Seminário - CINETOCORO - ESTABILIZAÇÃO E DESESTABILIZAÇÃO DA INTERAÇÃO

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Aluna: Andrielle Araújo Oliveira
Doi:10.1038/nmat3586
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Introdução
Encapsulation of hMSCs within HA hydrogels
Previously described methods were used to synthesize MeHA30 (~92% methacrylation) from sodium hyaluronate (Lifecore), MeAlg (~70% modification) from sodium alginate (Sigma), and MeDex (~50% modification) from dextran (Sigma). MeMaHA with ~14% and ~10.5% methacrylate and maleimide modification, respectively, was synthesized via the coupling of the tetrabutylammonium salt of NaHA (HA-TBA) with 2-amino methacrylate hydrochloride (Sigma) and 2-amino maleimide trifluoroacetate salt (Sigma) (Supplementary Fig. S20). The chemical structures and 1H NMR spectra of MeHA, MeAlg, MeDex and MeMaHA are provided in Supplementary Fig. S21, Supplementary Fig. S22, Supplementary Fig. S23, and Supplementary Fig. S24, respectively. The integrin binding peptide GCGY RGD SPG (Genscript; italics indicates cell adhesive domain) was conjugated to MeHA, MeAlg, and MeDex (754 µM, matching that used in the described physically crosslinked alginate studies), and to MeMaHA (1 mM) via 30 min reaction in pH 8.0 PBS at 25 °C prior to crosslinking. 
Passage 3 hMSCs (Lonza) were encapsulated either into MeMaHA (1 million hMSCs ml−1) hydrogels using Michael addition reactions between MeMaHA maleimides and the MMP degradable peptide GCRDVPMS↓MRGGDRCG (Genscript; down arrow indicates cleavage site by MMP-2), or into MeHA, MeAlg, or MeDex (15 million hMSCs ml−1) using photo-iniciado free radical polymerization (Exfo Omnicure S1000 lamp with a 320–390 nm filter, exposure of 10 mW cm−2 for 5 min) in the presence of 0.05 wt% Irgacure 2959 (I2959; Ciba), a photoinitiator chosen for its aqueous solubility and good cytocompatibility38. For CD44 blocking studies, hMSCs were incubated with anti-CD44 (3/1000, mouse mAb CD44, Abcam) in a buffer (2 mM EDTA and 2% FBS in PBS) for 45 min on ice, washed twice in buffer, and resuspended in growth media prior to encapsulation. All gels were transferred to FBS-supplemented MEM-α (Invitrogen). MeMaHA hydrogels were secondarily photopolymerized at day 0 (“D0 UV”) or day 7 (“D7 UV”) by incubating with I2959 and exposing to UV light as described above. The elastic modulus of the hydrogels was measured via parallel plate compression testing at 10% ramped strain min−1 as previously reported27. For differentiation studies, following 7 days of incubation in growth media, hydrogels were transferred to a 1:1 mixture of adipogenic:osteogenic media (R&D Systems), with media changes every 3 days. For ROCK inhibition studies, selected −UV gels were treated with 10 µM Y-27632 (Sigma) daily during either the growth media (day 1–7) or mixed media (day 7–21) incubation periods.
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Segregação cromossômica
Dartmouth Medicine - http://dartmed.dartmouth.edu/summer09/html/disc_division.php
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Erros de segregação cromossômica
Aneuploidias - número anormal de cromossomos. 
Síndrome de Down entre outras
Associação com câncer - maioria dos tumores sólidos apresentam cariótipos aneuploides.
Google imagens
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O que garante a fidelidade da segregação cromossômica?
Adesão anfitélica (bi-orientada) dos cromossomas ao fuso por meio da fixação da extremidade de micro-túbulos aos cinetócoros.
Azevedo & Sunkel, 2012. 5ª ed.
Replicated chromosomes have two kinetochores and bi-orientation is achieved when one kineto- chore binds microtubules oriented towards one spindle pole and the other kinetochore binds microtubules oriented towards the opposite spindle pole
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Captura inicial é assincrônica e estocástica
Como o cinetócoro captura os microtúbulos?
