Apostila de Aulas Práticas Bacteriologia

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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE 
INSTITUTO BIOMÉDICO 
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA 
DISCIPLINA DE BACTERIOLOGIA 
CURSO: MEDICINA VETERINÁRIA 
 
 
 
 
 
 
APOSTILA 
DE 
AULAS PRÁTICAS 
 
- DISCIPLINA - 
BACTERIOLOGIA 
 
MEDICINA VETERINÁRIA 
 
 
 
 
 
ORIENTADOR DIDÁTICO: PROFESSOR ALOYSIO CERQUEIRA 
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ASSUNTO 
- Material utilizado nas práticas de Bacteriologia 
- Técnica e Processos de Assepsia em Bacteriologia 
- Microscopia 
 
OBJETIVOS 
 
1- Apresentar a vidraria e outros materiais de uso corrente em um laboratório de 
Microbiologia. 
2- Executar técnicas de preparo de material e montagem para esterilização. 
3- Treinar técnicas de distribuição asséptica. 
4- Evidenciar a existência de bactérias no ar, roupas, etc. 
5- Explanação sobre o microscópio. 
 
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 
 
Técnicas de Assepsia 
 
 É fundamental tomar certos cuidados com a assepsia durante os procedimentos realizados 
num laboratório de Microbiologia, a fim de se evitar contaminação de materiais e erros nos 
resultados finais. Estes cuidados incluem: 
 
§ Desinfecção da bancada e das mãos antes e depois da prática executada 
§ Trabalhar na área estéril ao redor do Bico de Bunsen 
§ Esterilizar alças e agulhas antes e depois do seu uso. 
§ Flambar bocas de tubos e frascos antes e depois das inoculações 
 
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Cuidados de assepsia na remoção de bactérias 
 
 
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O Bico de Bunsen 
 
O bico de Bunsen é utilizado nos laboratórios de bacteriologia para evitar a contaminação 
do manipulador, do material esterilizado ou das culturas de microrganismos, a fim de evitar a 
penetração de um microrganismo num local que não o contenha. 
Deve-se deixá-lo na chama azul, que é mais quente que a laranja. Ele cria uma área de 
segurança (estéril) de 10 cm de raio ao seu redor, porque o ar frio chega (com microorganismos em 
suspensão) e ao esquentar, se dispersa, dispersando com ele os microorganismos. 
As manipulações devem ser feitas, preferencialmente, por trás da chama do bico de Bunsen. 
 
A alça e a agulha de platina 
 
 A platina ou o aço (mais freqüentemente usado) são os materiais ideais porque esquentam e 
esfriam rapidamente. As alças e agulhas bacteriológicas são feitas de fio de platina, de calibre 24 a 
26, fixados a um suporte. Nas alças, o fio de platina é fechado na extremidade em forma circular, 
com um diâmetro de 2 a 3 mm, onde cabe um inoculo de 10 milhões de bactérias. 
A alça é utilizada para repique e semeadura de bactérias em meios líquidos e sólidos. Para 
sua esterilização, devem ser flambadas no Bico de Bunsen até ficarem rubras, num aquecimento 
progressivo da base para a ponta, para evitar a formação de aerossóis. Após flambar, deve-se deixá-
las esfriar um pouco na área de segurança antes de iniciar os procedimentos nos meios de cultura. 
 
 
 
MATERIAL 
 
- Vidrarias. 
- Outros materiais de uso em um laboratório de Microbiologia. 
- Água peptonada. 
- Placas de Petri com Ágar simples. 
- Pipetas e tubos de ensaio estéreis. 
- Papel, barbante, algodão cardado, gaze. 
 
PRÁTICA PARA EXECUTAR 
 
A. Apresentação da vidraria e outros objetos de uso freqüente nos laboratórios de Microbiologia. 
B. Demonstração, pelo professor, de uma cadeia de assepsia nos trabalhos microbiológicos. 
C. Cada grupo de alunos treinar, com água peptonada, as técnicas de distribuição asséptica, usando 
pipetas. Deixar os tubos em temperatura ambiente por no mínimo 48 horas. 
D. Expor placas de Ágar simples (1 por grupo) ao ar por diferentes espaços de tempo. Deixar à 
temperatura ambiente o mínimo de 48 horas. 
E. Evidenciar bactérias da pele, roupa, bancada em meio Ágar simples. 
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F. Montagem de vários materiais (tubos, placas, pipetas) para esterilização. 
 
