DinorahZilbersztajnGotlieb Mestrado

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DINORAH ZILBERSZTAJN GOTLIEB 
 
Estudo da expressão da miostatina em modelos murinos para 
 doenças neuromusculares 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
São Paulo 
2011 
 
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação Interunidades em Biotecnologia 
USP/Instituto de Biociências, para obtenção do 
Título de Mestre em Biotecnologia. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dinorah Zilbersztajn Gotlieb 
 
ESTUDO DA EXPRESSÃO DA MIOSTATINA EM MODELOS MURINOS PARA 
DOENÇAS NEUROMUSCULARES. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
São Paulo 
2011 
Área de concentração:Genética 
 
Orientadora: Profa. Dra. Mariz Vainzof 
 
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação Interunidades em Biotecnologia 
USP/Instituto de Biociências, para obtenção do 
Título de Mestre em Biotecnologia. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ao meu querido marido e aos 
meus anjos chamados pai e mãe. 
 
 
 
 
AGRADECIMENTOS
AGRADECIMENTOSAGRADECIMENTOS
AGRADECIMENTOS 
 
Agradeço especialmente à orientadora Prof. Dra. Mariz Vainzof pela oportunidade de 
realizar o mestrado em seu laboratório do Centro de Estudos do Genoma Humano na USP, 
me ensinando com seu próprio exemplo o que é ser uma pesquisadora justa, cativante e 
por ter muita paciência comigo. 
A FAPESP e ao CNPq pelo fomento deste estudo. 
Aos meu colegas e amigos do laboratório de proteínas André, Áurea, Danielle Ayub, 
Lydia Yamamoto, Paula Onofre, Poliana , Camila e Vanessa por doarem alguns instantes ou 
horas do seu tempo se dedicando para me ajudarem em varias etapas deste estudo, e por 
contribuir para uma rotina de trabalho harmoniosa. 
Aos recém chegados no laboratório Amanda, Henrique, Letícia, Priscila, Stephanie e 
Thais, que já demonstraram o quanto são capazes e podem crescer muito dentro da 
pesquisa acadêmica. 
Aqueles que passaram, deixando suas marcas na minha vida profissional e pessoal, 
contribuindo para aumentar meu conhecimento em diversas áreas. 
Agradeço aos demais pesquisadores e trabalhadores do Centro de Estudos do 
Genoma Humano por contribuir com a dinâmica, informática, atendimento, limpeza, 
contabilidades e segurança do espaço onde foi realizado o presente estudo. 
A Clarice Gotlieb, que é uma ótima sogra e ajuda em tudo que é possível. 
Agradeço ao meu marido pela ajuda na revisão deste trabalho, pela compreensão e 
apoio nos dias que eu precisava de concentração para finalizar o trabalho e por todos os dias 
que virão e estaremos juntos colhendo os frutos de muita dedicação e carinho. 
Aos meus queridos irmãos Victor (por ajudar efetivamente na dissertação)e Renato 
que contribuíram de forma expressiva na minha personalidade, me ensinando muito sobre a 
vida, fé e perseverança. 
As minhas cunhadas e amigas Denise e Karen que participam da vida familiar com 
muita alegria. 
A minha sobrinha Tamar Victoria, nova integrante da família, que desde tão tenra 
idade já me alegra com sua serena presença despertando muita alegria no meu coração. 
Ao Todo Poderoso que provê todas as minhas necessidades. 
O último porem o agradecimento mais importante: 
Aos meus pais pelo amor infinito, por estarem sempre ao meu lado em todas as 
situações, pela paciência, dedicação integral para a minha formação intelectual e moral, 
através do exemplo de pessoas maravilhosas cuja honestidade, responsabilidade, trabalho, 
esperança, espiritualidade estão sempre presentes, e porque sem eles eu não teria 
alcançado este estágio da vida. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ao acender uma tocha, reúnem-se os que buscam a luz. 
Rebe de Lubavitch. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESUMO 
 
Zilbersztajn-Gotlieb D. Estudo da expressão da miostatina em modelos murinos para 
doenças neuromusculares. [dissertação (Mestrado em Biotecnologia)]. São Paulo: Instituto 
de Biociências da Universidade de São Paulo; 2010. 
 
As afecções neuromusculares humanas constituem um grupo heterogêneo de doenças 
genéticas caracterizadas por degeneração muscular progressiva, levando ao 
desenvolvimento de fraqueza muscular e perda de capacidade motora. Mutações em 
vários genes resultam na deficiência ou perda de função de diversas proteínas musculares 
de importância significativa para o bom funcionamento do músculo. Algumas das doenças 
associadas a alterações nestas proteínas são as distrofias musculares progressivas e as 
miopatias congênitas.Entre os modelos naturais conhecidos para distrofias musculares 
humanas estão: o camundongo Dmdmdx, que apresenta deficiência total da proteína 
distrofina no músculo, modelo da distrofia muscular de Duchenne; o camundongo Lama2dy-
2J/J, que apresenta deficiência da proteína α2-laminina, modelo da DM congênita 1A; o 
camundongo Largemyd, com defeito na via de glicosilação da proteína α-DG, modelo da DM 
congênita tipo 1D; e o camundongo SJL/J, com deficiência da proteína disferlina, modelo 
da distrofia das Cinturas tipo 2B. Todos constituem excelentes modelos para estudos 
histológicos e fisiopatológicos e vêm sendo utilizados para testar terapias. A proteína 
miostatina, é um membro da superfamília de fatores de crescimento TGF-β. Ela age como 
regulador negativo (inibidor) do crescimento muscular. Diversos estudos sugerem a 
inibição da miostatina como parte de tratamentos para recuperação de massa muscular 
degenerada em doenças como as distrofias musculares. Entretanto, ainda não é 
conhecido o real papel da miostatina no quadro distrófico. Portanto, o presente trabalho 
teve como objetivo avaliar a expressão desta proteína nos diversos modelos de 
degeneração muscular através da avaliação de diferentes músculos de camundongos das 
linhagens distróficas Dmdmdx, SJL/J, Largemyd e Lama2dy-2J/J. Para tal, quantificamos o 
mRNA da miostatina e do gene endógeno GAPDH por técnica de PCR em tempo real, e 
comparamos os resultados de expressão com o padrão de degeneração e regeneração de 
cada músculo e linhagem, através da avaliação histopatológica.Observamos que em 
camundongos normais, a miostatina é menos expressa no músculo gastrocnêmio do que 
no diafragma, refletindo um músculo mais sujeito a lesão. Nas quatro linhagens de 
camundongos distróficos, independentemente da mutação ou do grau de degeneração do 
músculo, a miostatina é menos expressa do que em camundongos normais. No músculo 
distrófico, a expressão da miostatina é inibida tanto no músculo gastrocnêmio como no 
diafragma, sem diferença entre os dois. A analise comparativa da degeneração e 
regeneração muscular com a expressão da miostatina mostrou uma maior correlação com 
o padrão de degeneração do que com a regeneração.Nossos resultados sugerem que o 
processo de degeneração, quando iniciado, e independentemente de seugrau, causa 
molecular primária, ou músculo afetado, parece atuar de forma similar na inibição da 
expressão da miostatina, possivelmente como estímulo a regeneração do dano. 
 
Palavras-chave: Distrofias musculares. Camundongos Modelos. Miostatina. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ABSTRACT 
 
Zilbersztajn-Gotlieb D. Myostatin expression in mouse models of neuromuscular 
diseases.[Masters thesis (Human Genetic)]. São Paulo: Instituto de Biociências da 
Universidade de São Paulo;2010. 
 
Human neuromuscular disorders are a heterogeneous group of genetic diseases, caused by 
mutations in genes coding sarcolemmal, sarcomeric, and cytosolic muscle proteins. 
Deficiencies or loss of function of these proteins leads to variable degrees of progressive 
loss of motor ability. Several animal models, displaying phenotypes observed in 
neuromuscular diseases, have been identified. These models generally present physiological 
alterations observed in human patients and can be used as important tools for genetic, clinic, 
and histopathological studies. Among them, the Dmdmdx mouse, which has total deficiency of 
dystrophin in the muscle, is a model for Duchenne muscular dystrophy; Lama2dy2J/J mouse, 
which has a deficiency of protein α2-laminin, is a model of congenital DM 1A; Largemyd 
mouse, defective in α-DG protein glycosylation pathway, is a model of congenital DM type 
1D, and SJL/J mouse, with deficiency of the protein dysferlin, is a model of the limb girdle 
muscular dystrophy type 2B. The protein myostatin, a member of the growth factors TGF-β 
superfamily, is a negative regulator (inhibitor) of muscle growth. Several studies have 
suggested the inhibition of myostatin as a therapeutic strategy for the stimulation of the 
regeneration of the dystrophic muscle. However, the expression and role of myostatin in the 
dystrophic muscle is still not totally elucidated. Therefore, the main objective of this work was 
to evaluate the expression of this protein in two different muscles of four mouse models for 
muscle degeneration, as compared to normal controls. The included dystrophic mice strains 
were: Dmdmdx, SJL / J, Largemyd and Lama2dy2J/J. The relative expression of the myostatin 
mRNA was analyzed in the gastrocnemius and diaphragm muscles by real time PCR, the 
results were correlated with the histopathological findings of each muscle. It was 
observed that in normal mice muscles, myostatin is less expressed in the gastrocnemius 
than in the diaphragm, reflecting a muscle most prone to lesions. In the four strains of 
dystrophic mice myostatin expression is reduced, independently of the primary molecular 
defect or the degree of degeneration of the studied 
muscles, with a similar pattern in both gastrocnemius as diaphragm muscles. The 
comparative analysis of the histopathology of the muscles with the expression of myostatin 
showed a stronger correlation with the pattern of degeneration then regeneration. Our results 
suggest that, when started, the process of degeneration of the muscle, independently of the 
primary molecular defect, or degree, seems to act in a similar pathway leading to the 
inhibition of the expression of myostatin in the affected muscles, possibly as a stimulus to 
regeneration of damage. 
 
