 Hidrogenossomos 11 
1.1.6.5 Núcleo e Divisão 13 
1.1.6.6 Retículo Endoplasmático 14 
1.1.6.7 Complexo de Golgi 15 
 1.1.6.7.1 Organização Estrutural 15 
 1.1.6.7.2 Funções 16 
 1.1.6.7.3 Complexo de Golgi em tricomonadídeos 18 
1.2. Justificativa 22 
xii 
 
1.2.1 Objetivo Geral 22 
1.2.2 Objetivos Específicos 22 
2. MATERIAL E MÉTODOS 23 
 2.1 Cultivo in vitro 23 
 2.2 Fracionamento Subcelular 23 
 2.3 Produção de Anticorpos Monoclonais 25 
 2.4 C6-NBD-Ceramida 29 
 2.5 Imunofluorescência 29 
 2.6 Microscopia Eletrônica de Transmissão 30 
 2.6.1 Resina Hidrofílica – Unicryl e LR-White 30 
 2.6.2 Resina Hidrofóbica – Epon 31 
 2.7 Técnicas Proteômicas 32 
 2.8 Dosagem de Proteínas – Método de Lowry e Peterson 33 
 2.9 Imunoprecipitação 34 
 2.10 Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE) 34 
 2.11 Revelação do Gel 35 
 2.11.1 Coomassie G-250 35 
 2.11.2 Impregnação pela prata 36 
 2.12 Immunobloting 36 
 2.13 Espectrometria de Massa (MALDI-TOF e MALDI-TOF/TOF) 37 
3. RESULTADOS 39 
 3.1 Fracionamento Subcelular 39 
 3.2 Caracterizações morfológicas da fração do complexo de Golgi 39 
 3.3 Obtenção de anticorpos monoclonais 42 
 3.4 Imunofluorescência 67 
 3.5. Imunocitoquímica 79 
 3.6 Eletroforese em gel de poliacrilamida 89 
 3.7 Immunoblotting 89 
 3.8 Imunoprecipitação 89 
 3.9 Espectrometria de Massa (MALDI-TOF/TOF) 96 
4. DISCUSSÃO 100 
5. CONCLUSÕES 105 
6. REFERÊNCIAS 106 
xiii 
 
 
 
 
 
! Os resultados desta dissertação encontram-se no seguinte manuscrito em preparação: 
 
DE ANDRADE ROSA, I., CARUSO, M. B., MORGADO-DÍAZ, J. A., ZINGALLI, R. B., 
BENCHIMOL, M. Characterization of 60 kDa and 66 kDa proteins of Golgi complex of 
Tritrichomonas foetus. 
 
 
! Os resultados desta dissertação foram apresentados na forma de pôster no seguinte 
congresso: 
 
ROSA, I. A. CARUSO, M. B., MORGADO-DÍAZ, J.A., ZINGALI, R. B., BENCHIMOL. 
M. Identification and characterization of a Golgi complex protein of Tritrichomonas foetus. 
Simpósio de Microscopia no Cerrado realizado entre os dias 24 a 26 de novembro de 2008 no 
Centro de Convenções da Pousada Pirineus em Pirinópolis, GO. 
 
! Durante o desenvolvimento desta dissertação também participei dos seguintes 
trabalhos: 
 
BENCHIMOL, M., DE ANDRADE ROSA, I., DA SILVA FONTES, R., BURLA DIAS, A. 
J. Trichomonas adhere and phagocytose sperm cells: adhesion seems to be a prominent stage 
during interaction. Parasitol Res. 2008.102(4):597-604. 
 
 
ROSA, I. DE A., EINICKER-LAMAS, M., BERNARDO, R. R., BENCHIMOL, M. 
Cardiolipin, a lipid found in mitochondria, hydrogenosomes and bacteria was not detected in 
Giardia lamblia. Exp Parasitol. 2008. 120(3):215-20. 
 
 
 
 
 
xivRESUMO 
 
 Tritrichomonas foetus é um parasita do trato urogenital de gado bovino causando 
inúmeros problemas de saúde como infertilidade, aborto e infecções. Sabe-se atualmente que 
também pode infectar outros animais como: gatos, cães e porcos. Como todos os membros da 
Família Trichomonadidae, T. foetus apresenta diversas organelas peculiares como a costa, 
axóstilo, pelta, hidrogenossomos e filamentos parabasais, entre outros. Possui um aparelho 
Parabasal muito desenvolvido formado pelo complexo de Golgi e filamentos parabasais, 
indicando um papel significativo, análogo ao já descrito em outras células, embora pouco se 
saiba a respeito da composição de proteínas residentes desta organela em T. foetus. Portanto, 
procedemos à purificação do complexo de Golgi de T. foetus e a geração de anticorpos 
monoclonais anti-Golgi que levaram ao isolamento de proteínas de 60 e 66 kDa. Utilizamos 
diversos testes como: imunofluorescência, microscopia eletrônica de transmissão, 
imunoprecipitação, eletroforese, entre outros, para a caracterização destas proteínas. Por 
imunocitoquímica, verificamos que, em T. foetus, estas proteínas estão presentes no Golgi, 
com uma distribuição específica e em algumas vesículas. O anticorpo monoclonal 20.3 
quando testado em controles como Leishmania e Trypanosoma cruzi resultou em uma 
marcação perinuclear, enquanto que em células da linhagem MDCK, a localização foi 
observada no complexo de Golgi, indicando a conservação destas proteínas. Devido à falta de 
banco de dados de T. foetus utilizamos banco de dados de T. vaginalis, por se tratar do 
organismo mais próximo filogeneticamente. Usando técnicas proteômicas foi possível 
identificar seis proteínas ainda não caracterizadas, repetições de anquirina e a reigião N-
terminal da adaptina os quais mostraram homologia com seqüências de aminoácidos da 
proteína caracterizada pelo anticorpo anti-Golgi. Entretanto, outras metodologias como: a 
derivatização da proteína, o seqüenciamento manual e a análise por Q-TOF ainda são 
necessárias para a confirmação dos dados obtidos por espectrometria de massa do tipo 
MALDI-TOF/TOF. 
 
 
 
 
 
 
 
 
xv 
 
 
 
 
ABSTRACT 
 
Tritrichomonas foetus is a parasite of the urogenital tract of cattle causing numerous 
health problems such as infertility, miscarriage and infection. Currently, T. foetus is 
recognized as a parasite that can also infect other animals such as cats, dogs and pigs. Like 
all members of the Family Trichomonadidae, T. foetus presents several unique organelles 
such as the costa, axostyle-pelta complex, hydrogenosomes and parabasal filaments, 
among others. The well developed parabasal apparatus formed by Golgi complex and the 
parabasal filament, indicates a significant role, similar to that previously described in 
other cells, although little is known about the resident-protein composition of this 
organelle. Therefore, we proceeded to the purification of the Golgi complex of T. foetus 
and the generation of anti-Golgi monoclonal antibody that led to the isolation of proteins 
of 60 and 66 kDa. We have used tests such as immunofluorescence, transmission electron 
microscopy, immunoprecipitation, SDS-PAGE, among others, to characterize these 
proteins. By immunocytochemistry, we found that these proteins are present in the Golgi 
of T. foetus, with a specific distribution on it and also in some vesicles. The monoclonal 
antibody 20.3 was also used in controls such as Leishmania and Trypanosoma cruzi and 
resulted in a perinuclear labeling, whereas in the MDCK cell line, the location was 
observed in the Golgi complex, indicating the conservation of these proteins. Due to lack 
of database of T. foetus, we have used the database of T. vaginalis, since it is the 
phylogenetically closer organism. Using proteomics techniques, it was possible to identify 
six uncharacterized proteins, ankyrin repeat protein and adaptin N-terminal region and 
which showed homology with amino acids sequences of proteins isolated by the presently 
studied antibody anti-Golgi. However, other methodologies such as the derivatization of 
the protein, the manual sequencing and analysis by Q-TOF are still needed to confirm the 
data obtained by mass spectrometry of type MALDI-TOF/TOF. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
xvi 
 
xvii 
 
 
 
ABREVIAÇÕES 
 
BSA albumina sérica bovina 
cdg Camundongo 
DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium 
DMSO Dimetilsulfóxido 
DTT Ditiotreitol 
FG Fração do Golgi 
GTP Guanosina trifosfato 
HAT Hipoxantina, Aminopterina e Timidina 
HGPRT Hypoxantina Guanina Fosforibosil Transferase 
HT Hipoxantina e Timidina 
IAA Iodoacetamida 
IP Imunoprecipitação 
MALDI Matrix-assisted laser desorption/ionization 
MDCK Madin-Darby Canine Kidney Cells 
MS Mass spectrometry 
NCBInr National Center for Biotechnology não redundante 
PEG Polietilenoglicol 
PNS Sobrenadante pós nuclear 
Q-TOF Quadrupole time-of-flight 
 TTP Timidina trifosfato 
TCA Ácido tricloroacético 
TOF Time-of-flight mass spectrometer 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1 
 
1. INTRODUÇÃO 
1.1 TRITRICHOMONAS FOETUS E TRICOMONOSES 
Tritrichomonas foetus é um protozoário descrito inicialmente como um parasito do 
sistema reprodutor bovino. Atualmente, os microrganismos desta espécie têm sido 
encontrados também no sistema digestivo de gatos, cães e porcos. 
 