Kinetochore–microtubule attachments in mitosis
 Transient intermediates: monotelic and lateral attachments 
 Errors in attachment: syntelic and merotelic attachments 
The erroneous attachments are corrected
Key components of the core control network
Cyclin A forms a temporal gradient 
Aurora A and Aurora B kinases form spatial gradients
Figure 1 | Kinetochore–microtubule attachments in mitosis. Different types of kinetochore–microtubule (k–MT) attachments occur in prometa‑ phase (a‑d). These include transient intermediates such as monotelic attach‑ ments (in which only one of the sister kinetochores is attached to microtubules from one spindle pole) and lateral attachments (in which kinetochores are bound to the side wall of microtubules). In addition, errors in attachment exist, including syntelic attachments (in which both sister kinetochores are attached to microtubules from the same spindle pole) and merotelic attachments (in which a single kinetochore is attached to microtubules from both spindle poles). As cells progress through mitosis, the erroneous attachments are corrected, leading to end‑on, bi‑oriented attachments, in which sister kinetochores are attached to microtubules from opposite spindle poles to support faithful chromosome segregation. A core control network regulates the stability of k–MT attachments to promote efficient error correction and ensure faithful chromosome segregation. Note that, for simplicity, only ciclina­ A,­Aurora­A­kinase­and­Aurora­B­kinase­—­which­are­key­components­of­the­core­control­network­—­are­shown­in­the­figure.­ciclina­A­forms­a­tem‑ poral gradient as its abundance declines during prometáfase (a‑d), whereas Aurora­A­and­Aurora­B­kinases­form­spatial­gradients­at­spindle­poles­and­at­ centromeres,­respectively.­Correction­of­syntely­involves­the­recognition­and­ targeted destabilization of k–MT attachments through the combined activi‑ ties­of­Aurora­A­and­Aurora­B­kinases­as­chromosomes­are­pulled­towards­the­ spindle poles (a‑d). The release of microtubules from kinetochores permits the chromosome to move to the spindle midzone through lateral k–MT attach‑ ments to re‑establish bi‑oriented attachments (c,d).­Correction­of­merotely­ involves the indiscriminate destabilization of k–MT attachments on aligned chromosomes during prometáfase (a to b, c to d). The high detachment rate of k–MT attachments in prometáfase (dashed lines) that is ensured by ciclina A activity combines with the back‑to‑back geometry of sister kinetochores to facilitate bi‑oriented attachments. In metáfase (e), k–MT attachments switch to more stable attachments (solid lines) as ciclina A levels fall below a critical threshold.
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intermediários normais
Ligações monotélicas
Ligações laterais (importante no alinhamento do cromossomo no eixo equador)
Ligações monotélicas (apenas uma cinetócoro se liga ao microtúbulo)
Ligações laterais (cinetócoros ligam à parede lateral de um dos microtúbulos)
Papel importante no alinhamento do cromossomo no eixo equador
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Erros nas ligações k-MT
Também podem se formar e incluem:
Ligações merotélicas 
Ligações sintélicas
Devem ser convertidas em ligações bi-orientadas – correta segregação cromossômica.
Azevedo & Sunkel, 2012. 5ª ed.
Ligações merotélicas (o mesmo cinetócoro liga-se aos microtúbulos orientados para ambos os pólos do fuso) 
Ligações sintélicas (microtúbulos do mesmo fuso se ligam a ambos os pólos dos cinetócoros ). 
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Frequência dos erros
Determinada por:
Eficiência de correção - velocidade de turnover das ligações k-MT (associação/dissociação)
Ligações k-MT errôneas => dissiociadas
Novas adesões corretas => formadas
Taxa de correção de erros > Taxa de formação de erros
- Velocidade de formação 
- Taxa de correção
The number of these errors is determined by both their rate of formation and their rate of correction. 
The efficiency of correction depends on the rate of turnover of kinetochore microtubules (defined by the attachment and detachment of microtubules from kinetochores) because erroneous k– MT attachments must be released from the kinetochore to enable the formation of new, correct attachments. 
As microtubule capture is stochastic, the error correction rate must be sufficient to correct initial errors and exceed the rate of new error formation.
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Fidelidade mitótica
Depende da dinâmica
das taxas de associação e dissociação k-MT
 
Combinação dessas duas taxas => estabilidade k–MT
Diferentes modelos: como seria regulada essa dinâmica durante a mitose.
Um modelo
 A tensão gerada como consequência da ligação anfitélica de k-MT determinaria:
Estabilidade das ligações k–MT 
A eficiência da correção de erros
Novos dados => modelo mais refinado:
Princípios do controle homeostático – descrição mais precisa dessa regulação durante a mitose, garantindo a correção de erros
Importância da dinâmica k-MT
Dissociação dos MTs do cinetócoros => etapa limitante na taxa de correção 
↑ dissociação
Portanto: dissociação de k-MTs instáveis => ↑ eficiência da correção de erros
Destaque na pesquisa sobre instabilidade cromossômica (CIN) em células humanas cancerosas 
 > chances de k-MT corretamente orientadas
Células com Instabilidade cromossômica
CIN resulta de erros persistentes da segregação cromossômica
Perdas e/ou ganhos de cromossomos inteiros aleatoriamente.
Células com CIN => ligações k-MT hiperestáveis em relação a células diploides normais. 
Medidas obtidas utilizando dissipação de fluorescência após fotoativação.