RESULTADOS E OBSERVAÇÕES 
 
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 ASSUNTO 
- Meios de Cultura 
- Técnicas de Semeadura 
 
OBJETIVOS 
 
1- Explanação sobre os principais meios de cultura empregados em laboratórios de 
Microbiologia 
2- Identificação das técnicas de semeadura mais empregadas na rotina bacteriológica 
3- Cultivo de bactérias com finalidade de obtenção de cultura pura, ou seja, uma população 
onde todas as bactérias se originam de uma única célula bacteriana. 
 
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 
 
Meios de cultura 
 
 O estudo das bactérias necessita normalmente do seu prévio isolamento e identificação. 
Para tanto diversos meios de cultura são utilizados. Define-se meio de cultura como uma mistura de 
nutrientes, incluindo fontes de carbono, nitrogênio, sais minerais e água, que propiciam o 
crescimento in vitro de bactérias. 
A maioria das bactérias cresce em meios de cultura. Exceções são as riquétsias e clamídias 
que por serem parasitas intracelulares obrigatórios só se desenvolvem in vitro em meios celulares 
(cultivo celular, ovos embrionados), Mycobaterium leprae e Treponema pallidum. 
A inoculação das bactérias em diferentes meios envolve várias técnicas de semeadura. Toda 
a manipulação de culturas bacterianas, meios e instrumental necessário deve ser feita seguindo-se os 
procedimentos básicos de assepsia e antissepsia, visando evitar qualquer tipo de contaminação. 
 
Classificação dos meios de cultura 
A) Quanto à composição: 
 A.1) Naturais – são aqueles de origem vegetal (um pedaço de batata, pão, frutas) 
ou animal (gema de ovo). 
 A.2) Artificiais – são aqueles constituídos de substâncias químicas podendo ser 
definidos ou indefinidos (complexos). 
 Ä Definidos: é sabido toda a sua composição química. 
 Ä Indefinidos ou Complexos: é desconhecido por si. Sabe-se apenas 
aproximadamente sua composição. Os meios utilizados na rotina são complexos. 
 
B) Quanto ao seu estado físico: 
Ä Líquido – são os caldos, desprovidos de Agar. Utilizados para transporte e para 
bactérias que já sofreram a ação de antimicrobianos. 
Ä Semi-sólido – são aqueles que apresentam em sua composição até 1% de Agar. 
Geralmente utilizados para bactérias microaerófilas. 
Ä Sólido – são aqueles que apresentam em sua composição 1,5 a 2,5% de Agar. 
 
OBS: O Agar é um polissacarídeo extraído de algas, utilizado para solidificar os meios e que é 
escolhido por não reagir com nenhuma bactéria e por ser altamente resistente a variações. 
 
C) Quanto à finalidade e características: 
ÄSimples – contém apenas componentes básicos para o crescimento de uma bactéria. 
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Ä Enriquecido – meio que tem aumentada a sua capacidade nutricional para a 
bactéria pela adição de substâncias como gema de ovo, sangue, plasma, soro, leite. De uso 
freqüente para bactérias de difícil crescimento (fastidiosas). 
ÄDe enriquecimento – meio seletivo que visa inibir o crescimento de bactérias 
acompanhantes e permitir o crescimento da bactéria alvo que se pretende posteriormente 
isolar, aumentando assim a proporção desta em relação às demais. Por ser um meio líquido 
não se destina ao isolamento da bactéria. 
Ä Seletivo – contém substâncias seletivas que inibem o crescimento de certas bactérias 
e permitem o crescimento de outras. São meios sólidos e têm como objetivo isolar culturas 
puras. 
Ä Indicadores – meios que permitem a diferenciação visual do crescimento bacteriano 
facilitando a sua identificação. Freqüentemente os meios seletivos são também indicadores e 
todos os meios utilizados na confirmação bioquímica dos isolamentos são indicadores. A 
indicação mais freqüente é a alteração de cor do meio por mudança no pH do mesmo, 
podendo ainda ser a produção de gás, precipitação de componentes do meio por atividade 
proteolítica e lipolítica das bactérias, etc... 
Ä Estoque – são meios normalmente semi-sólidos com a finalidade de preservar uma 
cultura bacteriana pura para posteriores utilizações no laboratório. 
 