1.1.1 Tricomonose felina 
A tricomonose felina é uma doença caracterizada por afetar o intestino grosso de 
gatos, principalmente de gatos jovens e filhotes (FOSTER et al., 2004; GOOKIN et al., 2001; 
LEVY et al., 2003). Este tipo de tricomonose pode apresentar como sinais clínicos diarréia 
crônica associada com sangue e/ou muco, flatulência e irritação anal (FOSTER et al., 2004; 
STOCKDALE et al., 2006). Porém, muitos gatos infectados só apresentam o quadro de 
diarréia semanas ou meses após a infecção, conseqüentemente, estes animais apresentam 
problemas na eliminação do parasito, não tendo uma cura espontânea (STOCKDALE et al., 
2008). 
 
1.1.2 Tricomonose suína 
Em suínos, T. foetus foi descrito inicialmente como outra espécie de Trichomonas, 
chamada de Tritrichomonas suis. Embora apresentassem hospedeiros diferentes, estudos têm 
descrito T. foetus e T. suis como sendo a mesma espécie, por serem idênticos 
morfologicamente. Além disso, evidências de estudos de microscopia eletrônica de 
transmissão, cultura in vitro, ensaios bioquímicos e imunológicos têm demonstrado que estes 
dois tricomonadídeos podem realmente se tratar da mesma espécie (MATTOS et al., 1997; 
LUN et al., 2005; RIVERA et al., 2008). Este protozoário é comumente encontrado na 
2 
 
cavidade nasal, estômago, ceco, cólon e ocasionalmente no intestino delgado de porcos (LUN 
et al., 2005). Porém, nestes animais T. foetus é um protozoário comensal e devido a isto não 
há relatado de sinais clínicos em porcos infectados (TACHEZY et al., 2002). 
 
1.1.3 Tricomonose canina 
A descrição de tricomonadídeos em fezes de caninos com diarréia já foi relatada com 
base em caracterizações morfológicas. As infecções causadas por estes organismos eram 
classificadas como oportunistas ocasionadas por Pentatrichomonas hominis. No entanto, a 
caracterização molecular desses tricomonadídeos só foi descrita recentemente através da 
análise gênica das seqüências de rRNA, revelando assim, a identidade dos tricomonadídeos 
observados nas fezes de cães com diarréia. Com base nesse estudo, os tricomonadídeos 
encontrados apresentaram 100% de identidade com Tritrichomonas foetus ou P. hominis 
(GOOKIN, et al., 2005). 
 
1.1.4 Tricomonose bovina 
Em bovinos, T. foetus é descrito como o agente causador da tricomonose urogenital, 
uma doença sexualmentetransmissível (DST) (HONIGBERG, 1978). Trata-se de um parasito 
monogenético, capaz de habitar o trato reprodutivo bovino incluindo regiões como o 
prepúcio, a região distal do pênis, vagina e útero (HONIGBERG, 1978). A tricomonose 
urogenital bovina é transmitida através da monta ou do uso de sêmen contaminado, levando a 
um grande prejuízo econômico (HONIGBERG, 1978; ALSTAD et al., 1984; BONDURANT, 
1985). 
O ciclo celular de T. foetus in vitro foi estimado em seis horas (RIBEIRO, 1997), onde 
os trofozoítos se multiplicam por divisão binária longitudinal, através de uma mitose do tipo 
3 
 
fechada com fuso extranuclear (HEATH, 1980; CAVALIER-SMITH & CHAO, 1996; 
DACKS & REDFIELDS, 1998; RIBEIRO et al., 2000). 
Estudos filogenéticos realizados ao nível molecular utilizando a subunidade menor do 
RNA ribossomal, foram utilizados para classificar esse organismo como sendo um dos 
eucariotos mais primitivos (LEIPE et al., 1993; VISCOGLIOSI & BRUGEROLLE, 1993; 
VISCOGLIOSI et al., 1999). Desta forma, foi enquadrado com a seguinte classificação 
taxonômica: 
Filo Parabasalia 
Classe Zoomastigophorea 
Ordem Trichomonadida 
Família Trichomonadidae 
Gênero Trichomonas 
Espécie Tritrichomonas foetus 
A tricomonose urogenital bovina ainda é pouco estudada devido a algumas 
dificuldades encontradas, entre elas, o custo de se manter animais experimentais, ausência de 
modelos de laboratório confiáveis e a ausência de linhagens celulares que possam reproduzir 
características do tecido ou órgão. Células epiteliais e também não epiteliais tais como: 
células epiteliais humanas (WISH) e células de rim de cachorro (MDCK) têm sido 
empregadas nos estudos de interação entre tricomonas e células hospedeiras (ALDERETE & 
PEARLMAN, 1984; KRIEGER et al., 1985, RASMUESSEN et al., 1986; SILVA FILHO & 
DE SOUZA, 1988). 
A adesão de tricomonadídeos, assim como em outros processos de interação célula-
célula, é um fenômeno muito complexo precedido pela etapa de reconhecimento celular. A 
adesina TF190 (SHAIA et al., 1998) demonstrou ter capacidade de reconhecimento de 
moléculas de células hospedeiras, favorecendo assim a citoaderência do parasito. Ainda pouco 
4 
 
se sabe sobre os componentes das células epiteliais envolvidos no processo de 
reconhecimento pelos tricomonadídeos. Porém, alguns glicoconjugados de domínios apicais 
de MCDK-I são candidatos, principalmente em interações com T. foetus (BONILHA et al., 
1995). Lectinas presentes na superfície dos trichomonadideos também parecem apresentar 
uma grande importância no reconhecimento de células epiteliais (BABÁL & RUSSEL, 1999). 
O mecanismo pelo qual o parasito provoca alterações às células hospedeiras ainda não 
é totalmente compreendido. Entretanto, foi sugerido que citotoxinas solúveis, principalmente 
cisteíno-proteases liberadas pelo parasito possam ter um papel importante no efeito citotóxico 
nas células hospedeiras e na infecção (ARROYO & ALDERETE, 1995; THOMFORD et al., 
1996; PETRIN et al., 1998; MENDONZA-LOPEZ et al., 2000; QUE & REED, 2000; SAJID 
& MCKERROW, 2002). Além disso, essas citotoxinas também podem agir como fatores de 
virulência (ARROYO & ALDERETE, 1989; NEALE & ALDERETE, 1990; ARROYO & 
ALDERETE, 1995; MALLINSON et al., 1994; MALLINSON et al., 1995; THOMFORD et 
al., 1996), como fatores de adesão (CROUCH & ALDERETE, 1999; MENDONZA-LOPEZ 
et al., 2000; ALVAREZ-SANCHEZ et al., 2000) e ainda como fatores que contribuem para a 
patogenicidade quando liberado na superfície da mucosa hospedeira (TALBOT et al., 1991; 
BASTIDA-CORCUERA et al., 2000). 
Estudos recentes foram capazes de demonstrar a destruição de células epiteliais 
vaginais bovinas quando em interação de T. foetus (SINGH et al., 1999). Este dano causado 
às células epiteliais seria provocado pela indução de apoptose que pode ser causada por 
cisteíno-protease de 30kDa (SINGH et al., 2004). 
 
1.1.5 Tritrichomonas foetus em humanos 
 Recentemente, a identificação de algumas espécies de tricomonadídeos feita em 
pulmões de humanos foi realizada através de estudos imunológicos e moleculares. Os 
5 
 
resultados apontaram reações positivas para T. vaginalis (DUBOUCHER et al., 2003), P. 
hominis (JONGWUTIWES et al., 2000), T. tenax (MALLAT, et al., 2004), T. gallinarum 
(KUTISOVA et al., 2005) e T. foetus (DUBOUCHER et al.,2006). A identificação desses 
dois últimos protozoários cria dúvidas a respeito do potencial zoonótico dos tricomonadídeos, 
embora a possibilidade de cepas adaptadas aos humanos não possa ser excluída. A presença 
de tricomonadídeos no trato respiratório de humanos não é incomum e faz com que a real 
freqüência destes microrganismos no pulmão seja questionada (DUBOUCHER et al., 2008). 
A presença de tricomonadídeos como um agente coinfectante foi relata em 60% dos 
pacientes com pneumonia causada por Pneumocystis jiroveci. Em casos em que a doença é 
provocada por fungos essa porcentagem pode atingir 100%. Este fato pode ocorrer devido ao 
ambiente propício criado pela obstrução dos alvéolos, por fungos ou por debris celulares, 
gerando um local de hipóxia. Isso leva a crer que a hipóxia alveolar seja um fator que 
favoreça o desenvolvimento de tricomonadídeos mais do que a imunodepressão 
(DUBOUCHER et al., 2008). 
 