 
of whole-chromosome missegregation that leads to random losses
By measuring the stability of k–MT attachments in live cells using fluorescence dissipation after photo- activation, it was shown that cells with CIN have hyperstable k–MT attachments relative to chromosomally stable diploid cells. 
 and/or gains of whole chromosomes. 
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Células com Instabilidade cromossômica
k–MT hiperestáveis =>↓ eficiência de correção de erros 
Erros persistem na anáfase => erros de segregação cromossômica
Desestabilização de k-MT em células cancerosas com CIN => restauração da segregação cromossômica normal 
↑ estabilidade de k–MT em células normais => ↓ eficiência de correção de erros 
CIN em tumores primários deve depender da estabilidade de k–MT
Cromossomos “atrasados” na anáfase
Há um limite máximo da taxa de dissociação k-MT
A dissociação excessiva é mais prejudicial que benéfica
As ligações devem ser suficientemente estáveis: 
Gerar e manter o alinhamento cromossômico na placa metáfásica 
Manter número suficiente de MTs ligados aos cinetócoros para satisfazer o SAC (spindle assembly checkpoint)
SAC: rede de sinalização
Garantir o correto andamento da mitose
Recebe sinais do cinetócoro
Impede a segregação cromossômica na anáfase até que todos cromossomos estejam ligados aos MTs do fuso
A estabilidade de k–MT é regulada de forma precisa em uma faixa estreita:
Controle da estabilidade de k–MT
Quantidade considerável de pesquisas
Compreender os processos de bi-orientação das ligações k–MT antes do início da anáfase 
Dados recentes => estabilidade de k–MT seria regulada por múltiplas vias
Tensão Centromérica controla estabilidade de k–MT 
Ligação k–MT bi-orientada seria mais estável
Tensão resultante seria um mecanismo de discriminar os diferentes estados de orientação 
Conceito expandido com estudos moleculares
Atividade da Aurora B cinase => componente enzimático de um complexo dentro dos centrômeros (parte interna).
Tensão Centromérica: Aurora B cinase
Desestabiliza as ligações k–MT => ↑ taxa de correção de erros 
Atividade máxima no interior do centrômero, diminuindo progressivamente para fora do cinetócoro
k-MT anfitélica gera tensão através do centrômero à medida que cinetócoros-irmãos são puxados para lados opostos
↑ distância física entre o interior do centrômero e o cinetócoro 
Aurora B cinase
↓ fosforilação do cinetócoro dependente de aurora B cinase
Cinetócoro mais sujeito a desfosforilação por fosfatases localizadas nele 
Tensão Centromérica: Aurora B cinase
Ligações k-MT errôneas (sintélicas) 
Não geram tensão centromérica
Cinetócoro é mais fosforilado por Aurora B cinase (mais próximo)
 
Neste modelo dependente de tensão cada cromossomo age de forma autônoma e independente de todos os outros cromossomos. 
Tensão Centromérica: Aurora B cinase
Estudos recentes: 
Ligações k–MT são relativamente instáveis na prometáfase, em todos os cromossomos, mesmo nos bi-orientados
A localização de Aurora B cinase não seria essencial para correção eficiente de erros.
Mudanças na estabilidade de k–MT são reguladas de forma coordenada entre todos os cromossomos ao longo da mitose. 
Isso sugere que
A regulação da estabilidade de k–MT não pode ser explicada por modelos dependentes da tensão centromérica por si só.
Por exemplo:
 Determinísticos demais! 
Determinam que as ligações k– MT em centrômeros sob tensão deveriam ser SEMPRE MAIS ESTÁVEIS do que de centrômeros não tensionados. 
Imageamento de células vivas:
Alta variação das distâncias inter-cinetócoros em cromossomos bi-orientados, à medida que oscilam entre os polos do fuso
Não há evidências de que esse distanciamento possa alterar a estabilidade de k–MT, porque essas distâncias aumentam e diminuem de maneira transitória 
Controle Homeostático da estabilidade de k–MT 
Modelo expandido da regulação da estabilidade de k–MT 
Essa estabilidade seria governada por influência de fontes múltiplas além da tensão centromérica, incluindo:
Reguladores de ciclo celular
Redes de feedback 
Um sistema de controle homeostático ajusta de forma precisa a estabilidade k–MT em cada estágio específico da mitose. 
Sistemas Homeostáticos requerem três elementos: 
Um recetor que monitore e responda às condições do ambiente; 
Uma rede de controle central (RCC) que estabeleça a resposta apropriada com base nas influências do receptor e efetue mudanças; 
 Vias de feedback negativo para modular a rede de controle central assim como efetores para ajustar o sistema.