Keywords: Muscular dystrophies. Mouse models. Myostatin. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 17 
1.1 O MÚSCULO NORMAL ..................................................................................................... 17 
1.1.2 O tecido muscular no desenvolvimento embrionário .......................................... 17 
1.1.3 O tecido muscular maduro .......................................................................................... 18 
1.1.4 Regeneração muscular ................................................................................................. 22 
1.2 O MÚSCULO DISTRÓFICO .............................................................................................. 23 
1.2.1 Distrofias musculares progressiva ........................................................................... 23 
1.2.2 Modelos animais para distrofias musculares ......................................................... 25 
1.2.2.1 Distrofinopatias ........................................................................................................... 26 
1.2.2.2 Deficiência de alfa 2 laminina .................................................................................. 26 
1.2.2.3 Disferlinopatias ........................................................................................................... 27 
1.2.2.4 Defeitos de glicosilação ............................................................................................ 27 
1.3 MIOSTATINA ....................................................................................................................... 28 
1.3.2 Expressão da Miostatina durante o desenvolvimento ........................................ 29 
1.3.3 Função da miostatina e associação com doenças .............................................. 30 
1.3.4 Inibição da Miostatina como abordagem terapêutica .......................................... 31 
2 OBJETIVOS .......................................................................................................................... 33 
3 MATERIAL E METODOLOGIA ...................................................................................... 34 
3.1 OBTENÇÃO DOS ANIMAIS E MANUTENÇÃO DA COLÔNIA .................................. 34 
3.2 EXTRAÇÃO DE DNA E GENOTIPAGEM....................................................................... 34 
3.3 SELEÇÃO E PREPARAÇÃO DOS MÚSCULOS .......................................................... 36 
3.4 PREPARAÇÃO DE LÂMINAS HISTOLÓGICAS .......................................................... 36 
3.5 HISTOLOGIA ....................................................................................................................... 37 
3.5.1 Coloração de Hematoxilina-Eosina (HE) .................................................................. 37 
3.5.2 Coloração com Picro Sirius® ....................................................................................... 37 
3.6 ESTUDOS MOLECULARES ............................................................................................. 38 
3.6.1 Extração de RNA total ................................................................................................... 38 
3.6.2 Síntese de cDNA total ................................................................................................... 38 
3.6.3 Análise de Expressão da miostatina ......................................................................... 38 
3.6.4 PCR em Tempo Real (Q-PCR)- quantificação relativa da expressão 
 da miostatina ............................................................................................................................ 39 
4 RESULTADOS ..................................................................................................................... 40 
4.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA .............................................................................. 40 
4.2 ANÁLISE DE EXPRESSÃO DA MIOSTATINA ............................................................. 41 
4.2.1 Análise semiquantitiva.................................................................................................. 41 
 
4.2.2 Análise quantitativa da expressão da miostatina por PCR em tempo real 
 (qRT-PCR) ................................................................................................................................. 45 
4.2.2.1 Padronizaçãoda metodologia para os genes em estudo ................................ 45 
4.2.2.2 Análise da Miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio 
do grupo controle ..................................................................................................................... 47 
4.2.2.3 Análise da Miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio 
 dos diferentes grupos de animais distróficos................................................................. 49 
4.2.2.4 Teste com normalizador específico para cada músculo .................................. 50 
 
 
 
 
4.2.2.5 Análise da miostatina por linhagem (diafragma + gastrocnêmio) ................ 52 
4.2.2.6 Análise comparativa da miostatina nos músculos diafragma e 
 gastrocnêmio em cada linhagem distrófica (um só normalizador – C5746D) ........ 52 
4.3 Análise Histopatológica ................................................................................................... 53 
5 DISCUSSÃO ......................................................................................................................... 61 
5.1 A MIOSTATINA COMO ALVO PARA TERAPIAS ........................................................ 61 
5.2 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA .............................................................................. 62 
5.3 ESTUDO DA EXPRESSÃO RELATIVA DA MIOSTATINA ......................................... 64 
5.3.1 Escolha do gene endógeno ......................................................................................... 64 
5.3.2 Análise Semi quantitativa da miostatina .................................................................. 65 
5.3.3 Análise por PCR em tempo real ................................................................................. 65 
5.3.3.1 Análise da Miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio 
do grupo controle ..................................................................................................................... 66 
5.3.3.2 Análise da Miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio 
 dos camundongos afetados ................................................................................................. 67 
5.4 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA ....................................................................................... 69 
5.5 CORRELAÇÃO ENTRE EXPRESSÃO DA MIOSTATINA E PADRÃO 
DE DEGENERAÇÃO E REGENERAÇÃO MUSCULAR .................................................... 70 
6 CONCLUSÕES .................................................................................................................... 72 
REFERÊNCIAS........................................................................................................................ 73 
 
 
 
17 
 
 
 
 
 
 
1111INTRODUÇÃO INTRODUÇÃO INTRODUÇÃO INTRODUÇÃO 
 
1.11.11.11.1O MÚSCULO NORMAO MÚSCULO NORMAO MÚSCULO NORMAO MÚSCULO NORMALLLL 
 
 
 
1.1.2 
1.1.2 1.1.2 
1.1.2 O tecido muscular no desenvolvimento embrionário
O tecido muscular no desenvolvimento embrionárioO tecido muscular no desenvolvimento embrionário
O tecido muscular no desenvolvimento embrionário 
 
 
 
No início do estágio embrionário, na fase de nêurula, na parte paraxial da 
mesoderme forma-se os somitos, dos quais originam os tecidos muscular, ósseo, 
cartilaginoso e dérmico. O destino de cada região dos somitos é especificada por fatores 
secretados pelos tecidos adjacentes e sua localização em relação a eles. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1-A mesoderme de um embrião no estágio de nêurula pode ser dividida em partes que darão origem 
aos diversos compartimentos, órgãos e tecidos do corpo. Em laranja esta destacada a região 
paraxial de onde serão formados grupos de células mesodérmicas chamadas somitos. Duas regiões 
dos somitos sofrem influencia de fatores secretados nas suas proximidades que induzem a formação 
do miótomo e consequentemente das células precursoras musculares. 
FONTE: modificado Gilbert (2000). 
 
A secreção parácrina de fatores específicos induz duas regiões dos somitos a 
sintetizarem fatores de transcrição miogênica bHLH (Basic helix-loop-helix) se 
caracterizando em miótomos assim dando origem aos mioblastos. 
Os mioblastos, células precursoras do músculo,tornam-se alongados, se alinham e 
se fundem para formação de miotubos multinucleados, resultando em células muito longas 
chamadas fibras musculares. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2-No miotoma os mioblastos, células precursoras musculares, proliferam, sintetizam 
miogênicas bHLH, se alinham e se fundem para a formação de miotubos multinucleados.
 FONTE: modificado Gilbert (2000)
 
A determinação dos mioblastos
por diversos fatores de transcrição miogênicos (MYFs) pertencem à família protéica HLH 
(helix-loop-helix), que têm um papel fundamental na miogênese e na regeneração. Dentre 
estes, o MyoD (antígeno de dif
expressão de genes em tempos diferentes durante a miogênese e é essencial no reparo 
de lesões musculares, uma vez que participa da ativação das células satélite (CS) (Hawke 
e Garry, 2001). O MYF5, estrutur
determinação dos mioblastos durante o desenvolvimento embrionário, auxiliando na 
proliferação das CS (Hawke e Garry, 2001). A miogenina (MYF4) é um fator essencial 
para a diferenciação de células totipotentes em
a linhagem miogênica e modulam a diferenciação final das CS; O Pax7 (paired box 
transcription factor 7), expresso em CS quiescentes e em proliferação. A expressão da 
miostatina é detectada nos miótomos, desde o iní
formação do músculo esquelético adulto
número de fibras, seu calibre e tamanho durante a miogênese embrionária, fetal e pós
natal (Kambadur et al., 1997).
 
 
 
1.1.3
1.1.31.1.3
1.1.3O tecido muscula
O tecido musculaO tecido muscula
O tecido muscular maduro
r maduror maduro
r maduro
 
As fibras musculares constituem três tipos de tecidos musculares: estr
esquelético, estriado cardíaco e liso. 
Cada músculo é composto de muitos feixes de fibras musculares. Cada fibra tem 
diâmetro que varia entre 10 e 100μm, é formada por muitas miofibrilas de di
o miotoma os mioblastos, células precursoras musculares, proliferam, sintetizam 
miogênicas bHLH, se alinham e se fundem para a formação de miotubos multinucleados.
Gilbert (2000) 
A determinação dos mioblastos, e sua diferenciação em miotubos são controladas
por diversos fatores de transcrição miogênicos (MYFs) pertencem à família protéica HLH 
helix), que têm um papel fundamental na miogênese e na regeneração. Dentre 
estes, o MyoD (antígeno de diferenciação miogênico – MYF3) atua na regulação da 
expressão de genes em tempos diferentes durante a miogênese e é essencial no reparo 
de lesões musculares, uma vez que participa da ativação das células satélite (CS) (Hawke 
O MYF5, estruturalmente relacionado ao MyoD, também atua na 
determinação dos mioblastos durante o desenvolvimento embrionário, auxiliando na 
proliferação das CS (Hawke e Garry, 2001). A miogenina (MYF4) é um fator essencial 
para a diferenciação de células totipotentes em músculo. A miogenina e MYF6 determinam 
a linhagem miogênica e modulam a diferenciação final das CS; O Pax7 (paired box 
transcription factor 7), expresso em CS quiescentes e em proliferação. A expressão da 
miostatina é detectada nos miótomos, desde o início da miogênese e permanece até a 
formação do músculo esquelético adulto. Acredita-se que este gene deve controlar o 
número de fibras, seu calibre e tamanho durante a miogênese embrionária, fetal e pós
., 1997). 
r maduro
r maduror maduro
r maduro 
As fibras musculares constituem três tipos de tecidos musculares: estr
ado cardíaco e liso. 
Cada músculo é composto de muitos feixes de fibras musculares. Cada fibra tem 
varia entre 10e 100μm, é formada por muitas miofibrilas de di
18 
 