1.1.6 Ultraestrutura Celular 
 1.1.6.1 Superfície Celular 
A superfície celular compreende a membrana plasmática da célula e o glicocálice, ou 
seja, a bicamada lipídica com proteínas integrais, periféricas e/ou ancoradas e os carboidratos, 
associados covalentemente a proteínas ou lipídeos do lado externo da membrana, formando 
glicoproteínas e glicolipídeos, respectivamente (ALBERTS et al., 2004). 
A membrana plasmática de T. foetus apresenta três regiões fisiologicamente distintas: 
a membrana que recobre o corpo do parasito, a membrana ondulante e os flagelos. A região 
que recobre o corpo do parasito apresenta um glicocálice bastante desenvolvido, apresentando 
um aspecto ondulado, quando visto por criofratura (BENCHIMOL, et al., 1992). 
6 
 
Na região flagelar é possível verificar áreas de especialização bem definidas, como a 
membrana que reveste os flagelos. Esta possui uma menor densidade de partículas 
intramembranosas quando observadas por criofratura, quando comparada com a membrana do 
corpo da célula. Estas partículas tratam-se de proteínas integrais, as quais teriam a função de 
conectar o citoesqueleto com a organização do axonema (BENCHIMOL et al., 1992). Na 
membrana dos flagelos anteriores observam-se arranjos circulares de partículas 
intramembranosas, formando rosetas, que poderiam ter funções sensoriais (BENCHIMOL et 
al., 1992). Outra região especializada é o colar ciliar ou necklace, observada na região de 
onde emergem os flagelos anteriores. Entretanto, sua função ainda é desconhecida 
(BENCHIMOL et al., 1992). 
A membrana ondulante, que liga o flagelo recorrente ao corpo do parasito, acompanha 
o batimento deste flagelo, sugerindo que deva atuar dissipando as vibrações causadas pela 
força propulsora. Concentrado nesta membrana encontra-se uma extensa trama de filamentos 
estáveis do citoesqueleto deste organismo (GERMOT et al., 1996). 
 
 1.1.6.2 Citoesqueleto 
Os tricomonadídeos apresentam um citoesqueleto (FIGs. 1 e 2) formado 
principalmente pelo complexo pelta-axóstilo, a costa, os filamentos parabasais, os corpúsculos 
basais e filamentos associados, os filamentos sigmóides, o corpo infra e supra-cinetosomal. 
Entretanto, ainda não se tem descrito a funcionalidade das duas últimas estruturas citadas. 
7 
 
 
Figura 1. Esquema de Tritrichomonas foetus mostrando as principais estruturas: FA: flagelos 
anteriores; A: axóstilo; CB: corpúsculo basal; C: costa;RE retículo endoplasmático; G: Golgi; H: 
hidrogenossomos; L: lisossomos; N: núcleo; Nu: nucléolo; P: pelta; FP: filamento parabasal; FR: 
flagelo recorrente; MO: membrana ondulante; V: vacúolo; Gl: glicogênio (Retirado de 
BENCHIMOL, 2004). 
 
 1.1.6.2.1 Complexo Pelta-axóstilo 
O complexo pelta-axóstilo é uma estrutura formada por microtúbulos estáveis 
(RIBEIRO et al., 2000), embora alguns trabalhos admitam que essas estruturas se 
despolimerizem (VISCOGLIOSI & BRUGEROLLE, 1994). Além disso, o complexo pelta-
axóstilo possui uma participação importante no processo de divisão celular, promovendo a 
constrição do núcleo na etapa de cariocinese (RIBEIRO et al., 2000). 
8 
 
 O axóstilo consiste em uma fita disposta longitudinalmente desde a porção anterior 
até o final da porção posterior da célula, onde esta estrutura empurra a membrana plasmática 
(BENCHIMOL et al., 2000). A pelta (FIG. 1, P), também formada por microtúbulos está 
localizada na porção anterior da célula. Esta estrutura parece desempenhar o papel de 
sustentação da parede do canal periflagelar, do qual os flagelos emergem. 
 
 1.1.6.2.2 Filamentos Parabasais 
Os filamentos parabasais (FIGs. 1 e 2, FPs) estão presentes em todos os 
tricomonadídeos e são encontrados próximos à face Cis do complexo de Golgi 
(HONIGBERG & BRUGEROLLE, 1990). São estruturas formadas por polímeros que 
possuem uma periodicidade com bandas claras e escuras alternadas, apresentando assim, um 
aspecto de fibra estriada (VISCOGLIOSI & BRUGEROLLE, 1994). A associação destes 
filamentos com o complexo de Golgi forma o aparelho parabasal (HONIGBERG & 
BRUGEROLLE, 1990). Além disso, verificou-se uma conexão estrutural entre a primeira 
cisterna do complexo de Golgi e esta estrutura periódica, sugerindo um papel funcional desses 
filamentos na migração do Golgi, junto com os corpúsculos basais e os flagelos, durante a 
mitose (BENCHIMOL et al., 2001). 
 
 
 
 
 
 
 
 
9 
 
 
 
 
 
Figura 2. Esquema da região anterior de T. foetus mostrando a proximidade do complexo de Golgi 
(G) com os filamentos parabasais (FP1 e FP2), além de estruturas de citoesqueleto como: Costa (C); 
Corpúsculos Basais (CB1,CB2 e CB3); Corpo supra-cinetosomal (CS); Flagelo recorrente (FR); 
Membrana Ondulante (MO). (MARLENE BENCHIMOL, não publicado) 
 
 1.1.6.2.3 Corpúsculos Basais e Filamentos Associados 
Os corpúsculos basais (FIGs. 1 e 2, CBs) são estruturas das quais se originam os 
flagelos e estão localizados na região anterior da célula (HONIGBERG et al., 1971). Estas 
estruturas encontram-se associadas a filamentos que podem ser contráteis, como as fibras de 
centrina ou não contrátil como é o caso da costa (VISCOGLIOSI & BRUGEROLLE, 1994; 
10 
 
BRUGEROLLE et al., 2000). Muitos outros filamentos associados aos corpúsculos basais 
estão dispostos em lamelas em forma de ganchos. 
A costa é uma estrutura protéica estriada, que se estende da região do corpúsculo basal 
do flagelo recorrente até a região posterior do parasito (BENCHIMOL et al., 1993). Está 
presente somente nos tricomonadídeos que possuem membrana ondulante. Devido a isto, 
acredita-se que sua função esteja relacionada com o suporte do estresse mecânico e a 
sustentação da mesma (HONIGBERG et al., 1971). 
 
 1.1.6.2.4 Flagelos 
Os flagelos dos tricomonadídeos apresentam variações quanto ao número dentre as 
diferentes espécies desse grupo. T. foetus possui três flagelos anteriores (FIG. 1, FA) e um 
recorrente (FIGs. 1 e 2, FR). Os flagelos anteriores emergem da célula pelo canal flagelar, 
enquanto o flagelo recorrente surge da abertura latero-dorsal deste canal (WARTON & 
HONIGBERG, 1979; BENCHIMOL, 2004). 
 
 1.1.6.3 Vacúolos e Lisossomos 
A capacidade endocítica de T. foetus vem sendo investigada com o uso de diversos 
marcadores como Lucifer yellow, peroxidase e proteínas conjugadas com partículas de ouro 
(albumina, lactoferrina, transferrina, lectinas) (BENCHIMOL et al., 1986, 1990; AFFONSO 
et al., 1994, 1997). 
Duas vias endocíticas, uma mediada por receptores e outra de fase fluida, foram 
caracterizadas em T. foetus através da ligação específica e da internalização da lactoferrina 
(BRUGEROLLE, 1971; PETERSON & ALDERETE, 1984; AFFONSO, et al., 1997). Por 
outro lado, a fagocitose em T. foetus tem sido estudada através da interação deste parasito 
com outras células como hemácias (DE CARLI et al., 2004) e espermatozóides 
11 
 
(BENCHIMOL et al., 2007). Nestes trabalhos, T. foetus mostrou ser capaz de estabelecer a 
adesão com estas células e posteriormente internalizá-las. 
Os lisossomos (FIG. 1, L) em tricomonadídeos estão presentes como grandes 
compartimentos citoplasmáticos, os quais participam da atividade endocítica, e demonstram 
reação positiva em ensaios citoquímicos para fosfatase ácida (BENCHIMOL, 1999). Apesar 
de não existir uma região preferencial para a ocorrência da endocitose, os lisossomos e 
fagolisossomos encontram-se localizados predominantemente na região posterior dos 
tricomonadídeos (AFFONSO et al., 1994, 1997; BENCHIMOL & DE SOUZA, 1995). 
 