Técnicas de semeadura 
 
 
Procedimento para remover bactérias de um caldo com a alça de platina 
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A finalidade básica das técnicas de semeadura é permitir a transferência (inoculação) de 
bactérias ou de uma cultura bacteriana de um material (secreção, alimento, etc) ou de um meio de 
cultura para outro (s) garantindo que apenas os microrganismos em questão sejam semeados. 
De acordo com o tipo de meio de origem e destino bem como da finalidade específica da 
inoculação, diferentes técnicas são executadas, a saber: 
 
I - Semeadura em meios sólidos 
 
A. Meio Inclinado em tubos (utilizar alça ou agulhas) 
 
o Em estria sinuosa: semear com alça de platina, em ziguezague, partindo da 
base para a extremidade da superfície inclinada do meio. Este tipo de semeadura permite a 
obtenção de intensa massa de microorganismos. 
 
o Em estria reta: semear com agulha de platina, em estria reta, partindo da base 
para a extremidade da superfície inclinada do meio, ou em profundidade e superfície. Este 
tipo de semeadura é utilizado quando se necessita um inoculo pequeno de bactérias, como 
em provas bioquímicas para identificação bacteriana. 
 
 
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Procedimento para inocular um meio Agar inclinado a partir de uma Placa de Petri 
 
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Procedimento para repique de um meio inclinado para outro 
 
 
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B. Meios em pé (camada alta) 
 
o Em picada em profundidade: com agulha de platina perfurar o centro do 
meio, sem movimentos de lateralidade e fazer o inoculo penetrar de 0,5 a 1,0 cm no centro 
do meio de cultura. Este tipo de semeadura é bastante utilizado para conservação de 
bactérias no meio de cultura e quando o meio utilizado é semi-sólido, esta semeadura é 
utilizada para a verificação da motilidade (As bactérias que cresceram somente ao redor do 
pico de semeadura não são móveis). 
 
C. Em Placa de Petri 
 
C.1. Em superfície 
 
o Estrias múltiplas ou esgotamento: faz-se o inóculo num ponto da 
superfície do meio espalhando-se o mesmo por estrias em toda a placa, de modo a 
gradativamente esgotar o material contido no inóculo. Preferencialmente usa-se um 
esquema de divisão da placa em 4 quadrantes sendo que a estria de cada quadrante toca no 
final da estria do quadrante anterior arrastando bactérias deste último. Nesse caso, deve-se 
flambar a alça após a inoculação de cada quadrante. Pode-se também optar por não tocar no 
final da estria do quadrante anterior, não sendo assim necessário flambar a alça após cada 
quadrante. A estria do último quadrante ocupa a maior parte da placa. Alternativamente 
pode-se fazer 3 estrias, a primeira ocupando metade da placa e as outras duas um quarto da 
placa cada. Neste modo as estrias não se tocam. Este tipo de semeadura é empregado para o 
isolamento de colônias bacterianas e obtenção culturas puras. 
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o Por distensão: com pipeta, colocar no centro da superfície do meio 0,1 mL da suspensão e 
espalhar uniformemente com swab ou alça de Drigalski. Com swab, obteremos crescimento 
confluente, para realização de antibiogramas, por exemplo. Com alça de Drigalski, 
utilizamos para obtenção de colônias dispostas de modo regular para contagem. 
 