o miotoma os mioblastos, células precursoras musculares, proliferam, sintetizam proteínas 
miogênicas bHLH, se alinham e se fundem para a formação de miotubos multinucleados. 
, e sua diferenciação em miotubos são controladas 
por diversos fatores de transcrição miogênicos (MYFs) pertencem à família protéica HLH 
helix), que têm um papel fundamental na miogênese e na regeneração. Dentre 
MYF3) atua na regulação da 
expressão de genes em tempos diferentes durante a miogênese e é essencial no reparo 
de lesões musculares, uma vez que participa da ativação das células satélite (CS) (Hawke 
almente relacionado ao MyoD, também atua na 
determinação dos mioblastos durante o desenvolvimento embrionário, auxiliando na 
proliferação das CS (Hawke e Garry, 2001). A miogenina (MYF4) é um fator essencial 
músculo. A miogenina e MYF6 determinam 
a linhagem miogênica e modulam a diferenciação final das CS; O Pax7 (paired box 
transcription factor 7), expresso em CS quiescentes e em proliferação. A expressão da 
cio da miogênese e permanece até a 
se que este gene deve controlar o 
número de fibras, seu calibre e tamanho durante a miogênese embrionária, fetal e pós-
As fibras musculares constituem três tipos de tecidos musculares: estriado 
Cada músculo é composto de muitos feixes de fibras musculares. Cada fibra tem 
varia entre 10 e 100μm, é formada por muitas miofibrilas de diâmetro de 1 a 
19 
 
 
 
2μm, que correm longitudinalmente à fibra muscular. Por sua vez as miofibrilas são 
compostas por miofilamentos. É nos miofilamentos que se encontram as estruturas 
contráteis do músculo chamadas sarcômeros. 
 
 
Figura 3-Organização do músculo esquelético. Cada músculo é composto de muitos feixes de fibras 
musculares. Cada fibra muscular é composta por muitas miofibrilas, as quais são compostas por 
miofilamentos. 
 FONTE: modificado Johnson e Raven, 2002. 
 
Os sarcômeros são constituidos principalmente por dois tipos de filamentos: 
filamento espesso, composto pela proteína miosina; filamento fino, formado por 
monômeros de actina, nebulina, tropomiosina e troponina. A organização destas proteínas 
revela sob microscopia eletrônica um padrão de bandas claras e escuras que se repetem 
ao longo dos miofilamentos (Figura 4). 
 
 
 
 
Figura 4-Eletronmicrografia de fibra muscular. A linha Z serve como bordas dos sarcômeros claramente 
visualizados em cada miofibrila. Os filamentos espessos compõem a banda A, os filamentos finos 
fazem parte da banda I e da banda A, sobrepondo os filamentos espessos. Na região central da 
banda A chamada por banda H, não há sobreposição dos filamentos, por isso a aparência mais 
clara. 
FONTE: modificado Johnson e Raven, 2002. 
 
Banda A 
Filamentos finos Filamentos espessos 
20 
 
 
 
As bandas espessas e escuras, denominadas bandas A, são compostas por 
filamentos de miosina combinadas em feixes. A miosina consiste de seis cadeias 
polipeptídicas – duas cadeias pesadas, de 220kD, cuja porção N-terminal, chamada 
cabeça, possui atividade ATPásica, e dois pares de cadeias leves diferentes, chamadas 
cadeias leves essenciais e cadeias leves regulatórias, cujo peso varia de 15 a 22kD, 
dependendo da sua proveniência. 
 
 
Figura 5-Representação de uma molécula de miosina representando 2 cadeias pesadas, parte torcida, e 2 
cabeças parte globular. Parte de um feixe de miosinas na disposição que compõem o fila espesso 
das miofibrilas. 
 FONTE: modificado Johnson e Raven, 2002. 
 
As bandas finas e claras, também chamadas por bandas I, são compostas de dois 
filamentos de actina torcidos em hélice. A actina é uma proteína globular com 375 
aminoácidos. 
 
 
Figura 6-Filamento fino. Duas cadeias de actina torcidas juntas na forma de hélice. 
FONTE: Modificado Johnson e Raven, 2002. 
 
Através de ligações protéicas ocorre a conexão da actina com a membrana 
plasmática. Um modelo proposto descreve um importante papel da proteína distrofina 
nesta ligação. A distrofina estaria organizada em um dímero antiparalelo com o domínio N-
terminal como ponto de ligação com os filamentos de actina, no interior da fibra muscular e 
o domínio C-terminal como sítio de ligação à membrana, através de um complexo de 
Região N-terminal 
denominada cabeça 
Filamento fino 
Moléculas de actina 
Molécula de miosina 
Feixe de miosina 
 
 
 
proteínas e glicoproteínas associadas integrais à membrana (Complexo Distrofina
Glicoproteínas Associadas 
O DGC é um complexo oligomérico, formado pelos sub
β-DG), sarcoglicano (α−, β−, γ− 
distrofina ao complexo DGC é feita através de sua ligação à
DG está associada ao complexo transmembranoso sarcoglicano, 
periférica de membrana
relacionados a este processo sugerem que este mecanismo teria importante função na 
ligação e interação da α-
no bom funcionamento do músculo esquelético (Muntoni e Voit, 2004). Desta forma, o 
DGC promove a ligação entre as proteínas internas da fibra muscular
distrofina), e a matriz extracelular (associação
por três cadeias, sendo uma delas a cadeia 
1995). 
Figura 7- Complexo Distrofina Glicoproteí
da fibra muscular é feita
ligada na sua porção N terminal à actina, e na sua porção C terminal à Be
associando-se às demais 
FONTE: Modificado de 
 
As fibras musculares podem ser divididas com base na velocidade da contração 
exercida: lenta, tipo I , tem rico abastecim
respiratórias aeróbicas, al
fibras vermelhas; e rápida, tipo II, 
proteínas e glicoproteínas associadas integrais à membrana (Complexo Distrofina
Glicoproteínas Associadas - DGC) (Ervasti e Campbell, 1993; Ozawa 
O DGC é um complexo oligomérico, formado pelos sub-complexo
α−, β−, γ− e δ−SG), sintrofinas, e distrobrevinas. A associação da 
distrofina ao complexo DGC é feita através de sua ligação à proteína
DG está associada ao complexo transmembranoso sarcoglicano, e também à proteína 
periférica de membranaα-DG. A proteína α-DG é altamente glicosilada e estudos 
relacionados a este processo sugerem que este mecanismo teria importante função na 
-DG com a laminina na matriz extracelular, e conseq
no bom funcionamento do músculo esquelético (Muntoni e Voit, 2004). Desta forma, o 
DGC promove a ligação entre as proteínas internas da fibra muscular
matriz extracelular (associação α-DG-laminina 2). A laminina
por três cadeias, sendo uma delas a cadeia α2 (Ervasti e Campbell, 1993;
 
Complexo Distrofina Glicoproteínas associadas. Ligação do citoesqueleto com a matriz extracelular 
da fibra muscular é feita por interações protéicas, em que a proteína distrofina tem um papel central, 
ligada na sua porção N terminal à actina, e na sua porção C terminal à Be
s demais proteínas do complexo. 
FONTE: Modificado de Khurana e Davies (2003). 
fibras musculares podem ser divididas com base na velocidade da contração 
exercida: lenta, tipo I , tem rico abastecimento de capilares, muitas mitocô
bicas, alta concentração de mioglobinas e por isso s
e rápida, tipo II, com menor quantidade de capilares, mitocô
21 
proteínas e glicoproteínas associadas integrais à membrana (Complexo Distrofina-
Campbell, 1993; Ozawa et al., 1995). 
complexos distroglicano (α-, 
SG), sintrofinas, e distrobrevinas. A associação da 
proteínaβ-DG. A proteína β-
e também à proteína 
DG é altamente glicosilada e estudos 
relacionados a este processo sugerem que este mecanismo teria importante função na 
na matriz extracelular, e conseqüentemente, 
no bom funcionamento do músculo esquelético (Muntoni e Voit, 2004). Desta forma, o 
DGC promove a ligação entre as proteínas internas da fibra muscular (ligação actina-
laminina 2). A laminina 2 é composta 
2(Ervasti e Campbell, 1993; Ozawa et al., 
nas associadas. Ligação do citoesqueleto com a matriz extracelular 
distrofina tem um papel central, 
ligada na sua porção N terminal à actina, e na sua porção C terminal à Beta Distroglicana 
fibras musculares podem ser divididas com base na velocidade da contração 
ento de capilares, muitas mitocôndrias e enzimas 
por isso são chamadas de 
quantidade de capilares, mitocôndrias e 
 
 
 
mioglobinas, são chamadas de fibras brancas
anaeróbica, pois usam glicogê
O músculo humano també
rápidas mas também tem uma alta capacidade oxidativa, portanto mais resistentes a 
fadiga. 
 