Traduções de core
substantivo
o
núcleo
core, nucleus, kernel, center, centre, heart
o
cerne
core, heartwood, kernel, duramen
o
caroço
lump, core, stone, seed
o
miolo
crumb, core, kernel, nucleus, bread crumb
a
parte central
core, middle, midst
o
âmago
core, heart, essence, bottom, pith, marrow
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Assim, os autores propõem:
Receptor primário: proteínas ligadoras de MTs do cinetócoro
Respondem à estabilidade da adesão aos MTs; 
Rede de controle central: proteínas do SAC, complexo s de ciclina–cdKs, as cinases Aurora e polo-like (PLKs), 
Efetores: estabilizadores e desestabilizadores de MTs nos cinetócoros; 
Proteinofosfatases PP1 and PP2A: feedback negativo
Figure 2 | Homeostatic control circuit for regulating kinetochore–microtubule attachment stability in mitosis. A receptor, a core control network, effector modules and feedback regulatory mechanisms (grey arrows) of a homeostatic control system regulate kinetochore–microtubule (k–MT) attachment­stability.­Conserved­kinetochore­proteins­directly­bind­microtubules,­thus­forming­the­ receptor. These probably include the proteins of the KMN network (BOX 1). Kinetochore proteins respond to microtubule attachment stability to send signals to the interactive core control network, which­is­composed­of­the­spindle­assembly­checkpoint­(SAC)­and­ciclina–ciclina-dependent­kinase­ (CDK)­complexoes,­polo-like­kinase­1­(PLK1)­and­Aurora­kinases­(and­possibly­others,­including­the­inner­ centromere protein shugoshin (SGO1) and haspin kinase). Arrows inside the core control network reflect some of the known functional interactions among these components. This network integrates input from the cell cycle regulatory machinery and the microtubule occupancy status of kinetochores to regulate the activity of effector molecules to increase or decrease the stability of k–MT attachments accordingly (solid grey arrow). The system is regulated by negative feedback from protein phos‑ phatases­PP1­and­PP2A­(dashed­grey­arrow)­to­enable­control­in­the­context­of­changing­ environmenta l conditions; that is, mitotic phase transitions.
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Evidência para um modelo homeostático
Quantificação da estabilidade k–MT em células vivas 
Amplo espectro
de proteínas envolvendo esses três elementos 
Algumas com papéis duplos dependendo da fase mitótica e do estado de fosforilação da proteína
*L.K.,­unpublished­observations.­APC,­adenomatous­polyposis­coli;­BUB3,­BUB3­mitotic­checkpoint­ protein;­BUBR1,­BUB1-related­kinase­1;­CDC20,­cell­division­cycle­20;­CENP,­centromere­protein;­ CLASP, cytoplasmic­linker-associated­protein;­EG5,­also­known­as­KIF11;­HDAC3,­histone­deacetylase­3;­ HURP,­hepatoma­upregulated­protein­(also­known­as­DAP5);­KIF,­kinesin­family­member;­KMN,­kinetochore­ null­protein­1­(KNL1)–mis-segregation­12­(MIS12)–nuclear­division­cycle­80­(NDC80);­MAD,­mitotic­spindle­ checkpoint­protein;­MCAK,­mitotic­centromere-associated­kinesin;­NUF2,­nuclear­filament-containing­ protein;­PLK1,­polo-like­kinase­1;­SGO1,­shugoshin;­SKA,­spindle-­and­kinetochore-associated­complexo­ subunit;­SKAP,­SRC­kinase-associated­phosphoprotein.
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A rede KMN
Essencial para a ligação da extremidade + dos MTs aos cinetócoros
Apropriada para agir como um receptor para as ligações k–MT. 
Proteína nula de cinetócoro 1 (KNL1)
Erro de segregação 12 (MIS12)
Ciclo de divisão nuclear 80 (NDC80)
Rede da maquinaria conservada do cinetócoro (KMN) 
Proteína nula de cinetócoro 1 
Erro de segregação 12 
Ciclo de divisão nuclear 80 
The KMN network is an association of conserved kinetochore protein complexoes. It is composed of kinetochore null protein 1 (KNL1; see the figure, part a), the mis-segregation 12 (MIS12) complexo (see the figure, part b) and the nuclear division cycle 80 (NDC80) complexo (see the figure, part c). Multiple subunits from different complexoes in the KMN network bind microtubules directly (as indicated by the arrows; see the figure, part d) and some componentes are direct targets of Aurora B kinase phosphorylation as indicated (DSN1 and KNL1). Phosphorylation of DSN1 and KNL1 by Aurora B reduces the microtubule-binding affinity of the KMN network in vitro. In the homeostatic model discussed in this article, the KMN network provides the essential function of binding to microtubule ends and signals to the core control network to ensure that the stability of the kinetochore–microtubule attachments is subsequently properly regulated. NUF2, nuclear f ilament-containing protein; SPC, spindle pole component.