 1.1.6.4 Hidrogenossomos 
Os tricomonadídeos são organismos que não apresentam mitocôndrias, porém 
apresentam organelas chamadas hidrogenossomos (FIGs.1, 3a, H), responsáveis pelo 
metabolismo energético destes organismos. Esta organela foi descrita em T. foetus como um 
compartimento subcelular capaz de produzir hidrogênio molecular e ATP (LINDMARK & 
MÜLLER, 1973). 
Os hidrogenossomos encontram-se geralmente associados a grânulos de glicogênio e a 
estruturas do citoesqueleto, como o axóstilo e a costa (BENCHIMOL & DE SOUZA, 1983; 
BENCHIMOL et al., 1996; BENCHIMOL et al., 2000). A associação dos hidrogenossomos 
com o retículo endoplasmático também já foi reportada, o que poderia ser um indício de 
fornecimento de lipídios para o crescimento dos hidrogenossomos (BENCHIMOL et al., 
1996; BENCHIMOL et al., 2000). A proximidade dos hidrogenossomos com outras estruturas 
celulares poderia estar relacionada ao fornecimento de ATP, tal como ocorrem com a 
associação já descrita entre mitocôndrias e microtúbulos em células de eucariotos superiores 
(HEGGENESS et al., 1978). 
12 
 
 Alguns autores consideram esta organela como uma variação das mitocôndrias que se 
adaptaram a vida anaeróbica (BIAGINI et al., 1997; EMBLEY et al., 2003). 
Entre as semelhanças já apresentadas pode-se destacar a participação na produção de 
ATP pela degradação do piruvato (LINDMARK & MÜLLER, 1973; MÜLLER, 1993, BUI et 
al., 1996), assumindo o papel energético tanto nas mitocôndrias quanto nos hidrogenossomos 
e a presença da dupla membrana (BENCHIMOL et al., 1982b), aproximando estas duas 
organelas em relação à mesma origem evolutiva. Além disso, a divisão dos hidrogenossomos 
pode ocorrer por partição ou por segmentação, assim como nas mitocôndrias. Na partição, a 
divisão se inicia com uma invaginação da membrana interna do hidrogenossomo, formando 
um septo transversal que separa a matriz da organela em dois compartimentos. Já no processo 
de segmentação ocorre primeiro o alongamento da organela e a formação de uma constrição 
na sua porção central (BENCHIMOL et al., 1996). Recentemente, outras semelhanças foram 
identificadas, tais como: a presença de translocases na membrana interna dos 
hidrogenossomos de tricomonadídeos (SUTAK et al., 2004), a presença de centros de Fe-S 
(Centros de ferro e enxofre, DOLEZAL et al., 2005) semelhantes aos mitocondriais e a 
presença de cardiolipina (DE ANDRADE ROSA et al., 2006), fosfolipídio típico de 
membranas bacterianas e da membrana mitocondrial interna. 
Entretanto, os hidrogenossomos e as mitocôndrias diferem em alguns aspectos. Aindanão foram descritas em hidrogenossomos a presença de citocromos e nem a atividade de F0-F1 
ATPase (LLOYD et al., 1979). A presença de um material genético apesar de ter sido 
sugerida inicialmente (CERKASOVOVÁ et al., 1976), não foi identificada por técnicas de 
fluorescência (TURNER & MULLER, 1983) ou de nick-translation (CLEMENS & 
JOHNSON, 2000), sugerindo que, possivelmente, tenha ocorrido uma evasão total para o 
compartimento nuclear (JOHNSON et al., 1993). 
13 
 
Porém, a origem dos hidrogenossomos ainda é um assunto de grande debate, sendo 
que no momento os autores apresentam duas vertentes. A primeira defende que os 
hidrogenossomos teriam surgido a partir de um ancestral mitocondrial de metabolismo 
aeróbico, o qual utilizava o oxigênio como aceptor final enquanto a outra sugere que essa 
organela funcionava em condições anaeróbicas e, consequentemente produziam hidrogênio, 
como ocorre com os hidrogenossomos (TJADEN et al., 2004). Com isso, inúmeros estudos 
têm sido desenvolvidos com o intuito de procurar semelhanças entre os hidrogenossomos e as 
mitocôndrias, tanto ao nível bioquímico, molecular, quanto ao nível ultraestrutural. 
 
 1.1.6.5 Núcleo e Divisão 
Os tricomonadídeos quando não estão em processo de divisão apresentam um único 
núcleo (FIGs. 1, 3a, N) localizado preferencialmente na região anterior da célula. O envoltório 
nuclear é formado por duas membranas, as quais apresentam complexos dos poros 
característicos (BENCHIMOL et al., 1982a). A matriz nuclear possui filamentos organizados 
diferentes dos filamentos presentes em outros organismos, onde a região abaixo do envoltório 
nuclear apresenta uma malha mais frouxa que a região central (RIBEIRO, 1997). 
 Estes protozoários apresentam um tipo diferente de divisão, chamada de mitose 
fechada. A mitose dos tricomonadídeos é caracterizada por não apresentar fragmentação do 
envoltório nuclear e pela presença de um fuso extranuclear, o qual, aparentemente, não 
estabelece contato direto com os cromossomos (BRUGEROLLE et al., 1974). Segundo 
Ribeiro e colaborados (2000), T. foetus possui seis fases distintas da mitose. (1) A intérfase 
(G1), onde o parasito apresenta aspecto pirifome e estruturas ainda não duplicadas; (2) a pré-
mitose (S/G2) que compreende a etapa em que todas as estruturas de citoesqueleto e o 
material genético são duplicados. O complexo pelta-axóstilo não desaparece durante a mitose, 
pois tem um papel fundamental na mudança de forma da célula e na cariocinese; (3) na 
14 
 
prófase, ocorre um aumento de volume da célula; (4) a metáfase é caracterizada pela migração 
dos corpúsculos basais para pólos opostos na célula, fazendo com que ocorra a migração dos 
flagelos e dos complexos pelta-axóstilo. Devido à migração destas estruturas, o protozoário 
assume uma forma triangular. A formação da placa metafásica não foi observada até o 
momento, permanecendo uma incógnita sobre o que acarretaria a segregação dos 
cromossomos; (5) na transição metáfase-anáfase o batimento dos flagelos auxilia no 
deslocamento dos axóstilos para sentidos opostos, posicionados de forma cruzada no interior 
da célula. Desta forma, seria possível promover a torção da mesma e o estrangulamento do 
núcleo, acarretando a citocinese; (6) a transição anáfase-telófase: é a etapa em que ocorre o 
afastamento dos núcleos e a separação das duas células-filhas. 
 
 1.1.6.6 Retículo Endoplasmático 
O retículo endoplasmático de tricomonadídeos é normalmente visualizado ao redor do 
núcleo formando a membrana externa do envoltório nuclear (QUEIROZ et al., 1991). Esta 
organela pode ser encontrada também próxima aos hidrogenossomos (HONIGBERG, 1978; 
BENCHIMOL et al., 1996, 2000), e ao axóstilo (BENCHIMOL et al., 2000). Os ribossomos 
podem ser visualizados aderidos à membrana do retículo endoplasmático, formando o retículo 
endoplasmático rugoso, ou livres no citoplasma (BENCHIMOL et al., 2001) (FIG. 3b). 
Evidências têm demonstrado a sua participação também em processos de autofagia e 
seqüestro de cálcio (BENCHIMOL et al., 1996; BENCHIMOL, 1999; DE SOUZA & 
BENCHIMOL, 1988). 
Durante a mitose dos tricomonadídeos, o retículo endoplasmático se alinha de modo 
paralelo com os microtúbulos do fuso mitótico, sugerindo um recurso de fornecimento de 
cálcio para a divisão celular do parasito (RIBEIRO et al., 2002). 
 
15 
 
 
 1.1.6.7 Complexo de Golgi 
 1.1.6.7.1 Organização Estrutural 
O complexo de Golgi é dotado de uma polaridade por possuir em cada pilha duas 
faces distintas: uma face cis, também conhecida como face de entrada e uma face trans ou 
face de saída. Ambas as faces apresentam-se intimamente associadas a compartimentos 
especiais, compostos por uma rede interconectada de estruturas tubulares e de cisternas. Por 
sua vez, as cisternas são agrupadas de acordo com a localização, morfologia e composição 
química. Assim, as cisternas mais próximas do retículo endoplasmático (RE) e de 
conformação convexa são denominadas cisternas cis, as posicionadas na região central do 
Golgi são as cisternas médias e as mais côncavas e próximas do sítio de saída da célula, são 
chamadas de cisternas trans (FIG. 3). 
Além disso, existem compartimentos formados por estruturas membranosas tubulares 
conectadas ou por vesículas, denominados rede Golgi cis (CGN) e rede Golgi trans (TGN). A 
rede Golgi cis, também chamada de compartimento intermediário entre RE e Golgi (ERGIC) 
está localizado entre o retículo endoplasmático (RE) e o sítio de entrada do Golgi. É a face de 
entrada do Golgi, que recebe as proteínas recém sintetizadas do RE e as transporta para a 
cisterna cis (DEAN & PELHAM, 1990; SEMENZA et al., 1990). Por outro lado, o TGN 
segue as cisternas TRANS sendo o sítio de saída de sustâncias para outros compartimentos da 
célula ou do meio extracelular (BERTACHINI-LOMBELLO et al., 2001). 
As membranas dos diferentes compartimentos do complexo de Golgi diferem quanto a 
sua composição lipídica e proteica. Entre as proteínas presentes no Golgi são encontradas 
principalmente enzimas, proteínas estruturais e proteínas envolvidas na formação e 
direcionamento de vesículas. Devido a esta diferença de conteúdo enzimático é possível 
16 
 
destacar algumas enzimas que são tidas como marcadoras por serem específicas de um 
determinado compartimento (TEASDALE & JACKSON, 1996). 
 