 
 
1.1.
1.1.1.1.
1.1.4
44
4Regeneração muscular
Regeneração muscularRegeneração muscular
Regeneração muscular
 
 
 
A regeneração é comandada pelas células satélite
têm forma alongada e são uninucleadas, e tem papel importante na hipertrofia e no reparo 
de lesões sofridas pela fibra muscular. As CS se localizam na periferia dos miotubos e 
representam cerca de 30% dos núcleos sublaminares dos músc
e Garry, 2001). 
Figura 8- Ativação, diferenciação e proliferação de células satélites na resposta a
fatores liberados pelo exercício ou lesão ativam as células satélites fazendo com que estas deixem o 
estado quiescente. N
aos miócitos “danificados”, contribuem para a regeneração da célula
FONTE: modificado 
 
A quantidade de CS depende da idade, espécie e tipo de fib
glicolítico (rápidas) apresentam quantidade menor de CS, já que estas aparecem em maior 
número quando próximas a capilares, mionúcleos e junções neuromusculares (JNM). Isto 
significa que as fibras oxidativas possuem aproximadamente 5
glicolíticas. 
Geralmente, as CS se encontram quiescentes no músculo adulto, porém explosões 
de atividade muscular após treinamento de resistência ocasionam hipertrofia em 
mioglobinas, são chamadas de fibras brancas e são adaptadas para respiração 
pois usam glicogênio e possuem altas concentrações de enzimas glicol
humano também possui uma forma intermediári
m tem uma alta capacidade oxidativa, portanto mais resistentes a 
Regeneração muscular
Regeneração muscularRegeneração muscular
Regeneração muscular 
 
 
A regeneração é comandada pelas células satélites (CS) do músculo. Estas c
têm forma alongada e são uninucleadas, e tem papel importante na hipertrofia e no reparo 
de lesões sofridas pela fibra muscular. As CS se localizam na periferia dos miotubos e 
representam cerca de 30% dos núcleos sublaminares dos músculos dos membro
Ativação, diferenciação e proliferação de células satélites na resposta a
fatores liberados pelo exercício ou lesão ativam as células satélites fazendo com que estas deixem o 
estado quiescente. Neste estado as células podem proliferar e/ou migrar, nesse caso ao fundir
aos miócitos “danificados”, contribuem para a regeneração da célula. 
FONTE: modificado adaptado de Hawke e Garry(2001). 
A quantidade de CS depende da idade, espécie e tipo de fib
glicolítico (rápidas) apresentam quantidade menor de CS, já que estas aparecem em maior 
número quando próximas a capilares, mionúcleos e junções neuromusculares (JNM). Isto 
significa que as fibras oxidativas possuem aproximadamente 5 vezes mais CS que as 
Geralmente, as CS se encontram quiescentes no músculo adulto, porém explosões 
de atividade muscular após treinamento de resistência ocasionam hipertrofia em 
22 
daptadas para respiração 
altas concentrações de enzimas glicolíticas. 
ria de fibras que são 
m tem uma alta capacidade oxidativa, portanto mais resistentes a 
(CS) do músculo. Estas células 
têm forma alongada e são uninucleadas, e tem papel importante na hipertrofia e no reparo 
de lesões sofridas pela fibra muscular. As CS se localizam na periferia dos miotubos e 
ulos dos membros ( Hawke 
 
Ativação, diferenciação e proliferação de células satélites na resposta ao dano muscular. Vários 
fatores liberados pelo exercício ou lesão ativam as células satélites fazendo com que estas deixem o 
este estado as células podem proliferar e/ou migrar, nesse caso ao fundir-se 
A quantidade de CS depende da idade, espécie e tipo de fibras. As fibras do tipo 
glicolítico (rápidas) apresentam quantidade menor de CS, já que estas aparecem em maior 
número quando próximas a capilares, mionúcleos e junções neuromusculares (JNM). Isto 
vezes mais CS que as 
Geralmente, as CS se encontram quiescentes no músculo adulto, porém explosões 
de atividade muscular após treinamento de resistência ocasionam hipertrofia em 
23 
 
 
 
decorrência da ativação das CS. A lesão muscular causada pelo exercício intenso provoca 
a migração de macrófagos para a região lesada, com conseqüente liberação de citocinas. 
As CS são atraídas por quimiotaxia e se fundem a miofibras já existentes, causando 
aumento da massa muscular (Hawke e Garry, 2001). 
Sugere-se que miostatina no músculo danificado deve agir como um chamariz 
químico de fagócitos e células inflamatórias e deve modular o processo de regeneração 
através de seu efeito nessas células (Kirk et al., 2000; Sharma et al., 2001). 
 
1.2 1.2 1.2 1.2 O MÚSCULO DISTRÓFICOO MÚSCULO DISTRÓFICOO MÚSCULO DISTRÓFICOO MÚSCULO DISTRÓFICO 
 
1
11
1.
..
.2.1 Distrofias musculares progressiva
2.1 Distrofias musculares progressiva2.1 Distrofias musculares progressiva
2.1 Distrofias musculares progressiva 
 
 
 
As afecções neuromusculares humanas constituem um grupo heterogêneo de 
doenças genéticas caracterizadas por degeneração muscular progressiva, levando ao 
desenvolvimento de fraqueza muscular e perda de capacidade motora (Vainzof e Zatz, 
2003). Na última década, foram identificadas mutações em vários genes, resultando na 
deficiência ou perda de função de diversas proteínas musculares de importância 
significativa para o bom funcionamento do músculo. Estudos bioquímicos e 
imunohistológicos têm localizado estas proteínas nos diversos compartimentos da fibra 
muscular. Associadas à membrana sarcolemal, encontra-se a distrofina, as 4 sarcoglicanas 
(α−, β−, γ− e δ-SG), disferlina e caveolina 3; na matriz extracelular, a α2-laminina e 
colágeno VI; nos sarcômeros, a teletonina, miotilina, titina, actina e tropomiosina; no citosol 
muscular, a calpaína 3, FKRP, TRIM32, miotubularina; e nos núcleos, a emerina, lamina 
A/C, proteína SMN. Algumas das doenças associadas a alterações nestas proteínas são 
as distrofias musculares progressivas e as miopatias congênitas. 
Dentre as diferentes miopatias, a Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é a mais 
comum, com uma incidência de 1 em cada 3000 nascimentos do sexo masculino. Os 
sinais clínicos iniciam-se entre 3 e 5 anos de idade (com quedas freqüentes, dificuldades 
para subir escadas, correr e levantar do chão), o confinamento em cadeira de rodas se dá 
até os 12 anos de idade e os afetados raramente sobrevivem após a terceira década (Zatz, 
2001). O gene responsável pela DMD localiza-se no braço curto do cromossomo X (Xp21). 
24 
 
 
 
O produto do gene é uma proteína de 427-kDa, denominada distrofina, que se localiza na 
face interna da membrana das fibras musculares esqueléticas e cardíacas, como visto 
anteriormente. Recentemente foram identificadas mutações em diversos genes que atuam 
na cascata de glicosilação da α-DG resultando em doenças neuromusculares (Martin, 
2003). 
A ausência de distrofina no músculo distrófico resulta na deficiência secundária dos 
componentes do DGC (Ohlendieck et al., 1991; Ervasti e Campbell, 1993). Como 
conseqüência, ocorre a instabilidade desse complexo, e as fibras musculares ficam mais 
suscetíveis ao estresse mecânico causado pela contração muscular, levando ao processo 
de degeneração em pacientescom DMD. Portanto, as proteínas do complexo DGC 
também são de extrema importância para o bom funcionamento do músculo, e assim como 
a deficiência de distrofina leva às distrofias de Duchenne, alterações nas proteínas do 
complexo DGC causam as distrofias musculares tipo Cinturas (DMC). As formas 
autossômicas recessivas mais graves e de início mais precoce são as sarcoglicanopatias, 
causadas por mutações nos genes que codificam as 4 proteínas sarcoglicanas 
(α−, β−, γ− e δ-SG). Dentre as formas de distrofias das Cinturas mais benignas, a 
deficiência da enzima calpaína 3 causa DMC2A, a deficiência da proteína sarcolemal 
disferlina causa a forma DMC2B e a deficiência da proteína sarcomérica teletonina causa 
DMC2G. Além disso, mutações no gene LAMA2 que codifica a cadeia α2 da laminina 
muscular (laminina2) causam uma forma de distrofia muscular congênita muito grave, a 
CMD1A. A α2-laminina é expressa em vários tipos celulares, entre eles células musculares 
esqueléticas e cardíacas, células de Schwann, trofoblastos e células de origem 
mesenquimal (Vilquin et al., 1999). Em 1994, Tomé et al. identificaram a proteína merosina 
ou α2-laminina como a responsável pela patogênese da doença. 
Por outro lado, novas formas de distrofias musculares foram recentemente 
associadas a mutações em genes que codificam enzimas glicosiltransferases, que 
contribuem para a glicosilação da proteína α-DG. Curiosamente, a análise de proteínas em 
biópsias musculares destes pacientes mostra uma hipo-glicosilação da α-DG e redução 
significativa de numerosos ligantes da matriz extracelular (Muntoni et al., 2004). Dentro 
deste grupo de doenças, nota-se a distrofia das cinturas tipo 2I e forma congênita 1C, 
ambas causadas por mutações no gene FKRP que codifica uma possível 
 
 
 
glicosiltransferase. Além disso, uma nova forma de distrofia muscular congênita, a forma 
DMC1D, também foi assoc
glicosilação da proteína 
complexo DGC muscular. Portanto, o estudo da via de glicosilação de proteínas 
musculares se tornou muito importante na compreensão de novos mecanismos 
causadores de doenças neuromusculares humanas.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 9- Complexo distrofina glicoproteínas associadas
FONTE: Byrne et al.(2003
 
 
 
1.
1.1.
1.2.2Modelos animais para distrofias musculares
2.2Modelos animais para distrofias musculares2.2Modelos animais para distrofias musculares
2.2Modelos animais para distrofias musculares
 
Muitos animais apresentam naturalmente fenótipos relacionados com 
características já observadas em doenças hereditári
geneticamente. Estes animais geralmente apresentam alterações fisiológicas que 
aparecem em pacientes humanos. Eles podem servir como ferramentas de estudos 
genéticos, clínicos, histopatológicos e terapêuticos ajudando na 
das doenças e suas manifestações nos indivíduos afetados (Vainzof 
Os modelos murinos são os mais estudados e utilizados para as distrofias 
musculares. Porém, outros animais com diferentes miopatias já foram identificad
como os cães Golden Retriever, Beagle, Rottweiler, modelos para DMD e 
Cocker Spaniel e Chihuahua, modelos para deficiência das proteínas sarcoglicanas 
(Shelton e Engvall, 2005).
 