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A rede KMN
Sem essa rede, as ligações k–MT são praticamente eliminadas 
Adesão tudo-ou-nada
Fosforilação pode modificar a afinidade de ligação dos componentes desse complexo aos MTs 
O papel da rede KMN pode ser modulada em resposta a sinais do ambiente
A rede KMN
Além dessa rede, proteínas do controle central e efetoras promovem a estabilização ou desestabilização das ligações k–MT 
Garantir que essa estabilidade permaneça numa faixa definida
Proteínas do controle central: 
Proteínas SAC,
Cinases PLK1, Aurora A e B
Complexos ciclina–CDK 
Possivelmente outras - proteína shugoshina do interior do centrômero (SGO1) e haspin cinase. 
A rede KMN
Rede de controle central regula a rede KMN e as proteínas efetoras 
Não fazem parte da rede KMN e incluem:
Proteínas estabilizadoras e desestabilizadoras de k–MT (astrina e cinesinas associadas ao centrômero mitótico - KIF2C)
Fosfatases PP1 e PP2A => feedback (-) à rede de controle central
Figure 2 | Homeostatic control circuit for regulating kinetochore–microtubule attachment stability in mitosis. A receptor, a core control network, effector modules and feedback regulatory mechanisms (grey arrows) of a homeostatic control system regulate kinetochore–microtubule (k–MT) attachment­stability.­Conserved­kinetochore­proteins­directly­bind­microtubules,­thus­forming­the­ receptor. These probably include the proteins of the KMN network (BOX 1). Kinetochore proteins respond to microtubule attachment stability to send signals to the interactive core control network, which­is­composed­of­the­spindle­assembly­checkpoint­(SAC)­and­ciclina–ciclina-dependent­kinase­ (CDK)­complexoes,­polo-like­kinase­1­(PLK1)­and­Aurora­kinases­(and­possibly­others,­including­the­inner­ centromere protein shugoshin (SGO1) and haspin kinase). Arrows inside the core control network reflect some of the known functional interactions among these components. This network integrates input from the cell cycle regulatory machinery and the microtubule occupancy status of kinetochores to regulate the activity of effector molecules to increase or decrease the stability of k–MT attachments accordingly (solid grey arrow). The system is regulated by negative feedback from protein phos‑ phatases­PP1­and­PP2A­(dashed­grey­arrow)­to­enable­control­in­the­context­of­changing­ environmenta l conditions; that is, mitotic phase transitions.
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A Rede de controle central – Core control network
Discussão dos detalhes dos mecanismos de:
SAC 
PLK1 
Cinases Aurora A e B
Complexos ciclina–CDK
Agem como uma rede de controle central regulando a estabilidade de k–MT 
PLK1: Um exemplo de proteína do controle central
Primeiro elemento de ligação
RCC: regula a estabilidade de k-MT
Fosfatases: feedback que determina o estado de fosforilação dos substratos de RCC
Determina a atividade relativa das proteínas efetoras
Figure 3 | The network of regulatory componentes at kinetochores. The complexidade of the signalling pathways acting to regulate kinetochore–microtubule (k–MT) attachment stability is displayed in a nonspecific stage of mitosis (not necessarily prometáfase or metáfase). The KMN network (BOX 1) provides­the­primary­microtubule-binding­element­in­the­kinetochore.­The­core­control­network­—­ which­is­composed­of­polo-like­kinase­1­(PLK1),­Aurora­B­kinase­and­ciclina–ciclina-dependent­kinases­ (CDKs)­(and­possibly­other­components,­including­the­inner­centromere­protein­shugoshin­(SGO1)­ and­haspin­kinase)­—­acts­to­regulate­the­stability­of­k–MT­attachments.­The­phosphorylation­status­ of­their­substrates­(such­as­kinesin­family­member­2B­(KIF2B),­BUB1-related­kinase­1­(BUBR1),­bi- orientation­­of­chromosomes­in­cell­division­1­(BOD1)­and­survivin)­is­determined­by­feedback­from­the­ phosphatases­PP1­and­PP2A.­The­combined­activities­of­the­core­control­proteins­and­phosphatases­ determines­the­relative­activities­of­effector­proteins­such­as­the­k–MT­stabilizer­BUBR1­and­the­k–MT­ destabilizer­KIF2B,­which­collectively­modulate­k–MT­attachment­stability.
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PLK1: uma proteína do controle central
PLK1 se localiza no cinetócoro durante a prometáfase e é mais abundante em cromossomos não alinhados
PLK1 estimula a atividade de estabilizadores e desestabilizadores de k–MT nos cinetócoros.
A atividade de PLK1 => formação inicial das ligações k–MT estabilizadas
Fosforilação de BUBR1 - cinase 1 relacionada a BUB1 - estabilizadora de k-MT.