 
 
C.2. Em profundidade ou disseminação 
 
o Pour plate: depositar na placa de Petri 0,1/ 1,0 mL da suspensão bacteriana. Adicionar 10 
mL do meio fundido (O Agar funde a 85º C) em tubo de ensaio e resfriado a 45-50º C. 
Homogeneizar com movimentos giratórios da placa sobre uma superfície plana.Utilizado 
para isolamento, contagem e identificação bacteriana, conforme o meio de cultura utilizado. 
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 Pour Plate 
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Inoculação na Placa de Petri 
 
 
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D. Repique por pescaria: colônia em placa de Petri retirada através de uma agulha para um meio de 
cultura líquido ou sólido. Método empregado para isolamento bacteriano. 
 
 II. Semeadura em meios líquidos 
 
o Difusão: com alça de platina ou pipeta, introduzir o inoculo (> 0,1 mL) na massa do meio, 
esfregando contra o interior do tubo na área exposta pela inclinação do mesmo em 30º. 
Após se recolocar o tubo na posição vertical, as bactérias inoculadas se difundem para o 
meio. Este tipo de semeadura é empregado para obtenção do crescimento bacteriano (o 
meio fica turvo se houve crescimento). É um repique normal. 
 
MATERIAL 
 
- Tubos de ensaio com caldo simples, Agar simples e Agar semi-sólido. 
- Placas de Petri com Agar simples. 
- Culturas bacterianas em caldo simples, Agar simples (em placa de Petri). 
- Alça e agulha de platina. 
 
PRÁTICA PARA EXECUTAR 
 
§ Definir meio de cultura, cultivo e condições necessárias ao crescimento de 
microorganismos (pH, pressão osmótica, temperatura de incubação, etc.). 
§ Classificação dos meios de cultura quanto à origem, estado físico, força seletiva. 
§ Seqüência da preparação dos meios. 
 
RESULTADOS E OBSERVAÇÕES 
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 ASSUNTO 
 - Bactérias no Ambiente 
 
OBJETIVOS 
Após a realização da atividade prática você deverá ser capaz de constatar a presença de 
bactérias no ambiente; compreender a importância dos critérios básicos de higiene na produção e 
manipulação de alimentos, visando evitar a contaminação dos mesmos por bactérias ambientais. 
 
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 
A presença de bactérias pode ser verificada em quase todos os ambientes, no solo, na água, no 
ar e colonizando o nosso corpo (ex: trato gastrointestinal, pele). Freqüentemente tais bactérias não 
estão associadas a nenhum prejuízo. 
Amicrobiota intestinal desempenha importante papel na defesa do organismo contra certas 
infecções; existem estudos que sugerem que a microbiota normal estimula o desenvolvimento das 
defesas imunológicas. Ao mesmo tempo em que desenvolve atividades benéficas, a microbiota pode 
ser responsável por uma série de doenças oportunistas que podem ser relacionadas, por exemplo, ao 
uso constante de drogas imunossupressoras, antibióticos e internações em UTI. 
Muitas infecções causadas por bactérias são adquiridas por contato direto ou veiculadas por 
alimentos. Ao contrário do que se pensava antigamente, a disseminação de bactérias patogênicas 
pelo ar e poeira não ocorre com grande freqüência, pois de um modo geral, não sobrevivem por 
longos períodos no ambiente externo. Entretanto, estas vias de transmissão podem ser de grande 
importância em determinadas situações. No caso de bactérias esporuladas a transmissão aérea é 
mais importante. Os alimentos são uma importante via de transmissão de doenças bacterianas como 
a shigelose e a salmonellose. 
MATERIAL 
- 01 placa com Agar simples divididas em 4 quadrantes 
- 01 placa com Agar simples 
- 01 swab estéril 
 
PRÁTICA PARA EXECUTAR 
 
A) Inocular em cada quadrante, respectivamente: 
- a impressão do dedo polegar 
- um “carimbo” do tecido do jaleco 
- alguns fios de cabelo 
- um swab previamente passado sobre a bancada de trabalho 
Incubar a 37o C por 24 horas 
Analisar o crescimento obtido 
 
B) Abrir as placas, fora da área de segurança, deixando cada uma por 5’, 10’, 15’ e 20’, fechando 
quando atingido o tempo respectivo. Incubar a 37o C por 24 horas e analisar o crescimento obtido. 
 