 
 
 
glicosiltransferase. Além disso, uma nova forma de distrofia muscular congênita, a forma 
DMC1D, também foi associada a mutações no gene LARGE. Este gene está envolvido na 
glicosilação da proteína α-DG, membro essencial na formação e funcionamento do 
complexo DGC muscular. Portanto, o estudo da via de glicosilação de proteínas 
musculares se tornou muito importante na compreensão de novos mecanismos 
causadores de doenças neuromusculares humanas. 
Complexo distrofina glicoproteínas associadas 
2003). 
2.2Modelos animais para distrofias musculares
2.2Modelos animais para distrofias musculares2.2Modelos animais para distrofias musculares
2.2Modelos animais para distrofias musculares 
 
 
Muitos animais apresentam naturalmente fenótipos relacionados com 
características já observadas em doenças hereditárias enquanto outros são modificados 
geneticamente. Estes animais geralmente apresentam alterações fisiológicas que 
aparecem em pacientes humanos. Eles podem servir como ferramentas de estudos 
genéticos, clínicos, histopatológicos e terapêuticos ajudando na compreensão da origem 
das doenças e suas manifestações nos indivíduos afetados (Vainzof et al
Os modelos murinos são os mais estudados e utilizados para as distrofias 
outros animais com diferentes miopatias já foram identificad
como os cães Golden Retriever, Beagle, Rottweiler, modelos para DMD e 
Cocker Spaniel e Chihuahua, modelos para deficiência das proteínas sarcoglicanas 
Shelton e Engvall, 2005). 
25 
glicosiltransferase. Além disso, uma nova forma de distrofia muscular congênita, a forma 
. Este gene está envolvido na 
DG, membro essencial na formação e funcionamento do 
complexo DGC muscular. Portanto, o estudo da via de glicosilação de proteínas 
musculares se tornou muito importante na compreensão de novos mecanismos 
Muitos animais apresentam naturalmente fenótipos relacionados com 
as enquanto outros são modificados 
geneticamente. Estes animais geralmente apresentam alterações fisiológicas que 
aparecem em pacientes humanos. Eles podem servir como ferramentas de estudos 
compreensão da origem 
et al., 2007). 
Os modelos murinos são os mais estudados e utilizados para as distrofias 
outros animais com diferentes miopatias já foram identificados tais 
como os cães Golden Retriever, Beagle, Rottweiler, modelos para DMD e Boston Terrier, 
Cocker Spaniel e Chihuahua, modelos para deficiência das proteínas sarcoglicanas 
26 
 
 
 
1.2.2.1 
1.2.2.1 1.2.2.1 
1.2.2.1 Distrofinopatias
DistrofinopatiasDistrofinopatias
Distrofinopatias 
 
 
 
 
 
O camundongo Dmd
mdx 
é modelo mais usado para DMD (Bulfield et al.,1984). O 
Dmd
mdx
 tem uma mutação de ponto no gene da distrofina no cromossomo X que causa 
uma terminação prematura do polipeptídio (Sicinski et al., 1989), e conseqüentemente 
ausência total da proteína no músculo. Esse fato o torna um bom modelo molecular. No 
entanto, além de apresentar menor degeneração e maior regeneração muscular, o Dmd
mdx
 
não tem fraqueza muscular significativa e por isso não é usado como modelo clínico de 
DMD. O músculo mais afetado, que melhor representa a progressão de fraqueza e 
reproduz as transformações de distrofia muscular humana no Dmd
mdx
 é o diafragma, 
(Stedman et al., 1991) por esta razão ele é amplamente usado em análises histológicas. 
 
 
 
1.2.2.2 
1.2.2.2 1.2.2.2 
1.2.2.2 Deficiência de alfa 2 laminina
Deficiência de alfa 2 lamininaDeficiência de alfa 2 laminina
Deficiência de alfa 2 laminina 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Diversos camundongos modelos com deficiência de alfa 2 lamina foram produzidos. 
Dentre eles, dois modelos, com mutações espontâneas no gene LAMA2 foram 
identificados no Laboratório Jackson: o camundongo dy/dy (dystrophia-muscularis) e seu 
mutante alélico dy
2J
/dy
2J
.No modelo dy
2J
/dy
2J
a distrofia é mais branda que no modelo 
dy/dy. Ambos exibem deficiência parcial de alfa 2 lamina e são modelos para distrofia 
muscular congênita com deficiência de merosina (CMD1A) (Jackson Laboratories). 
Estudos moleculares da expressão do gene Lama2 nos camundongos dy/dy 
revelaram deficiência de seu mRNA nos músculos esquelético e cardíaco e no nervo 
periférico, porem não se sabe ainda qual é a mutação para esse fenótipo (Jackson 
Laboratories). Clinicamente esses camundongos são considerados menores e mais fracos. 
Geralmente são estéreis. Oacometimento muscular começa aproximadamente em 3 ½ 
semanas de vida, em que ocorre paralisia primeiramente nos músculos posteriores, depois 
nos axiais e por último nos anteriores. Eles apresentam defeitos na mielinação de nervos 
periféricos e morte prematura, antes dos 6 meses de idade (Vainzof et al., 2007). 
A mutação que ocorre nos modelos Lama2
dyJ
/J é uma substituição de um G por A, 
o que causa splicing anormal e conseqüentemente expressão de múltiplos mRNA. Um 
mRNA é traduzido num polipeptídio alfa2 com uma deleção no domínio IV (Sumada et al., 
27 
 
 
 
1995). Os efeitos desta mutação são mais brandos que no camundongo dy/dy, porem nos 
dois casos as alterações clínicas e histológicas são similares. Os camundongos Lama2
dyJ
/J 
são maiores e mais ativos que os camundongos dy/dy, têm expectativa de vida normal e 
são férteis. Foi observado que ao levantar o animal pela cauda ele recolhe os membros em 
direção ao tronco (Allamand e Campbell, 2000). 
 
 
 
1.2.2.3
1.2.2.31.2.2.3
1.2.2.3 
 
 Disfer
DisferDisfer
Disferlinopatias
linopatiaslinopatias
linopatias 
 
 
 
O camundongo SJL/J é um modelo natural para diferentes doenças humanas. 
Recentemente identificou-se nele uma deleção de 171pb no gene da disferlina, na região 
que codifica a maioria dos domínios C2. Essa mutação causa a deleção de 57 
aminoácidos, resultando numa molécula 6.5 kD menor que a proteína normal de 
aproximadamente 230 kD (Bittner et al., 1999) e provocando sua instabilidade. O SJL/J 
apresenta uma redução média de 85% nos níveis de disferlina, tornando-o um bom modelo 
para LGMD2B (Vainzof et al.,2003). 
Ele desenvolve uma miopatia espontânea caracterizada por progressão lenta de 
perda muscular (Bittner et al., 1999) e força correspondente a um aumento da patologia do 
músculo incluindo fibras musculares com núcleos centrais, variação de calibre, splitting, 
infiltração inflamatória, necrose e eventual substituição de músculo por tecido gorduroso 
(Vainzof et al.,2003). Este quadro afeta primeiramente os músculos proximais enquanto os 
músculos distais permanecem menos afetados. Cruzamentos subseqüentes de 
SJLxC57BL/10 revelaram que o fenótipo muscular apresentado é herdado como caráter 
autossômico recessivo(Bittner et al., 1999). 
Este camundongo é extremamente suscetível a doenças autoimune, linfoma e 
infecções virais. Geralmente os machos (Jackson Laboratories) têm um comportamento 
agressivo (Hoet al., 2004). 
 
1.2.2.4 
1.2.2.4 1.2.2.4 
1.2.2.4 Defeitos de glicosilação
Defeitos de glicosilaçãoDefeitos de glicosilação
Defeitos de glicosilação 
 
 
 
No camundongo, o gene que codifica uma possível glicosiltransferase é o Large. 
Deleções que retiram os exons 4-6 resultam na alteração da glicosilação da alfa 
28 
 
 
 
distroglicana e são responsáveis pelo fenótipo miodistrófico (Large
myd
), destacando 
comprometimento do músculo esquelético, coração, retina, sistema nervoso periférico e 
sistema nervoso central (Vainzof et al., 2007). 
Os camundongos homozigotos Large
myd
 apresentam distrofia muscular progressiva 
grave e cardiomiopatia branda. Podem ser reconhecidos com 12-15 dias pelo seu tamanho 
reduzido e postura anormal (Browning et al., 2005). Defeitos neuronais aparecem no 
cérebro principalmente no córtex e cerebelo, também presentes no camundongo deficiente 
de fukutina. 
 
1.1.1.1.3 3 3 3 MIOSTATINAMIOSTATINAMIOSTATINAMIOSTATINA 
 
A miostatina, também conhecida como GDF-8, é um membro da superfamília de 
fatores de crescimento TGF-β, que é composta por fatores de crescimento e diferenciação 
do desenvolvimento embrionário e manutenção da homeostase tecidual (McPherron e Lee, 
1997). 
A miostatina é codificada pelo gene MSTN, localizado em 2q32.2 em humanos e 
em camundongo esta em 1 27.8 cM (Szabo et al.,1998). O gene MSTN foi seqüenciado 
por Ferrel et al.(1999), e é constituído por três exons intercalados por dois introns, 
contendo 7,7 kb e um mRNA de 3,1 kb. Vários polimorfismos foram identificados em 
humanos. 
A miostatina é uma proteína com 375 aminoácidos, contendo uma seqüência 
sinalizadora de secreção, um sítio de processamento proteolítico e nove resíduos de 
cisteínas na sua porção C-terminal. Em eletroforese realizada em condições não redutoras, 
pode-se observar duas bandas de massas de 101 kDa e 25 kDa, consistentes com o 
tamanho esperado para as formas diméricas não-processadas e processadas, 
respectivamente (McPherron e Lee, 1997). 
Normalmente a miostatina está em estado inativo, no qual a região madura C-
terminal da molécula fica ligada não covalentemente ao seu pró-peptideo na região N-
terminal. O pró-peptideo tem função inibitória sobre a proteína, pois inibe a sua ligação ao 
receptor (Lee e McPherron, 2001). Esse complexo latente pode ser ativado in vitro pela 
29 
 