 
 
Figura 3. Esquema tridimensional do Complexo de Golgi mostrando os sub- compartimentos desta 
organela. A face cis corresponde a região mais próxima do retículo endoplasmático e a face trans a 
mais próxima da membrana plasmática (Adaptado de ALBETS et al. 2004). 
 
 1.1.6.7.2 Funções 
O Complexo de Golgi é responsável por desenvolver importantes funções celulares, 
tais como: (1) é um dos principais sítios de síntese de carboidratos, produzindo a maioria dos 
polissacarídeos celulares. Além disso, sua posição na saída da rota do RE facilita a adição de 
oligossacarídeos são adicionados como cadeias laterais em proteínas e lipídeos enviados pelo 
RE; (2) é uma estação de classificação e endereçamento dos produtos sintetizados no retículo 
endoplasmático, direcionando para a membrana plasmática ou para outras organelas; (3) 
biogênese dos lisossomos; (4) acúmulo de cálcio (ALBERTS et al., 2004). 
A adição de açúcares a proteínas e lipídeos durante o processo de glicosilação é de 
extrema importância, pois é sabido que a presença de açúcares confere uma menor 
17 
 
flexibilidade e carga negativa, fundamental para a estrutura quartenária das proteínas. Além 
disso, este processo é fundamental para dificultar a ação de enzimas proteolíticas (JENTOFT, 
1990). A glicosilação do tipo N é iniciada no RE com a adição de uma cadeia de 14oligossacarídeos que são transferidos em bloco único a um resíduo de asparagina. Esse 
processo tem continuidade no Golgi com o objetivo de diferenciar as porções glicídicas das 
diferentes glicoproteínas (ALBERTS et al., 2004). A glicosilação de oligossacarídeos O-
ligados também ocorre nesta organela, porém neste caso, os açúcares são adicionados um a 
um a um radical OH lateral de um aminoácido serina ou treonina (JENTOFT, 1990). 
As modificações protéicas ocorrem nos diferentes compartimentos do Golgi através do 
transporte vesicular. Para isso, existem proteínas que auxiliam no direcionamento deste 
transporte. O complexo de proteínas de revestimento do tipo II (COPII) gera vesículas que 
realizam o movimento progressivo, ou seja, carreaiam vesículas oriundas do RE para o Golgi. 
Por outro lado, o complexo de proteínas de revestimento do tipo I (COPI) permite o fluxo de 
membranas através de um transporte retrógrado de vesículas que brotam do complexo de 
Golgi e do ERGIC em direção ao retículo endoplasmático (HAURI & SCHWEIZER, 1992). 
Normalmente, o estudo desse compartimento é realizado através da localização de 
uma proteína residente, a proteína E53 (SCHWEIZER et al., 1988). Essa proteína cicla 
rapidamente do RE para o ERGIC, atuando como um receptor para o transporte de 
glicoproteínas realizando entre o RE e ERGIC (HAURI et al., 2000). Além disso, a fosfatase 
ácida é usada como enzima marcadora deste compartimento (JENTOFT, 1990; TEASDALE 
& JACKSON, 1996). 
As vesículas que brotam do ERGIC se fundem com a primeira cisterna do Golgi, a 
cisterna cis. Esta é caracterizada por ser o local das reações de fosforilação (ALBERTS et al., 
2004). Uma importante função desse processo está relacionada com a doação de fosfato a um 
ou mais resíduos de manose das enzimas lisossomais para a formação de resíduos de manose-
18 
 
6-fosfato. A presença de manose-6-fosfato em enzimas funciona como sinal, que ao ser 
reconhecido por receptores são encaminhadas para os lisossomos. Nessa cisterna, duas 
enzimas são consideradas marcadoras, as manosidases I e II (KORNFELD, 1987). 
Nas cisternas da região medial a localização da manosidase III e da N-
acetilglicosamina transferase nestas cistenas permitem afirmar que a remoção de resíduos de 
manose e a adição de N-acetilglicosamina são modificações restritas deste compartimento do 
Golgi. 
A reação de sulfatação ocorre a partir do doador de sulfato PAPS (3-fosfoadenosina-
5´-fosfosulfato) presente no lúmem das cisternas da região trans. O sulfato é adicionado aos 
proteoglicanos, proteínas secretadas e a domínios extracelulares de proteínas e lipídeos da 
membrana plasmática, conferindo a estes carga negativa (DICK et al.,, 2008). Assim como 
nas outras cisternas, a participação da cisterna trans no processo de glicosilação foi 
comprovada através da localização da galactositransferase e da sialiltransferase, enzimas que 
adicionam galactose e ácido siálico, respectivamente as proteínas em processamento 
(WEINSTEIN et al., 1982). Sugere-se que o lúmen da cisterna trans seja contínuo à rede trans 
do Golgi, onde as proteínas são secretadas para dentro de pacotes de transporte e endereçadas 
para seus destinos finais (GRIFFITHS & SIMONS,1986). 
 
 1.1.6.7.3 Complexo de Golgi em Tricomanadídeos 
Sabe-se que o complexo de Golgi desempenha importantes funções celulares, como a 
glicosilação do tipo N e O de proteínas e lipídios, endereçamento e biossíntese dos 
lisossomos. Ainda existem poucos estudos relacionados a esta organela em tricomonadídeos 
no que diz respeito à sua estrutura e função (BENCHIMOL & DE SOUZA, 1985; QUEIROZ 
et al., 1991; DÍAZ & DE SOUZA, 1998; BENCHIMOL et al., 2001). 
19 
 
Nos tricomonadídeos, o complexo de Golgi é único e bastante proeminente (FIG. 4a), 
ao contrário do que ocorre com outros protozoários parasitos como Toxoplasma e 
Trypanosoma (HONIGBERG & BRUGEROLLE, 1990). Em tricomonas, esta organela pode 
medir de 4,7-6µm de comprimento e 1-1,2µm de largura, apresentando 8 a 12 cisternas 
alongadas e localiza-se na porção dorsal da célula e a direita do núcleo (FIGs. 4a - 4b). 
Pequenas vesículas sem revestimento com 40 nm de diâmetro e outras com revestimento 
medindo 75 nm de diâmetro foram descritas como associadas à porção lateral das cisternas do 
Complexo de Golgi (BENCHIMOL et al., 2001). 
 Em tricomonas, os filamentos parabasais (FIGs. 2, 4a) encontram-se associados à esta 
organela formando o aparelho Parabasal (HONIGBERG & BRUGEROLLE, 1990). Conexões 
filamentosas foram observadas interligando a cisterna cis com os filamentos parabasais 
(BENCHIMOL et al., 2001), sugerindo que este sistema possa proporcionar uma sustentação 
às cisternas do Golgi (HONINGBERG & BRUGEROLLE, 1990). 
 Os filamentos parabasais são estruturas caracterizadas por apresentar uma 
periodicidade semelhante à encontrada na costa. Entretanto, os filamentos parabasais diferem 
por serem mais delgados e apresentam-se em número de dois, sendo assim denominados 
filamentos parabasais 1 e 2 (FP1 e FP2) (HONINGBERG & BRUGEROLLE, 1990). 
 Estudos citoquímicos mostraram a presença das enzimas tiaminopirofosfatase e 
fosfatase ácida nas cisternas cis e trans do Golgi de tricomonadídeos, repectivamente 
(QUEIROZ et al., 1991; BENCHIMOL et al., 2001). Além disso, a técnica de Thiéry foi 
capaz de demonstrar a presença de açúcares na membrana desta organela (BENCHIMOL & 
DE SOUZA, 1985; BENCHIMOL et al., 2001). Posteriormente, com o uso de lectinas como 
WGA (Wheat germ agglutinin) fluorescentes e conjugadas ao ouro coloidal foi possível 
comprovar a presença de resíduos de N-acetil-glicosamina (BENCHIMOL et al., 2001; 
BENCHIMOL & BERNARDINO, 2002). O emprego da técnica de iodeto de zinco-tetróxido 
20 
 
de ósmio (ZIO) proporcionou a visualização de fenestras nos sáculos do Golgi e 
interconexões entre as cisternas do mesmo (BENCHIMOL & DE SOUZA, 1985; 
BENCHIMOL et al., 2001). Por freeze-etching foi possível descrever estruturas filamentosas 
conectando uma face à outra das cisternas do Golgi (BENCHIMOL et al., 1993). 
 Além disso, métodos bioquímicos foram capazes de revelar que o Golgi de tricomonas 
desempenha um papel importante no acúmulo de cálcio, sendo o principal sítio com esta 
função nestes organismos (ALMEIDA, 2000). 
 Ao longo do ciclo celular dos tricomonadídeos, foi observado o alongamento das 
cisternas do Golgi embora o número de cisternas se mantenha constante. Antes da mitose, o 
Golgi atinge um comprimento que pode variar de 4,7 a 6,0 µm e sofre uma fissão, dividindo 
esta organela. A célula passa a ter duas pequenas pilhas de cisternas medindo entre 1,0 a 1,2 
µm. Durante a mitose de tricomonas, o Golgi permanece íntegro e migra junto com a porção 
anterior de cada axótilo, posicionando-se entre os corpúsculos basais e o núcleo. Durante esse 
processo esta organela sofre um novo alongamento atingindo 3,7 µm, no final da telófase. 
Além disso, proteínas, como as adesinas, foram detectadas ao longo da via secretora durante 
todo o ciclo celular (BENCHIMOL et al., 2001). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
21 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. a. Micrografia eletrônica de Tritrichomonas foetus em vista longitudinal. Célula em 
interfase, (P) Pelta, (Ax) axóstilo, (FA) flagelos anteriores, (H) hidrogessomos, (G) complexo de 
Golgi, Filamento Parabasal (seta), (Gl) glicogênio e (N) núcleo. Barra, 500nm. b. Proximidade do 
complexo de Golgi com retículo endoplasmático (RE), núcleo (N) e filamento parabasal (FP). Barra, 
2µm. 
 