 
 
 
5 min 10 min 15 min 20 min 
 1.º 
 DEDO 
 2.º 
JALECO 
 3.º 
BANCADA 
 4.º 
CABELO 
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RESULTADOS E OBSERVAÇÕES 
 
 
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ASSUNTO 
- Esterilização e Desinfecção 
- Ação dos Agentes Físicos e Químicos sobre as Bactérias 
 
OBJETIVOS 
 
1. Verificar a eficiência de agente químico sobre as bactérias 
2. Verificar a eficiência de agente físico sobre as bactérias 
 
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 
 
As taxas de crescimento e morte microbianas são fortemente influenciadas por vários 
fatores ambientais. O controle microbiano compreende uma série de procedimentos com a 
finalidade de reduzir a quantidade, eliminar, diminuir ou impedir a multiplicação de 
microrganismos existentes em um determinado equipamento, ambiente, em alimentos ou em 
superfícies vivas. É de extrema importância apresentando inúmeras aplicações práticas na área 
médica. 
É importante inicialmente definir alguns termos utilizados no controle microbiológico: 
A) Desinfecção – redução do número de microrganismos em superfícies inanimadas (ambiente ou 
materiais) e conseqüente eliminação de sua potencialidade infecciosa. 
B) Sanitização – mesmo significado de desinfecção, porém utilizado rotineiramente em indústria de 
alimentos. 
C) Antissepsia – redução do número de microrganismos em tecidos vivos. 
D) Esterilização – destruição ou remoção completa dos microrganismos em ambientes ou materiais. 
E) Assepsia – Ausência de microrganismos. As técnicas assépticas representam uma série de 
cuidados que previnem a contaminação. 
 
O controle de microrganismos pode ser feito por agentes físicos ou químicos. 
 
Controle Microbiano por Agentes Físicos 
 
o Calor 
 
 É o método mais empregado para destruição de microrganismos por ser barato, eficaz e 
prático. Quando se tem finalidade esterilizante deve ser calculado para a destruição das formas 
esporuladas de bactérias, mais resistentes. Pode ser utilizado na forma de calor seco ou calor úmido 
em função da presença de água. O primeiro mata as bactérias por oxidação protéica enquanto o 
segundo por desnaturação protéica. Além disso, o calor úmido é um método de maior eficiência 
devido à água ser um melhor condutor de calor do que o ar. 
 
Ä Calor Seco: na ausência de água 
- Flambagem: contato direto do material a ser tratado com o fogo. É um tipo de esterilização. 
- Forno ou Estufa: material submetido a uma temperatura de 170 a 180o C por 1 - 2 horas. É 
um tipo de esterilização, porém não é qualquer material que pode ser submetido a esse tratamento. 
Utilizado principalmente para vidraria e metais (instrumentos cirúrgicos p. ex.). 
- Incineração: é a queima total de um material. Método utilizado com materiais descartáveis, 
principalmente aqueles materiais hospitalares. 
 
 Ä Calor Úmido: na presença de água (ou vapor d’água) 
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- < 100o C: pasteurização (método desinfetante). Muito utilizado para alimentos e bebidas. A 
pasteurização rápida do leite emprega uma temperatura em torno de 72o C por 15 a 20 segundos, 
seguida de resfriamento rápido. A pasteurização consegue eliminar cerca de 99,5% de 
microrganismos, porém aqueles esporulados são termoresistentes, conseguindo resistir a esse 
tratamento. 
- = 100o C: fervura (método desinfetante). O alimento é submetido a uma temperatura igual a 
100o C por até 15 minutos. Eficiente contra as formas vegetativas bacterianas, mas não destrói 
completamente as formas esporuladas. 
- > 100o C: autoclavação (método esterilizante). Os materiais e alimentos são submetidos a 
uma temperatura em torno de 121o C por 15-30 minutos, um tempo e temperatura bem inferiores 
àqueles empregados em calor seco. Isso é possível pelo emprego de alta pressão interna (1 ATM) na 
autoclave. A autoclave é similar a uma panela de pressão. 
 
o Radiação 
 
ÄUltravioleta (radiação não ionizante): Possui uma atividade máxima num comprimento de 
onda de 260nm. Geralmente são desinfetantes e usados em ambientes. 
- Limitação: não tem poder de penetração, tudo que estiver embalado ou protegido por vidro não 
é desinfetado. Após umas 200 horas de uso da lämpada sua eficiência é diminuída. 
- Por que mata? Ela penetra nos microrganismos e é captada pelos seus cromossomos, causando 
mutação letal por ser absorvida diretamente. 
 