 
 
clivagem do pró-peptideo com membros da família das metaloproteinases BMP-1/TLD 
(bone morphogeneticprotein-1/tolloid)(Wolfman et al., 2003). 
Após a ativação de seu estado latente, o dímero C-terminal da miostatina é capaz 
de ligar aos receptores e ativar uma cascata de transdução de sinal na célula-alvo. 
Estudos com miostatina recombinante purificada demonstraram que ela é capaz de se ligar 
aos receptores activina tipo II(receptores transmembrana serina/treonina quinase): ActRIIA 
e ActRIIB in vitro (Lee e McPherron 2001; Rebbapragada et al., 2003). A ligação ao ActRII 
leva a fosforilação e ativação do receptor Activina tipo I, que por sua vez inicia uma 
cascata de sinalização pela fosforilação das proteínas Smad2 e Smad3. Após a 
fosforilação as Smads formam heterodimeros com a CoSmad4. Esses complexos de 
Smads ativados são translocados do citoplasma para o núcleo onde eles regulam a 
transcrição de genes alvos(Langley et al., 2002) (Shi e Massague, 2003). 
A localização celular da miostatina parece depender do estado anatomo-patológico 
do músculo e do estágio de diferenciação muscular. Acredita-se também que a miostatina 
deve desempenhar diferentes papéis na dinâmica de desenvolvimento e do processo de 
degeneração/regeneração musculares (Sharma et al., 2001). Wehling et al. (2000) 
encontraram a proteína nas junções miotendinosas em músculo normal e em processo de 
reposição de massa muscular perdida por falta de uso. A miostatina foi encontrada 
também no citoplasma de fibras musculares e nos mionúcleos de músculo denervado, em 
processo de degeneração/regeneração e de ganho de massa muscular (Sakuma e cols., 
2000). Por outro lado, marcação positiva para miostatina foi também encontrada em 
células não musculares, como os macrófagos e fibroblastos no tecido muscular em 
processo de regeneração (Yamanouchi et al., 2000). 
 
1.
1.1.
1.3.2 
3.2 3.2 
3.2 
 
 Expressão da Miostat
Expressão da MiostatExpressão da Miostat
Expressão da Miostatina durante o desenvolvimento
ina durante o desenvolvimentoina durante o desenvolvimento
ina durante o desenvolvimento 
 
 
 
 
 
A análise da expressão de miostatina nos diferentes estágios de desenvolvimento 
embrionário mostrou que nos estágios mais incipientes, sua expressão é restrita aos 
somitos em desenvolvimento. O mRNA da miostatina pode ser detectado desde 9,5 dias 
post-coitum (p.c.), em cerca de um terço dos somitos. Por volta do dia 10,5 p.c. a 
expressão parece estar localizada no miótomo. Em estágios mais avançados de 
30 
 
 
 
desenvolvimento a miostatina é encontrada em uma ampla gama de músculos em 
desenvolvimento (McPherron et al., 1997). 
Em animais adultos, a miostatina continua a ser expressa quase que 
exclusivamente na musculatura esquelética.Entretanto, quantidades residuais de 
miostatina foram detectadas também em tecido adiposo. A expressão no músculo 
esquelético é disseminada, embora, exista variação de expressão em músculos diferentes 
(McPherron et al., 1997). A miostatina é expressa também na musculatura cardíaca 
(Sharma et al., 1999). 
 
 
 
1.
1.1.
1.3.3 Função da miostatina e associação com doenças
3.3 Função da miostatina e associação com doenças3.3 Função da miostatina e associação com doenças
3.3 Função da miostatina e associação com doenças 
 
 
 
 
 
Diversos estudos tentam explicar a interação da miostatina com os tecidos do 
corpo, e sua relação com doenças humanas. 
Recentemente a miostatina foi relacionada com doenças como obesidade e 
diabetes. Administrando uma dieta rica em gordura para camundongos selvagens e 
transgênicos para a miostatina, et al.(2005) constataram que nesta dieta o camundongo 
selvagem apresentou resistência a insulina. Em seu sangue havia maior concentração de 
glicose, enquanto o animal transgênico, com inibição da miostatina, conseguiu manter os 
mesmos níveis de glicose que os camundongos transgênicos e selvagens alimentados 
com uma dieta balanceada de nutrientes. Em outro estudo Hitell et al.(2009) observaram 
um aumento da secreção de miostatina em miotubos em cultura de mulheres obesas. 
Resultados encontrados por Feldman et al.(2006) revelaram que a miostatina, a 
semelhança com a dexametasona, também tem a capacidade de induzir a adipogenese de 
uma linhagem de células pluripotentes. Entretanto, os adipócitos formados são menores, 
expressam marcadores de adipócitos imaturos e teriam a sensibilidade a insulina 
aumentada. 
Um estudo realizado por Roth et al.(2003) verificou que a expressão da miostatina 
estava reduzida em 37% em indivíduos sedentários que participaram de um programa de 
treinamento físico intenso, concluindo que a miostatina responde à carga muscular em 
alguns casos, e, portanto é um regulador do tamanho celular. A expressão da miostatina 
31 
 
 
 
parece, portanto, depender do tipo de contração muscular realizada, bem como a 
freqüência, intensidade e duração dos estímulos (Sakuma et al., 2000). 
Aumento da quantidade de miostatina foi observado em humanos em conseqüência 
da inatividade (Zimmers et al., 2002) e em casos de perda de massa muscular, como 
verificado em homens portadores de HIV (Gonzales-Cadavid et al., 1998). 
Durante o processo de regeneração muscular é observado uma elevação na 
replicação de células satélites. A expressão de miostatina em fibras em processo de 
regeneração é diferente entre fibras que sobreviveram ao processo de degeneração e 
fibras danificadas em regeneração. Nas primeiras a expressão é alta o que deve inibir a 
multiplicação de mioblastos, nas outras a expressão é baixa, ou seja, a multiplicação de 
mioblastos não é inibida (Kirk et al., 2000; Sharma et al., 2001). 
Estudos em cultura de mioblastos demonstraram que a miostatina atua bloqueando 
as fases G1 e G2 do ciclo celular, regulando proteínas importantes ao ciclo como Cdk2, 
p21 e Rb sem afetar o mecanismo de apoptose dos mioblastos. Em resposta à sinalização 
da miostatina, a proteína p21 é hiper-regulada inibindo a atividade ciclina E/Cdk2 causando 
a hipofosforilação da proteína Rb e parando o ciclo celular na fase G1 (Thomas et al., 
2000). 
 
1.
1.1.
1.3.4
3.43.4
3.4 
 
 Inibição da Miostatina como abordagem terapêu
Inibição da Miostatina como abordagem terapêuInibição da Miostatina como abordagem terapêu
Inibição da Miostatina como abordagem terapêutica
ticatica
tica 
 
 
 
Muitos estudos enfatizam a inibição da miostatina porque o tratamento de doenças 
musculares pela maioria das abordagens farmacológicas tem sido decepcionante (Rodino-
Klapac, 2009). Por causa do importante papel da miostatina no desenvolvimento e 
regeneração do músculo, terapias com bloqueio de miostatina estão sendo testadas em 
modelos animais de distrofias musculares (Bogdanovich et al., 2002). Outros ainda focam 
no objetivo de produzir animais com maior massa muscular, o que seria vantajoso para a 
pecuária. 
Lee et al.(2005) descreveram um potente inibidor da miostatina (ACVR2B) que 
quando injetado em camundongos selvagens resulta em aumento de massa muscular. Em 
seu estudo demonstraram que o efeito do ACVR2B é atenuado em indivíduos nulos para a 
32 
 
 
 
miostatina, sugerindo que existe pelos menos uma outra substância que normalmente 
funciona limitando o crescimento da musculatura. 
Em pesquisa realizada por Parsons et al.(2006), comparou-se a inibição da 
miostatina com anticorpos monoclonais em estágios iniciais de desenvolvimento com 
estágios tardios em animais nulos para delta sarcoglicana. Eles observaram aumento de 
massa muscular, regeneração e redução de fibrose em estágios iniciais e sugeriram que a 
inibição pode ser benéfica em período inicial de vida ou quando a doença é branda. 
Heineke et al.(2010) após induzirem danos cardíacos em camundongos, 
detectaram aumento das concentrações plasmáticas de miostatina e conseqüente 
diminuição da massa muscular esquelética. Com estes dados os autores apontam a 
miostatina liberada na circulação sistêmica por cardiomiócitos como causadora da 
caquexia que ocorre em pacientes que sofrem de falhas cardíacas. 
Em experimentos realizados com camundongos deficientes para alfa-laminina2 e 
nulos para a miostatina, Li et al.(2005) observaram maiores taxas de morte pós-natal, o 
aumento de musculatura e regeneração muscular concomitantemente ao aumento da 
formação de gordura, demonstrando que a ausência desta proteína não reduziu a 
patologia muscular dos indivíduos afetados. 
Haidet et al.(2008) testaram a injeção intramuscular pós-natal de vírus adeno-
associado (AAV) codificando proteínas que inibem a miostatina. Em camundongos 
selvagens ocorreu o aumento da musculatura e da força. Interessante que em Dmd
mdx
 o 
tratamento reverteu a patologia muscular e melhorou a força, mesmo quando administrada 
para animais de 6 meses. 
Ainda que ocorra o aumento da musculatura na ausência de miostatina, a força 
muscular é menor em camundongos deficientes de miostatina que em camundongos 
selvagens (Amthor et al., 2007). 
Visto que o papel da miostatina no processo distrófico não está bem estabelecido, 
este trabalho se faz de extrema importância na tentativa de explicar uma possível relação 
desta proteína com o processo distrófico. 
 
33 
 
 
 
2 2 2 2 OBJETIVOBJETIVOBJETIVOBJETIVOS OS OS OS 
 
Avaliar e comparar a expressão da miostatina em quatro modelos murinos para 
distrofias musculares com diversos padrões de fraqueza muscular: Dmd
mdx
, SJL, Large
myd
, 
Lama2
dyJ
/J. 
Objetivos Específicos: 
• Avaliar e comparar a expressão do mRNA da miostatina, por PCR em tempo real 
no músculo gastrocnêmio e diafragma dos animais das diferentes linhagens. 
• Comparar a expressão da miostatina com as alterações histopatológicas dos 
músculos estudados e correlacionar com o grau de fraqueza muscular 
característico de cada linhagem. 
 