 
 
22 
 
1.2 JUSTIFICATIVAS 
 
 O complexo de Golgi em Tritrichomonas foetus se destaca por ser bastante 
desenvolvido, o que indica que deva exercer funções importantespara o parasito e na 
parasitemia. Contudo, o assunto ainda é pouco estudado. Por isso, existe a necessidade de se 
realizar estudos que ajudem a elucidar a funcionalidade, as proteínas aí presentes, e 
comportamento desta organela e de seus componentes durante o ciclo de vida deste parasito. 
 
1.2.1 Objetivo Geral 
• Identificar pelo menos uma proteína do complexo de Golgi de T. foetus que possa servir 
como proteína marcadora e assim, ser rastreada. 
 
1.2.2 Objetivos Específicos 
 
• Isolar o Complexo de Golgi de T. foetus 
• Produzir anticorpos monoclonais contra proteínas do C. Golgi de T. foetus 
• Rastrear por imunocitoquímica e imunofluorescência a sensibilidade e especificidade dos 
anticorpos monoclonais gerados 
• Identificar proteínas reconhecidas pelos anticorpos 
• Identificar proteínas específicas de Golgi em Tricomonadídeos 
• Verificar se as proteínas reconhecidas pelos anticorpos são conservadas, e, portanto, são 
reconhecidas em outros organismos. 
 
 
23 
 
 
2. MATERIAL E MÉTODOS 
2.1 Cultivo in vitro 
Os protozoários da cepa K de Tritrichomonas foetus, utilizada neste trabalho, foi 
isolada pelo Dr. Hélio Guida (Embrapa, Rio de Janeiro, Brasil) da cavidade prepucial de um 
touro do estado do Rio de Janeiro, Brasil. A cepa JT de Trichomonas vaginalis foi isolada de 
uma paciente atendida no Hospital Universitário Federal do Rio de Janeiro, Brasil. 
Os trofozoítos foram cultivados axenicamente em meio de cultura TYM modificado 
(Diamond, 1957), acrescido de 10% de soro fetal bovino inativado. As culturas foram 
mantidas a 37ºC por 24 horas. Para o fracionamento subcelular foram cultivados 2 litros de T. 
foetus, na densidade de 107 células/ml. 
O meio TYM utilizado é composto por 22mg/ml de triptona, 11 mg/ml de extrato de 
levedura, 5,6 mg/ml de maltose, 1mg/ml de L-cisteína, 0,2 mg/ml de ácido ascóbico, 0,9 
mg/ml de fosfato de potássio monobásico e 0,9 mg/ml de fosfato de potássio dibásico. O pH é 
ajustado para 6,2 com HCl 0,1M e o meio é posteriormente esterilizado por autoclação por 20 
min. 
As células epiteliais de rim de cachorro MDCKII foram doadas pelo Dr. José Andrés 
Morgado Diaz (Departamento de Biologia Celular – INCA) e cultivadas em meio DMEM 
(Sigma, USA) suplementado com 10% de soro fetal bovino. As culturas foram mantidas em 
condições de 37ºC em uma atmosfera de 5% de CO2. 
 
2.2 Fracionamento Subcelular 
O isolamento do complexo de Golgi de T. foetus foi realizado de acordo com o 
protocolo descrito por Díaz e De Souza (1998) (FIG. 5). Para isso foram cultivados dois litros 
24 
 
do parasito e todo o procedimento foi realizado a 4ºC. Os trofozoítos de T. foetus foram 
centrifugados à 1.000x g por 10 minutos (ultracentrífuga Sorvall RCB com rotor GSA). As 
células foram lavadas três vezes com tampão G (10mM tampão Tris-HCl, pH 7,4, contendo 
0,25M sacarose e 2mM MgCl2) utilizando a mesma velocidade. As células foram ressuspensas 
em solução hipotônica (tampão G sem sacarose) e, em seguida, foram rompidas 
mecanicamente em homogenizador Potter. O monitoramento da ruptura das células foi 
realizado com a observação do material ao microscópio de contraste de fase. O 
homogeneizado foi centrifugado à 2.500x g por 10 minutos e o pellet contendo células não 
rompidas, núcleo e hidrogenossomos foram descartados. O sobrenadante pós-nuclear (PNS) 
resultante foi misturado em proporção de 1:1 a uma solução concentrada de sacarose a 2,3M 
em tampão G. Essa suspensão foi colocada no fundo dos tubos da ultracentrífuga (Beckman 
SW28). Soluções com concentrações decrescentes de sacarose foram adicionadas 
sucessivamente ao tubo (1,2M, 1,0M e 0,8M em tampão Tris-HCl 10mM, pH 7,4). O 
gradiente foi centrifugado a 95.000x g por 1 hora e 30 minutos na ultracentrífuga L8M usando 
o rotor Beckman SW28 (Palo Alto, CA, USA). O pellet e as bandas formadas foram 
cuidadosamente coletados com pipetas Pasteur e diluídos 10 vezes em tampão G sem 
sacarose. O pellet, rico em complexos de Golgi, resultante da centrifugação a 80.000x g por 
45 minutos, utilizando o rotor Beckman SW28, foi coletado para análise. 
 
25 
 
 
Figura 5. Esquema do fracionamento subcelular, mostrando as etapas para a obtenção das frações 
do complexo de Golgi de Tritrichomonas foetus. Sobrenadante pós-nuclear (PNS). 
 
2.3 Produção de anticorpos monoclonais 
Uma vez isolada a organela, a mesma foi observada por MET para verificação de sua 
pureza. Em seguida, foi liofilizada para envio à FK Biotec, Rio Grande do Sul, Brasil, para 
produção de anticorpos monoclonais. O processo seguiu as seguintes etapas: imunização, 
fusão (FIG. 6e), seleção dos hibridomas positivos (triagem), clonagem, reclonagem e 
criopreservação, produção em larga escala dos anticorpos e purificação. 
Na etapa de imunização, a primeira inoculação foi feita com 100µg/cdg do isolado do 
complexo de Golgi diluído em 0,5 ml de adjuvante completo de Freund, na cavidade 
peritonial de quatro camundongos BALB/c. As demais inoculações seguiram dias e diluições 
de acordo com a tabela I, respeitando um interregno de 30 dias. 
 
 
26 
 
Tabela 1. Dia, concentração e forma de diluição dos inóculos durante a etapa de imunização. 
 
Uma nova inoculação endovenosa foi feita 72 horas antes da fusão com 50µg/cdg do 
antígeno. Para a etapa de fusão o baço do camundongo imunizado foi retirado (FIGs. 6b-c). 
Em seguida, o baço foi colocado em uma placa de Petri contendo meio DMEM (Cultilab, 
Campinas, Brasil) e o órgão foi perfurado com o auxílio de agulhas de seringas de 1ml para a 
obtenção das células (FIG. 6d). O meio contendo as células do baço (2 x107células/ml) foi 
transferido para um tubo de 50ml. Estas células foram lavadas 1x com meio DMEM. 
Paralelamente, as células de mieloma SP2/O (1 x 107células/ml) cultivadas em meio DMEM 
suplementado com 20% de soro fetal bovino foram centrifugadas a 2.000x g. A obtenção de 
células híbridas foi feita através da fusão das células de mieloma SP2/O com as células do 
baço do animal imunizado na proporção de 1:2. Para isso foi utilizado uma solução de 
polietilenoglicol (PEG) 41% (Sigma, USA) e dimetilsulfóxido (DMSO) 15% em DMEM a 
46ºC, aplicado gota a gota por 1 minuto (FIG. 6e) (KÖHLER & MILSTEIN, 1975). 
Para a seleção das células híbridas, após a fusão as células foram lavadas 1 x em meio 
DMEM e ressuspensas em meio HAT (Hipoxantina, Aminopterina e Timidina) (FIG. 6f), 
onde foram mantidas durante 7 dias a 37ºC. Esse meio favorece o crescimento das células 
Dia Antígeno Veículo 
0 100µg/cdg Adjuvante completo de 
Freund 
7 100µg/cdg Adjuvante incompleto de 
Freund 
14 50µg/cdg PBS 
21 50µg/cdg PBS 
30 50µg/cdg PBS 
27 
 