PLK1: uma proteína do controle central
PLK1 fosforila e estimula a atividade MT-depolimerase de KIF2B (membro 2B da família da cinesina)
KIF2B se localiza nos cinetócoros na prometáfase; necessária para desestabilizar k–MT e corrigir erros com eficiência
PLK1 mantém a estabilidade de k–MT dentro de uma faixa que permite essa ligação, de forma instável suficiente para para facilitar a correção de erros.
PLK1: uma proteína do controle central
Não se sabe como PLK1 regula essas atividades opostas 
Controle temporal da atividade de PLK1 – crucial
Quando PLK1 é artificialmente “amarrada” ao cinetócoro => nível excessivamente alto durante a metáfase, estabiliza inapropriadamente as ligações k–MT 
↑ frequência dos erros por merotelia => atraso dos cromossomos na anáfase.
PLK1 => estabilizar ou desestabilizar k–MT?
PLK1: uma proteína do controle central
Um biossensor baseado em FRET (fluorescence resonance energy transfer) para atividade de PLK1 mostra: 
Não há gradiente de substrato de fosforilação por PLK1 análogo ao de Aurora B cinase. 
Fosforilação de estabilizadores e desestabilizadores de k-MT dependente de PLK1 não seria diretamente controlada pela tensão do centrômero.
Gradiente de fosforilação
de Aurora B cinase
J Cell Biol. 2011 Aug 22; 194(4): 539–549
doi:  10.1083/jcb.201103044
regulação de plk1
Componente chave para um sistema homeostático: feedback negativo para a rede de controle central
Fosfatase PP2A => Regulador negativo importante de PLK1
BUBR1 é alvo de PLK1, e serve para recrutar PP2A aos cinetócoros através da ligação da subunidade regulatória B56 de PP2A. 
↓ B56 => ↑ PLK1 
Figure 3 | The network of regulatory componentes at kinetochores. The complexidadeof the signalling pathways acting to regulate kinetochore–microtubule (k–MT) attachment stability is displayed in a nonspecific stage of mitosis (not necessarily prometáfase or metáfase). The KMN network (BOX 1) provides­the­primary­microtubule-binding­element­in­the­kinetochore.­The­core­control­network­—­ which­is­composed­of­polo-like­kinase­1­(PLK1),­Aurora­B­kinase­and­ciclina–ciclina-dependent­kinases­ (CDKs)­(and­possibly­other­components,­including­the­inner­centromere­protein­shugoshin­(SGO1)­ and­haspin­kinase)­—­acts­to­regulate­the­stability­of­k–MT­attachments.­The­phosphorylation­status­ of­their­substrates­(such­as­kinesin­family­member­2B­(KIF2B),­BUB1-related­kinase­1­(BUBR1),­bi- orientation­­of­chromosomes­in­cell­division­1­(BOD1)­and­survivin)­is­determined­by­feedback­from­the­ phosphatases­PP1­and­PP2A.­The­combined­activities­of­the­core­control­proteins­and­phosphatases­ determines­the­relative­activities­of­effector­proteins­such­as­the­k–MT­stabilizer­BUBR1­and­the­k–MT­ destabilizer­KIF2B,­which­collectively­modulate­k–MT­attachment­stability.
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Aurora B Cinase
Papel na desestabilização de k–MT => correção de erros
Participa no feedback regulatório como parte da RCC
Numerosos substratos na mitose: proteínas do cinetócoro
A fosforilação do cinetócoro varia de acordo com a distância do interior do centrômero. 
No início da mitose é aumentada nos centrômeros (mesmo nos cromossomos mal alinhados)
PLK1
Fosforilação de survivina
+
Exemplo de regulação dentro da RCC da estabilidade de k–MT
Aurora B também influencia diretamente os receptores de MTs no cinetócoro 
Por exemplo:
Fosforilação por Aurora B cinase => ↓ afinidade das proteínas DSN1 and KNL1 (rede KMN) pelos MTs
PP2A via B56
-
Mecanismo direto e reversível de regulação da afinidade por MTs dessas proteínas do cinetócoro
PP1 desfosforila substratos de Aurora B cinase na mitose
A proteína da rede KMN - KNL1 => sítio de ligação ou porto para PP1 nos cinetócoros
Aurora B cinase 
KNL1
P
PP1 <-> KNL1
X
Substratos
P
X
Aurora B Cinase
Neste contexto, a tensão nos cromossomos bi-orientados empurra KNL1 fora do alcance de Aurora B cinase. 
PP1 é recrutado ao cinetócoro
(-) Aurora B cinase
estabiliza k–MT
Feedback negativo entre o cinetócoro (o receptor) e a RCC regulando a atividade de Aurora B cinase e influenciando a estabilidade de k-MT.