 
 
 
 
 
 
 
34 
 
 
 
3 3 3 3 MATERIAL E METODOLOGIAMATERIAL E METODOLOGIAMATERIAL E METODOLOGIAMATERIAL E METODOLOGIA 
 
3.1 OBTENÇÃO DOS ANIMAIS E MANUTENÇÃO DA COLÔNIA.
3.1 OBTENÇÃO DOS ANIMAIS E MANUTENÇÃO DA COLÔNIA.3.1 OBTENÇÃO DOS ANIMAIS E MANUTENÇÃO DA COLÔNIA.
3.1 OBTENÇÃO DOS ANIMAIS E MANUTENÇÃO DA COLÔNIA. 
 
 
 
Os animais deste projeto são mantidos no biotério do Centro de Estudos do 
Genoma Humano, o qual está devidamente equipado para abrigar estes animais, em 
temperaturaconstante e boas condições de higiene e saúde. Os animais recebem 
alimentação e água ad libidum . 
Foram utilizadas as linhagens de camundongos Dmd
mdx
 (Bulfieldet al., 1984), 
B6.WK-Lama2
dyJ
/J (Meier e Southard, 1970), SJL/J (Welleret al., 1997), Large
myd
 
(Grewal e Hewitt, 2002), e C57Black6 (camundongo normal). 
Os camundongos Lama2
dyJ
/J (000524), SJL/J (000686) e Large
myd
/J (000226) 
foram importados do laboratório Jackson (www.jaxmice.org). 
 
3.2 EXTRAÇÃO DE DNA E GENOTIPA
3.2 EXTRAÇÃO DE DNA E GENOTIPA3.2 EXTRAÇÃO DE DNA E GENOTIPA
3.2 EXTRAÇÃO DE DNA E GENOTIPAGEM
GEMGEM
GEM 
 
 
 
Duas linhagens são genotipadas em nosso laboratório: modelo Large
myd
 e o modelo 
Lama2
dyJ
/J. Para estas genotipagens os animais foram identificados previamente com 
furos na orelha, fragmentos de cauda foram colocados em tubos identificados com solução 
de extração e Proteinase K e incubados a 55ºC over night. Após incubação o DNA foi 
precipitado com isopropanol e ressuspendido com TE. 
 Para o modelo Large
myd
, utilizou-se uma reação de PCR multiplex que amplifica o 
alelo mutado e o alelo normal simultaneamente. Se o indivíduo for homozigoto para a 
mutação, a reação amplifica apenas o alelo mutado (421 pb). Se ele for normal, apenas o 
alelo normal (162 pb). Se for heterozigoto, os dois alelos são amplificados. Os 
oligonucleotideos usados (Browning, 2005) nesta etapa estão no quadro 1. O resultado 
desta reação pode ser observado na eletroforese das amostras em gel de agarose 2%. 
 
 
 
 
 
 
 
Quadro 1-Oligonucleotídeos utilizados pra genotipagem do modelo 
Mouse wild type forward (MWTF)
Mouse wild type reverse (MWTR)
Mutation forward (MUTF)
Mutation reverse (MUTR)
 
 
Figura 10- Genotipagem dos camundongos 
agarose 2% corado com brometo de etideo.
 
Para o modelo Lama2
fragmento de 170pb contendo a mutação. Após o PCR é feito uma reação de digestão com 
a enzima NDE1, pois esta mutação cria um sítio de restrição que é poss
esta enzima. Após a elet
banda referente ao alelo normal. Se o indiví
duas bandas referentes a digestão do alelo mutado. Se for heterozigoto,os dois alelos são 
amplificados e o mutado é digerido, portanto aparecem 
reação pode ser observado na eletroforese das amostras em gel de acrilamida. 
 
Figura11- Genotipagem de Lama2
camundongo normal; 2
 
421pb 
162pb 
ligonucleotídeos utilizados pra genotipagem do modelo Large
Mouse wild type forward (MWTF) GGC CGT GTT CCA TAA GTT CAA
Mouse wild type reverse (MWTR) GGC ATA CGC CTC TGT GAA AAC
Mutation forward (MUTF) ATC TCA GTC CCA AAG GGT GAAG
Mutation reverse (MUTR) GCC AAT GTA AAA TGA GGG GAA A
 
Genotipagem dos camundongos Largemyd. Eletroforese dos produtos do PCR multiplex em gel de 
agarose 2% corado com brometo de etideo. 
Lama2
dyJ
/J, utilizou-se uma reação de PCR
fragmento de 170pb contendo a mutação. Após o PCR é feito uma reação de digestão com 
esta mutação cria um sítio de restrição que é poss
eletroforese dos produtos, se o indivíduo for normal aparece uma 
nte ao alelo normal. Se o indivíduo for homozigoto para a mutação, aparecem 
rentes a digestão do alelo mutado. Se for heterozigoto,os dois alelos são 
amplificados e o mutado é digerido, portanto aparecem três bandas. O resultado desta 
reação pode ser observado na eletroforese das amostras em gel de acrilamida. 
 
Lama2dy-2J/J, após digestão. Gel de acrilamida corado com brometo de etídio. 1
camundongo normal; 2- camundongo heterozigoto; 3- camundongo afetado.
377pb 
213pb 
164pb 
35 
Large
myd
. 
A GTT CAA 
GGC ATA CGC CTC TGT GAA AAC 
ATC TCA GTC CCA AAG GGT GAAG 
GCC AAT GTA AAA TGA GGG GAA A 
dutos do PCR multiplex em gel de 
se uma reação de PCR que amplifica um 
fragmento de 170pb contendo a mutação. Após o PCR é feito uma reação de digestão com 
esta mutação cria um sítio de restrição que é possível digerir com 
duo for normal aparece uma 
duo for homozigoto para a mutação, aparecem 
rentes a digestão do alelo mutado. Se for heterozigoto,os dois alelos são 
bandas. O resultado desta 
reação pode ser observado na eletroforese das amostras em gel de acrilamida. 
, após digestão. Gel de acrilamida corado com brometo de etídio. 1- 
camundongo afetado. 
36 
 
 
 
Após a genotipagem, os animais afetados foram separados em nova gaiola para 
envelhecerem até atingirem as idades requisitadas nos experimentos do laboratório. 
Quando necessário são formados novos casais de heterozigotos. Os normais podem ser 
destinados como indivíduo controle em alguns estudos. 
 
Foram utilizados: 
Seis camundongos SJL/J com 3 meses. 
Cinco camundongos Large
myd 
com 3 meses. 
Seis camundongos Lama2
dy-2J
/J com 3 meses. 
Seis camundongos Dmd
mdx
 com 3 meses. 
Seis camundongos normais C57BL 3 meses. 
Os indivíduos selecionados foram eutanaziados em cubas de CO
2
. 
 
3.3 SELEÇÃO E PREPARAÇÃO DO
3.3 SELEÇÃO E PREPARAÇÃO DO3.3 SELEÇÃO E PREPARAÇÃO DO
3.3 SELEÇÃO E PREPARAÇÃO DOS MÚSCULOS
S MÚSCULOSS MÚSCULOS
S MÚSCULOS 
 
 
 
A partir de necropsia foram coletados diafragma e gastrocnêmio de cada animal. 
Os fragmentos musculares foram destinados à histologia e a estudos moleculares. 
 
3.4 PREPARAÇÃO DE LÂMINAS HISTOLÓGICAS
3.4 PREPARAÇÃO DE LÂMINAS HISTOLÓGICAS3.4 PREPARAÇÃO DE LÂMINAS HISTOLÓGICAS
3.4 PREPARAÇÃO DE LÂMINAS HISTOLÓGICAS 
 
 
 
Os fragmentos destinados a histologia foram crioprotegidos com talco, 
subseqüentemente envoltos por resina Tissue-tec
®
(Sakura, Japão) e montados em uma 
rolha de cortiça previamente identificada, mantendo as fibras musculares na orientação 
vertical em relação à superfície da rolha. O conjunto foi congelado e armazenado em 
nitrogênio líquido. 
As lâminas de vidro foram cobertas com polilisina para aumentar a aderência do 
corte histológico à lâmina. 
Os fragmentos musculares foram seccionados transversalmente com espessura de 
6μm num micrótomo criostato à temperatura de –25
o
C. Em seguida as lâminas foram 
armazenadas em freezer –70
o
C. 
 
37 
 
 
 
3.5 HISTOLOGIA
3.5 HISTOLOGIA3.5 HISTOLOGIA
3.5 HISTOLOGIA 
 
 
 
3.5.1 
3.5.1 3.5.1 
3.5.1 Coloração de Hematoxilina
Coloração de HematoxilinaColoração de Hematoxilina
Coloração de Hematoxilina-
--
-Eosina (HE)
Eosina (HE)Eosina (HE)
Eosina (HE) 
 
 
 
 
 
A coloração de HE permite analisar a morfologia das fibras musculares e dos 
tecidos adjacentes, podendo-se observar se existe ou não hiperplasia, hipertrofia, 
presença de regeneração/degeneração, estruturas anormais, entre outros. Esta reação foi 
realizada de acordo com a descrita em Dubowitz, 1985. 
 