híbridas, devido à ação da aminopterina, uma droga que age inibindo a síntese de DNA, pois 
impede a produção de guanosina trifosfato (GTP) e timidina trifosfato (TTP). A produção de 
TTP pode ser realizada através da adição de timidina no meio. Por outro lado, a síntese de 
GTP só ocorre a partir da hipoxantina metabolizada pelos linfócitos B, através da atividade da 
enzima hypoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT). Apesar dos linfócitos 
conseguirem sintetizar o DNA, estes morrem no período de 7 a 10 dias de cultura. Os 
mielomas que não possuem esta enzima não conseguem produzir uma nova fita de DNA e não 
sobrevivem. Desta forma, somente as células híbridas sobrevivem por herdarem a enzima 
hypoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT) dos linfócitos e a durabilidade dos 
mielomas. Após o período de seleção das células híbridas, o meio HAT é substituído por meio 
HT (Hipoxantina e Timidina) por mais 3 dias. As culturas seguintes foram realizadas em meio 
DMEM suplementado com20% de soro fetal bovino. 
O teste de triagem foi realizado somente depois que as colônias de hibridomas 
atingiram mais de 50% de crescimento em cada cavidade. Nesta etapa, os sobrenadantes das 
culturas foram testados através do ensaio imunoenzimático direto (ELISA), para determinar 
se as células estavam secretando imunoglobulinas de interesse. Os sobrenadantes que 
apresentaram resultados positivos foram testados por imunofluorescência para verificar a 
localização do reconhecimento do anticorpo e a intensidade desta fluorescência. Os 
hibridomas secretores de anticorpos com especificidade para o complexo de Golgi foram 
selecionados para a etapa de clonagem. 
 A clonagem consiste na realização de diluições seqüenciais de modo a permitir que, 
matematicamente, uma única célula permanecesse em cada cavidade. Assim, os hibridomas 
oriundos tratavam-se de clones de uma única célula e, conseqüentemente, os anticorpos 
secretados reconheciam o mesmo epítopo, sendo, portanto monoclonais. Os melhores clones 
foram selecionados após imunofluorescência e em seguida foram reclonados, repetindo as 
28 
 
diluições feitas para a obtenção dos clones. Posteriormente os mesmos foram expandidos, 
congelados e armazenados. A etapa da produção de anticorpos em larga escala foi realizada in 
vitro, através da coleta do sobrenadante do meio onde os hibridomas foram cultivados. Para a 
etapa de purificação de anticorpos, foi necessária a utilização da técnica de cromatografia de 
bioafinidade. 
 
 
Figura 6. Etapas da produção de anticorpos monoclonais. a. Preparo do camundongo para a 
retirada do baço; b. Retirada do baço do camundongo imunizado; c. Baço do camundongo d. 
Extração das células do baço; e. Fusão de mielomas com células do baço; f. Plaqueamento das 
células híbridas. 
 
 
 
 
 
 
29 
 
2.4 C6-NBD-Ceramida 
 C6NBD-ceramida é um análogo fluorescente da ceramida, biologicamente ativo e 
permeável as membranas (ROSENWALD & PAGANO, 1993). Depois de expostos a célula 
estes lipídeos são acumulados no complexo de Golgi, onde são convertidos em 
glicosilcerebrosídeos e esfingomielinas fluorescentes (LIPSKY & PAGANO,1985). 
 Neste estudo, utilizamos a C6NBD-ceramida (Molecular Probes Co, USA) para 
demonstrar a localização do complexo de Golgi de T. foetus e de células MDCK e verificar se 
os anticorpos monoclonais apresentam marcação na mesma região. Para isso, incubamos os 
trofozoítos com 5µM de C6NBD-ceramida por 5 minutos à 37ºC. Em seguida, as células 
foram centrifugadas a 1.000x g por 5 minutos. O pellet foi fixado com formaldeído 1% em 
tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4, por 1 hora. Depois, os núcleos das células foram corados com 
DAPI (5µg/ml). As amostras foram observadas ao microscópio óptico de fluorescência Zeiss 
Axophot II. 
 
2.5 Imunofluorescência 
Para os testes de imunofluorescência as células foram primeiramente fixadas com 
formaldeído 4% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,2, e aderidas a lamínulas recobertas com poli-
L-lisina 0,1% (Sigma, USA). A permeabilização das células foi feita com 0,1% de Triton X-
100 em PBS/BSA a 1%, por 10 minutos. Em seguida, as células passaram por uma etapa de 
bloqueio com cloreto de amônio (NH4Cl) 50mM por 15min e depois com albumina bovina 
(BSA) 3% por 15 minutos. Posteriormente, as células foram incubadas por 3 horas ou 
overnight com os sobrenadantes dos hibridomas 20, 93, 110 e com o anticorpo primário 
purificado anti-Golgi 20.3 aqui desenvolvidos, diluído 1:10 em PBS/BSA 1%. A revelação 
dos anticorpos foi feita com a incubação da amostra com o anticorpo secundário anti-
camundongo conjugado com AlexaFluor 488, diluído 1:100, por 1 hora. Os núcleos das 
30 
 
células foram corados com DAPI (5µg/ml). As amostras foram observadas ao microscópio 
óptico de fluorescência Zeiss Axophot II. 
Para verificar se as proteínas reconhecidas pelo anticorpo purificado eram 
conservadas, foram feitas imunofluorescências com T. vaginalis, formas epimatigota do 
Trypanosoma cruzi e promastigota de Leishmania amazonensis, além de células MDCKII. Os 
protozoários Trypanosoma cruzi e Leishmania amazonensis foram doados fixados com 4% de 
formaldeído em tampão fosfato 0,1M, pH 7,2 pela Dra. Narcisa Leal da Cunha-e-Silva 
(UFRJ, Rio de Janeiro, Brasil). 
O controle foi realizado incubando as células somente com o anticorpo secundário. 
 
2.6 Microscopia Eletrônica de Transmissão 
 2.6.1 Resinas hidrofílicas - Unicryl e LR-White 
As células foram fixadas em uma mistura de 4% de formaldeído e 0,1% de glutaraldeído 
grau I em tampão cacodilato de sódio a 0,1M, pH 7,2, overnight. As amostras foram lavadas 
3x em PBS, pH 7,2 e 3x em H2O destilada. Para a obtenção de um melhor contraste do 
material, foi feita a coloração em bloco em uma solução de acetato de uranila a 5% em água 
destilada por 2 horas, protegido da luz. Após esse período, o material foi lavado em água 
destilada e centrifugado a 1.500x g por 5 minutos com o objetivo de se obter um pellet 
compacto. A amostra foi transferida para uma placa de Petri com etanol 70% e cortado em 
pequenos fragmentos. A desidratação do material foi feita em concentrações crescentes de 
etanol 70%, 90%, 100%, super-seco, por 15 minutos em cada etapa. A infiltração foi realizada 
com concentrações crescentes de resina LR-White diluída em etanol super-seco, nas 
proporções de 1:2, 1:1, 2:1 e puro, depois o material foi polimerizado em resina pura à -18ºC 
sob luz UV. 
31 
 
Para imunocitoquímica de materiais polimerizados em resina LR-White, foram obtidos 
cortes ultrafinos de 70nm de espessura que foram coletados em grades de níquel de 300 mesh. 
As etapas de bloqueio foram realizadas com cloreto de amônio 50mM, pH 8,0, por 40 
minutos, PBS/BSA 1%, PBS/BSA3% e Tween 0,2%, por 10 minutos em cada solução. As 
células foram incubadas com os sobrenadantes dos hibridomas 20, 93, 110 e com o anticorpo 
purificado anti-Golgi 20.3 diluído 1:10 em PBS/PBS 1%, overnight. O material foi lavado 
com PBS/BSA 3%, 1%, 3% e incubado com o anticorpo secundário anti-camundongo IgG 
conjugado com partículas de ouro coloidal de 10nm, diluído 1:100 em PBS/BSA 1%, por 50 
minutos. O controle foi feito com a amostra que teve a etapa de incubação com o anticorpo 
primário ocultada. Em seguida, o material foi novamente lavado em soluções de PBS/BSA 
3%, 1%, PBS puro e H2O destilada. O material foi contrastado com acetato de uranila 5% e 
citrato de chumbo e, posteriormente, observado ao microscópio eletrônico de transmissão 
JEOL 1210. 
 
2.6.2 Resina Hidrofóbica – EPON 
Os trofozoítos de T. foetus K foram coletados por centrifugação e fixados em 
glutaraldeído a 2,5% em tampão Cacodilato de sódio 0,1M, pH 7,2, por 2 horas ou overnight à 
temperatura ambiente. Depois desse período, as células foram lavadas por três vezes em PBS, 
pH 7,2 e pós-fixadas em solução de tetróxido de ósmio a 1% e tampão Cacodilato de sódio 
contendo ferricianeto de potássio a 0,8% acrescido de CaCl2 5mM. Posteriormente, as células 
foram desidratadas utilizando concentrações crescentes de acetona 70%, 90%, 100% por 15 
minutos em cada concentração. O material foi, então, infiltrado em solução de resina Epoxy 
Poly Bed 812 (Epon): acetona, nas proporções de 1:2, 1:1, 2:1 e Epon puro, por 3h ou 
overnight em cada mistura. Finalmente, foi feita a polimerização do material na estufa a 60ºC 
por 72 horas. 
32 
 
Depois dos blocos polimerizados, foram realizados cortes ultrafinos de 70 a 100nm, 
utilizando o ultramicrótomo Leica Ultracut UCT. Os cortes foram coletados em grades de 
cobre de 300 mesh ou em grades de níquel de 300 mesh quando o objetivo era fazer 
imunocitoquímica. As amostras coletadas em grades de cobre foram contrastadas em acetatode uranila 5% por 30 minutos e em citrato de chumbo por 10 minutos. 
Para as imunocitoquímicas realizadas em materiais incluídos em resina epon foram feitas 
algumas modificações no protocolo acima descrito. Cortes ultrafinos foram obtidos com 
100nm de espessura e coletados em grades de níquel de 300 mesh. Foi necessário realizar uma 
etapa de etching consistindo em uma retirada parcial da resina epon e uma “desosmificação” 
com H2O2 1% por 10 minutos, antes da etapa de bloqueio (revisto por SKEPPER, 2000). O 
material foi lavado exaustivamente em H2O destilada, seguida da etapa de bloqueio, como já 
descrita anteriormente. Os tempos de incubação com os anticorpos primário e secundário 
foram de 48 h e 2 h, respectivamente. 
 