CDKs
Atividades ciclina-CDKs são outro componente de controle central da estabilidade de k–MT 
“Switch” coordenado da estabilidade de k–MT - todos os cromossomos 
Prometáfase para metáfase e desta para anáfase. 
CDKs
A atividade ciclina-CDKs => manter as ligações k-MT instáveis em cromossomos bi-orientados durante toda a prometáfase
Importante para correção de erros 
Depleção de ciclina => ↑ taxa de erros de segregação na anáfase
Metáfase=>anáfase 
Perda da atividade da ciclina B-CDK
Destruição de ciclina B => ↑ estabilidade k–MT 
Cdks
Respostas de estabilidade variadas com relação aos níveis de ciclina B. Exemplos: 
Expressão de ciclina B não-degradável em embriões de Drosophila melanogaster => ↑ ligações merotélicas de k–MT 
Depleção de ciclina B em células de mamíferos=> ↑ atraso de cromossomos na anáfase 
Impedimento da destruição de ciclina B - momento da disjunção das cromátides-irmãs => desestabilização de k–MT em células humanas
cdks
Resultados aparentemente contraditórios 
Correção ou formação de erros são dependentes da presença ou ausência de ciclina B. 
Degradação prematura de ciclina B => k-MT hiperestável => ↓correção de erros 
Expressão excessiva de ciclina B 
Proteína do interior do centrômero (INCENP) e Aurora B cinase permanecem no cinetócoro na anáfase 
k–MT desestabilizada => ↑ taxa de formação de novos erros
cdks
Vias moleculares detalhadas de regulação por ciclina–CDK ainda são desconhecidas 
Uma via potencial envolve PLK1. 
PP2A =>(-)PLK1 (-) <= pela bi-orientação dos cromossomos na divisão celular 1 (BOD1)
Células sem a função BOD1 => disrrupção de k–MT
BOD1 seria regulada por atividade ciclina-Cdk
Regulação de PLK1 por cinases e fosfatases a montante na via.
Complexos Ciclina–CDK – fosforilação de substratos de PLK1 => regulação a jusante da função de PLK1
Figure 3 | The network of regulatory componentes at kinetochores. The complexidadeof the signalling pathways acting to regulate kinetochore–microtubule (k–MT) attachment stability is displayed in a nonspecific stage of mitosis (not necessarily prometáfase or metáfase). The KMN network (BOX 1) provides­the­primary­microtubule-binding­element­in­the­kinetochore.­The­core­control­network­—­ which­is­composed­of­polo-like­kinase­1­(PLK1),­Aurora­B­kinase­and­ciclina–ciclina-dependent­kinases­ (CDKs)­(and­possibly­other­components,­including­the­inner­centromere­protein­shugoshin­(SGO1)­ and­haspin­kinase)­—­acts­to­regulate­the­stability­of­k–MT­attachments.­The­phosphorylation­status­ of­their­substrates­(such­as­kinesin­family­member­2B­(KIF2B),­BUB1-related­kinase­1­(BUBR1),­bi- orientation­­of­chromosomes­in­cell­division­1­(BOD1)­and­survivin)­is­determined­by­feedback­from­the­ phosphatases­PP1­and­PP2A.­The­combined­activities­of­the­core­control­proteins­and­phosphatases­ determines­the­relative­activities­of­effector­proteins­such­as­the­k–MT­stabilizer­BUBR1­and­the­k–MT­ destabilizer­KIF2B,­which­collectively­modulate­k–MT­attachment­stability.
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SAC (spindle assembly checkpoint)
Regula os níveis de ciclina A e B 
Degradação de ciclina A - início da prometáfase
Regulada por competição com o complexo de checkpoint mitótico na ligação ao CDC20 (cell division cycle 20) 
Degradação de ciclina B => quando SAC é satisfeita nos cinetócoros (início da anáfase)
↓ níveis do complexo de checkpoint mitótico => APC/C (anaphase- promoting complex, ou ciclossomo) reconhece ciclina B.
SAC (spindle assembly checkpoint)
Os “switches” que aumentam a estabilidade de k–MT ( Promet. => Metaf. => Anaf.) são sensíveis à sinalização dos checkpoints.
Tensão de estiramento intra-cinetócoro regula as condições que satisfazem SAC
Influência indireta na estabilidade de k–MT
Regulação das quantidades de ciclina A e/ou B. 
Difundem-se na célula => estabilidade de k–MT em todos os cromossomos
modelo homeostático integrado
Complexidade das interações dos componentes regulatórios 
Modelo homeostático mais amplo
Integração de sinais de fontes múltiplas 
Diferentes fases da mitose (RCC)
Ajustar o ponto de estabilidade de k–MT
modelo homeostático integrado
RCC (-) <= PP1 e PP2A 
 (início da prometáfase)
Desestabilizadores de MTs mantém as ligações em um estado relativamente intável
Correção de erros comuns nas fases iniciais da mitose.