3.5.2 
3.5.2 3.5.2 
3.5.2 Coloração com Picro Sirius
Coloração com Picro SiriusColoração com Picro Sirius
Coloração com Picro Sirius
®
®®
® 
 
 
 
 
 
A coloração com Picro Sirius
®
®®
®
 permite a visualização dos tecidos conjuntivos 
perimisial e endomisial de tecidos musculares. Através de um microscópio óptico com 
câmera fotográfica acoplada e conectada a um computador é possível fazer a 
quantificação proporcional entre a área de tecido conjuntivo e a área total de um campo 
selecionado. Esta reação foi realizada de acordo com as seguintes etapas: 
Primeiramente as lâminas com os cortes histológicos ficam submersas por 20 
minutos em Bouim para a fixação do tecido. Depois elas passam por um banho de água 
corrente para retirar o excesso de Bouim. Em seguida são submersas em solução de Sirius 
Red
®
 com ácido pícrico. Apósaproximadamente 30 minutos é feita a desidratação em 
série de 2 minutos em cada desidratante seguinte: em álcool 90%, álcool 100%, solução 
de álcool mais xilol e por ultimo xilol. As lâminas são retiradas uma por vez para serem 
montadas com resina para montagem histológica e lamínula. 
Para a quantificação utiliza-se o software KS 300 (2002) da Carl Zeiss, o qual 
calcula a área relativa ao tecido conjuntivo (corado em vermelho) em relação à área total 
do corte. 
 
 
 
 
 
 
 
 
38 
 
 
 
3.6 ESTUDOS MOLECULARES
3.6 ESTUDOS MOLECULARES3.6 ESTUDOS MOLECULARES
3.6 ESTUDOS MOLECULARES 
 
 
 
Cada fragmento destinado a estudos moleculares foi congelado em nitrogênio 
líquido, macerado com pistola em banho de nitrogênio líquido e dividido em duas partes, 
uma para extração de proteínas e outra para extração de DNA e RNA. 
 
3.6.1
3.6.13.6.1
3.6.1Extração de RNA total
Extração de RNA totalExtração de RNA total
Extração de RNA total 
 
 
 
 
 
O RNA total foi extraído dos músculos coletados, a partir de material macerado com 
pistola em banho de nitrogênio líquido e estocado também em nitrogênio líquido. A 
extração de RNA do material pulverizado foi realizada com o reagente Trizol
®
 (Invitrogen 
Inc Brasil), conforme as especificações do fabricante. O RNA foi diluído em água tratada 
com dietilpirocarbonato 0,01% (DEPC) (livre de ribonucleases) e guardado em freezer –
70
o
C. 
 
3.6.2 
3.6.2 3.6.2 
3.6.2 Síntese de cDNA total
Síntese de cDNA totalSíntese de cDNA total
Síntese de cDNA total 
 
 
 
O RNA foi quantificado em espectrofotômetro no comprimento de onda de 260 nm, 
1 µg de RNA total foi utilizado para a síntese de cDNA, a qual foi realizada conforme 
protocolo da enzima MMLV (Invitrogen). 
 
3.6.3
3.6.33.6.3
3.6.3Análise de Expressão da miostatina
Análise de Expressão da miostatinaAnálise de Expressão da miostatina
Análise de Expressão da miostatina 
 
 
 
 
 
Em um primeiro momento os cDNAs foram testados através da reação em cadeia 
da polimerase convencional (PCR), com um par de “oligonucleotideos” que amplificam o 
gene endógeno GAPDH. De cada amostra 2µl. do produto de PCR foi misturado com o 
mesmo volume de tampão de corrida e aplicado em gel de poliacrilamida. Como todos 
amplificaram, foi feito o PCR Real Time para os pares de oligonucleotideos dos genes da 
miostatina e do endógeno GAPDH. 
39 
 
 
 
 
 
 
3.6.4 
3.6.4 3.6.4 
3.6.4 PCR 
PCR PCR 
PCR em Tempo Real (Q
em Tempo Real (Qem Tempo Real (Q
em Tempo Real (Q-
--
-PCR)
PCR)PCR)
PCR)-
--
- 
 
 quantificação relativa da expressão da miostatina
quantificação relativa da expressão da miostatinaquantificação relativa da expressão da miostatina
quantificação relativa da expressão da miostatina 
 
 
 
As amostras de cDNA foram aplicadas em triplicatas em placa ótica de 96 poços. A 
cada amostra foi adicionado o par de primers do gene de interesse e o MasterMix contendo 
Sybr Green (Applied Biosystems), num volume total de 25μL. A corrida das placas foi feita 
no termociclador para Real-Time 7500 da Applied Biosystems. 
 
Quadro2- Pares dos oligonucleotideos para amplificação do gene alvo da miostatina e o gene 
endógeno GAPDH. 
MIOSTATINA forward (MSTN F) AACCTTCCCAGGACCAGGAG 
MIOSTATINA reverse (MSTN R) CATCGCAGTCAAGCCCAAAG 
GAPDH forward AGGTCGGTGTGAACGGATTTG 
GAPDH reverse TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA 
 
Para quantificação relativa da expressão da miostatina, foi necessário realizar uma 
curva padrão com diferentes diluições de um cDNA controle. Nesta etapa é determinado o 
threshold, o qual é um valor arbitrário do limiar que determina o ciclo onde é medida a 
fluorescência em cada reação (Ct). O valor Ct é usado pelo programa para calcular a 
expressão de um gene da amostra alvo. 
Os valores obtidos foram comparados quanto à sua significância estatística com o 
auxílio do programa MiniTab. O teste realizado foi o não-paramétrico de Mann-Whitney. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
40 
 
 
 
 
 
 
4 RESULTADOS4 RESULTADOS4 RESULTADOS4 RESULTADOS 
 
 
 
4.1 CARACTERIZAÇÃO DA A
4.1 CARACTERIZAÇÃO DA A4.1 CARACTERIZAÇÃO DA A
4.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA
MOSTRAMOSTRA
MOSTRA 
 
 
 
 Foram avaliados no total 36 animais, pertencentes a 5 diferentes linhagens:C57Bl, 
SJL/J, Dmd
mdx
, Large
myd 
e Lama2
dy2J
/J,conforme ilustrado no Quadro 3. De acordo com os 
resultados obtidos e da viabilidade de material, o número de animais nos diferentes testes 
variou. 
Quadro3- Animais avaliados por cada metodologia 
 
 
 
SEMI
SEMISEMI
SEMI 
 
 QUANTITATIVO
QUANTITATIVOQUANTITATIVO
QUANTITATIVO 
 
 QPCR
QPCRQPCR
QPCR 
 
 
 
 HISTOLOGIA
HISTOLOGIAHISTOLOGIA
HISTOLOGIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
DIAFRAGMA
DIAFRAGMADIAFRAGMA
DIAFRAGMA 
 
 
 
 GASTROCNÊMIO
GASTROCNÊMIOGASTROCNÊMIO
GASTROCNÊMIO 
 
 DIAFRAGMA
DIAFRAGMADIAFRAGMA
DIAFRAGMA 
 
 
 
 GASTROCNÊMIO
GASTROCNÊMIOGASTROCNÊMIO
GASTROCNÊMIO 
 
 DIAFRAGMA
DIAFRAGMADIAFRAGMA
DIAFRAGMA 
 
 
 
 GASTROCNÊMIO
GASTROCNÊMIOGASTROCNÊMIO
GASTROCNÊMIO 
 
 
C57Bl
C57BlC57Bl
C57Bl 
 
 C19 
 
 C19 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 C20 
 
 C20 C 20 D C 20 G C20G 
 
 
 C21 C21D C21G 
 
 
 C22 
 
 C22 C22D C22G 
 
 
 C23 
 
 C23 C 23 D C 23 G C23D C23G 
 
 
 C24 
 
 C24 C 24 D C 24 G 
 
 
 C25 
 
 C25 C 25 G C25D C25G 
 
 
 C46 
 
 C46 C 46 D C 46 G C46D C46G 
 
 
 C47 
 
 C47 C 47 D C 47 G 
 
 
 C48 
 
 C48 
SJL/J
SJL/JSJL/J
SJL/J 
 
 S1 
 
 
 S2 
 
 S2 S 2D S 2 G S2D 
 
 
 S3 
 
 S3 S 3D S 3 G S3D S3G 
 
 
 S4 
 
 S4 S 4D S 4 G S4D S4G 
 
 
 S5 
 
 S5 S 5D S 5 G S5D S5G 
 
 
 S6 
 
 S6 S 6D S 6 G S6D S6G 
 
 
 S7 
 
 S7 S 7D S 7 G S7D 
Dmd
DmdDmd
Dmd
mdx
mdxmdx
mdx
 
 
 M8 
 
 
 M9 
 
 M9 M 9D M 9 G M9D M9G 
 
 
 M10 M18G 
 
 
 M25 M 25D M 25 G M25D M25G 
 
 
 M26 
 
 M26 M 26D M 26 G M26D M26G 
41 
 
 
 
 
4.2 ANÁLISE DE EXPRESSÃO DA MIOS
4.2 ANÁLISE DE EXPRESSÃO DA MIOS4.2 ANÁLISE DE EXPRESSÃO DA MIOS
4.2 ANÁLISE DE EXPRESSÃO DA MIOSTATINA
TATINATATINA
TATINA 
 
 
 
4.2.1 
4.2.1 4.2.1 
4.2.1 Aná
AnáAná
Análise semiquantitiva.
lise semiquantitiva.lise semiquantitiva.
lise semiquantitiva. 
 
 
 
 
 
A avaliação do nível de expressão da miostatina nos diferentes grupos de modelos 
murinos para distrofias musculares, foi realizado através do método semiquantitativo, com 
reações de PCR para amplificação do cDNA da miostatina em 27 e 30 ciclos. Utilizou-se 
como gene endógeno o GAPDH. Um exemplo representativo do padrão de amplificação e 
corrida em gel de acrilamida estão ilustrados na figura 12. 
 
 
 
 M27 
 
 M27 M 27D M 27 G M27D M27G 
 
 
 M28 
 
 M28 M 28D M 28 G M28D M28G 
 
 
 M29 
 
 M29 M 29D M 29 G M29D M29G 
Large
LargeLarge
Large
myd
mydmyd
myd
 
 
 L118 
 
 L118 L 118D L 118 G L118G 
 
 
 L121 
 
 L121 L 121D L 121 G L121D L121G 
 
 
 L123 
 
 L123 L 123D L 123 G L123D L123G 
 
 
 L129 
 
 L129 L 129D