2.7 Técnicas Proteômicas (SOLOVIEV & FINCH, 2005) 
 Neste trabalho, utilizamos uma estratégia para identificação das proteínas do Golgi de 
T. foetus, que foi feita através da seleção da proteína usando a técnica de imunoprecipitação 
(IP). Para isso, utilizou-se o anticorpo específico para uma das proteínas do Golgi e proteína-
A conjugada à resina Sepharose. Em seguida, as proteínas capturadas foram separadas por 
peso molecular através de um gel de poliacrilamida 12% SDS-PAGE. As bandas 
correspondentes às proteínas do complexo de Golgi imunoprecipitadas foram extraídas e 
tratadas com Ditiotreitol (DTT - agente redutor de pontes dissulfeto), iodoacetamida (IAA - 
responsável pela alquilação das cisteínas) e digeridas pela ação da tripsina que cliva para a 
conversão das proteínas em peptídeos. Posteriormente, as amostras foram analisadas pelo 
espectrômetro de massa do tipo MALDI-TOF/TOF (FIG. 7). 
33 
 
 
 
Figura. 7. Estratégia para identificação das proteínas do complexo de Golgi. As proteínas do Golgi 
foram imunoprecipitadas(IP) e avaliadas por SDS-PAGE. As bandas correspondentes às proteínas do 
Golgi foram extraídas e digeridas com tripsina para obtenção de peptídeos, que foram analisados por 
MALDI-TOF/TOF. As informações obtidas a partir dos espectros de massas foram comparadas com 
seqüências depositadas em bancos de dados do MASCOT®. 
 
 2.8 Dosagens de Proteínas - Método Lowry-Peterson (PETERSON, 1983) 
 Para os experimentos bioquímicos, as frações isoladas do Golgi de T. foetus foram 
tratadas com tampão de lise (20mM de Tris-HCl, 2mM de EDTA, 0,1% de SDS, 0,5% de 
deoxicolato, 1% de Triton X-100, 137mM NaCl, 10% de glicerol, pH 7,2) e coquetel de 
inubidores de protease 1x (Sigma, USA). Porém, alguns destes componentes são considerados 
interferentes para a dosagem de proteína pelo método de Lowry, devido a isso, foi necessário 
fazer, primeiramente, uma precipitação das proteínas. 
 Em eppendorfs de 1,5ml foram aplicados o 10µl do tampão de lise (branco), 10, 20, 
30, 40 e 50µl de solução de albumina 1mg/ml (padrão) e 20µl da amostra. Em seguida, foram 
adicionados 50µl da solução de deoxicolato 1,5%. A mistura foi mantida por 10 minutos à 
temperatura ambiente. Após esse período, foram adicionados 50µl de ácido tricloroacético 
72% (TCA) que ficou reagindo por 10 minutos à temperatura ambiente. As amostras foram 
centrifugadas a 4.000x g por 25 minutos. O sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspenso 
em 400µl no reagente de formação do complexo (250µl de CuSO4 0,4%, 250µl de Tartarato 
de potássio 0,8%, 500 µl de Na2CO3 20%, 1ml de SDS 10%, 1ml de NaOH 0,8M e 5ml de 
água destilada) por 10 minutos. Em seguida, as amostras foram incubadas com 100µl do 
34 
 
reagente de Folin (1:6) por 60 minutos. A leitura foi feita a 650nm no leitor de ELISA 
TermoMax microplate reader. 
 
2.9 Imunoprecipitação 
Para a reação de imunoprecipitação, a fração total do complexo de Golgi (1mg/ml) foi 
incubada com 20µl de anticorpo 20.3 (1mg/ml), overnight à 4ºC (Pré-ligação). 
Simultaneamente, em outro eppendorf foi feita a reação de pré-lavagem, incubando (1mg/ml) 
com 50µl de proteína A-Sepharose (Sigma, USA) durante o mesmo tempo. Após esse 
período, as amostras foram centrifugadas a 1.000x g por 10 minutos à 4ºC. Em seguida, foi 
feita a incubação do sobrenadante da Pré-ligação e o pellet da pré-lavagem, overnight à 4ºC, 
sob leve agitação. Posteriormente as amostras foram centrifugadas a 1.000x g por 10 min. O 
pellet foi ressuspenso em 90µl de tampão de amostra (300 µl de tampão de amostra Laemmli 
- Bio-Rad Laboratories, USA, 15 µl de β-mercaptoetanol e coquetel de inibidores de protease 
1x concentrado - Sigma, USA), e fervido por 5 minutos para dissociação do complexo 
proteico. A amostra foi centrifugada a 1.000x g por 5 minutos, para separar a Sepharose, e o 
sobrenadante, contendo o anticorpo e o antígeno separados, que foi aplicado no gel de 
Poliacrilamida a 12% como descrito abaixo. 
 
2.10 Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e 
 Eletrotransferência 
A eletroforese foi realizada de acordo com o procedimento descrito por Laemmli (1970). 
O homogeinizado total de T. foetus e as frações do complexo de Golgi foram diluídos em 
tampão de amostra (300 µl de tampão de amostra Laemmli - Bio-Rad Laboratories, USA, 15 
µl de β-mercaptoetanol e coquetel de inibidores de protease 1x concentrado - Sigma, USA) 
35 
 
para uma concentração final de 5 ou 30µg/µl, dependendo da finalidade. Para as proteínas 
imunoprecipitadas, foram aplicados 30µl da preparação descrita acima por poço do gel. 
As proteínas foram separadas de acordo com o peso molecular em géis de Poliacrilamida 
10% ou 12%, seguindo os seguintes parâmetros: 120V e 120 minutos. O peso molecular das 
proteínas das amostras foram comparadas com o padrão kaleidoscope (Bio-Rad Laboratories, 
USA). Algumas das preparações com 30µg/µl foram eletrotransferidas para membrana de 
nitrocelulose ou PVDF utilizando o aparelho de transferência semi-seco a 10V por 60 minutos 
como descrito por Towbin e colaboradores (1979). Após a transferência, as membranas de 
nitrocelulose ou de PVDF foram coradas em uma solução de 0,2% Ponceau red e 3% de 
ácido tricloroacético e em seguida, guardada à 4ºC. 
 
2.11 Revelação do Gel 
 O mapa protéico resultante da eletroforese pode ser visualizado através de métodos de 
coloração de proteínas. As proteínas no gel corado aparecem como bandas reveladas pelo azul 
de Coomassie G-250 ou através da impregnação por prata. 
 
2.11.1 Coomassie G-250 (NEUHOFF et al., 1988) 
Os géis com 30 µg/µl de proteína foram colocados em solução fixadora contendo 
etanol 30%, ácido fosfórico 2% (v/v) em água por 30 minutos. Esse procedimento foi repetido 
três vezes. Em seguida, os géis foram lavados 2x por 20 minutos em ácido fosfórico 2% (v/v) 
em água. Essa solução foi substituída por uma solução de ácido fosfórico 2% (v/v), etanol (ou 
metanol) 18%, sulfato de amônio 15% (p/v) em água durante 30 minutos. A coloração do gel 
foi realizada com adição de 5 ml (1% do volume) de uma solução contendo 20g de azul de 
Comassie G-250 por litro de água. Os géis foram mantidos nesta solução por 72 horas sob 
agitação moderada. O excesso de corante foi removido com lavagens de água deionizada. 
36 
 
 
2.11.2 Impregnação pela Prata 
O gel para visualização do perfil proteico de 5µg/µl de proteínas do homogeinizado 
total de T. foetus e da fração do complexo de Golgi, obtida após isolamento, foi fixado em 
uma solução contendo 50% de metanol, 10% de ácido acético, 10% de Fixative enhancer 
(Bio-Rad Laboratories, USA) e 30% de H2O deionizada. Em seguida, o gel foi lavado duas 
vezes por 10 minutos em H2O deionizada e corado pela prata com a mistura de 10 ml da 
solução A (Bio-Rad Laboratories, USA) (1ml de Silver complex solution, 1ml de Reduction 
moderation solution, 1ml de Image develoment reagent e 7ml de H2O deionizada) e 10ml da 
solução B (5g de Development acelerator