Mais tarde na mitose => ↑ formação de k-MT => todos os cromossomos bi-orientados
 
↑ tensão centromérica e ↓ níveis de ciclina A=> transição rápida k–MT mais estáveis => metáfase.
Formação inicial de k–MT
modelo homeostático integrado
Sistemas homeostáticos => regulação fina - longe dos extremos 
Proteínas do cinetócoro não estão saturadas em relação à fosforilação – podem mudar de estado
Inibição de Aurora B cinase 
Proteína do cinetócoro NDC80 mutante (perde todos os sítios de fosforilação) 
 Controle por feedback prejudicado 
Estabilização extrema de k–MT
Correção de erros nas ligações k–MT 
Sistema homeostático com essa finalidade
Principalmente: corrigir ligações merotélicas e sintélicas
antes da anáfase
Duas estratégias (não mutuamente exclusivas) são usadas pelas células 
Desestabilização direcionada de k–MT
Turnover de k–MT é indiscriminado
Desestabilização direcionada de k–MT
Detecção e desestabilização de k–MT com orientações incorretas 
Sintélicas, predominantemente 
Distorção do centrômero => reconhecimento e destruição do gradiente de fosforilação gerado por Aurora B cinase => desestabilização 
Cromossomos sintélicos podem ficar mais próximos do seu polo de adesão – força não-balanceada no polo do fuso
 
Azevedo & Sunkel, 2012. 5ª ed.
Correção da sintelia: reconhecimento e desestabilização direcionada de k–MT, ações combinadas de Aurora A e B cinases 
Correção de erros nas ligações k–MT 
Aurora A cinase:
Abundante nos polos do fuso
Fosforila o componente NDC80 da rede KMN 
 Aurora A + Aurora B cinases => empurrar RCC a uma posição extrema, 
Desestabilização de k–MT no cromossomo, talvez até dissociação completa
Cromossomo => Ligações laterais para se mover até à região média do fuso => ligações bi-orientadas.
NEste modelo:
RCC pode atuar localmente em cromossomos individuais quando as condições requerem mudanças drásticas na estabilidade de k–MT
Aurora A e Aurora B cinases cooperam com a desestabilização de k–MT em cromossomos sintélicos próximos aos polos do fuso. 
Prevê que k–MT em cromossomos próximos aos polos do fuso são excepcionalmente instáveis
Limitações técnicas impedem a medida direta dessa estabilidade próxima aos polos do fuso
Turnover de k–MT é indiscriminado
Outra estratégia de correção de erros de k–MT 
Desestabilizar k–MT sem discriminar entre MTs orientados na direção do polo correto e incorreto
Correção da merotelia (não é detectada por SAC e dependeria do arranjo geométrico dos cinetócoros-irmãos em cada lado dos centrômeros )
Arranjo “back-to-back” dos cinetócoros-irmãos favoreceria a adesão de Mts em direção a polos opostos 
Azevedo & Sunkel, 2012. 5ª ed.
Correção da merotelia: desestabilização indiscriminada de k–MT em cromossomos alinhados durante a prometáfase 
K-MT em cromossomos bi-orientados continuam a passar por rápido turnover durante a prometáfase
Controle pela abundância de ciclina A – difusão - afeta a estabilidade igualmente em todos os cromossomos
Influências de outros componentes da RCC ficam em segundo plano
Dominância da ciclina A nesse controle da estabilidade durante a prometáfase 
Cinetócoros => ligam estado mais estável típico de metáfase com a degradação de ciclina A. 
↓influência da ciclina A
Tensão centromérica se torna dominante na RCC (bi-orientação)
Correção de erros nas ligações k–MT 
Estabilização rápida e irreversível de k–MT quando a célula entra na metáfase 
Ocupação dos MTs nos cinetócoros para satisfazer o checkpoint do fuso => anáfase
Não há diferença na estabilidade de k–MT em cinetócoros merotélicos X bi-orientados. 
Técnicas avançadas requeridas para identificar cinetócoros merotélicos em células vivas e mensurar a estabilidade em cinetócoros individuais
conclusão
Sistemas biológicos usam mecanismos de controle homeostático:
Utilidade em manter estabilidade responsiva a mudanças do ambiente
O modelo descrito: garantir alta fidelidade mitótica controlando rigidamente a estabilidade de k-MT
????? => oportunidades para mais experimentos
Ex.: A ideia de que a RCC possa responder à estabilidade de k–MT precisa ser testada, assim como definir mecanismos moleculares subjacentes.
Obrigada!
Acabou? Obrigada pela atenção!
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