 ÄRadiação Gama (radiação ionizante): É um método de esterilização mais energético que as 
radiações UV, com menor comprimento de onda e desequilibra quimicamente as células 
irradiadas. Todos os seus componentes químicos podem ser alterados. Muito utilizado para 
esterilização de produtos hospitalares descartáveis. 
 
o Filtração 
 
Método utilizado principalmente para materiais líquidos, que são alterados pelo calor. 
 
Ä Clarificantes: são os filtros domésticos, retém as impurezas grosseiras, são desinfetantes. 
 
 Ä Esterilizantes: possuem poros iguais ou menores a 1mm podendo reter inclusive alguns 
vírus. 
 
o Outros 
 
Ä Pressão Osmótica (Salga); Dessecação;Uso de baixas temperaturas (refrigeração, 
congelamento). 
 
Controle Microbiano por Agentes Químicos 
 
o Fenóis e derivados 
 
 É um desinfetante fraco, porém utilizado como um desinfetante de referência para ser 
comparado com outros produtos. 
® Atuação: fenóis/cresóis – desnaturam proteínas. 
OBS: Dos cresóis o mais importante é a creolina, utilizada para pisos e sanitários. O hexaclorofeno é muito 
usado na antissepsia cirúrgica. 
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o Álcool Etílico 
 
Possui vários mecanismos de ação, sendo relativamente eficiente. São solventes de lipídios (ação 
detergente), desidratantes (retiram a água das células) e desnaturam proteínas. O álcool etílico pode ser usado 
como desinfetante ou anti-séptico. O álcool absoluto (não hidratado) é fraco germicida. Um álcool 
parcialmente hidratado (60- 70%) é mais ativo que o absoluto, pelo maior poder de penetração e conseqüente 
desnaturação protéica mais rápida. 
 
o Cloro / Iodo (Halogênios) 
- O Cloro é desinfetante de águas, alimentos e pisos. Mecanismo de ação é oxidação. 
- O mecanismo de ação do Iodo é a sua combinação irreversível com proteínas através da 
interação com aminoácidos aromáticos, fenilalanina e tirosina, levando à desnaturação das 
mesmas. É um dos anti-sépticos mais utilizados na prática cirúrgica. 
 
o Detergentes catiônicos (agentes de superfície) 
 Alteram a permeabilidade de membrana (ex: compostos quaternários de amônioÞ cloreto de 
benzalcônio). Mais ativo contra Gram negativos. 
 
o Sais de Metais Pesados 
- Mercúrio (Hg): anti-séptico. Em desuso pelo risco de intoxicação por absorção. 
- Sulfato de Cobre (CuSO4): desinfetante para águas de recreação. 
- Nitrato de Prata (AgNO3): anti-séptico. É altamente eficiente contra gonococos, que causam 
oftalmia em recém-nascidos. 
® Atuação: afinidade por proteínas, inativando enzimas, por isso é importante não ingeri-los. 
Uso tópico apenas. 
 
o Ácidos orgânicos e inorgânicos 
 Freqüentemente usados na conservação de alimentos. Ex: ácidos acético, lático, benzóico. 
 
o Álcalis 
- Hidróxido de Sódio (NaOH) = presente nos sabões conferindo a estes a sua relativa ação 
anti-séptica. 
 - Outros: KOH, Ca (OH)2 
 
o Corantes Básicos 
 Mais eficientes contra Gram positivos. Ex: Cristal Violeta, Azul de Metileno. 
 
o Oxidantes e Redutores 
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 A célula microbiana está em equilíbrio, oxidantes e redutores rompem esse equilíbrio, 
matando a célula. 
 - Oxidantes: oxidam componentes celulares levando à morte das células. Ex: Ozônio (O3), água 
oxigenada (H2O2), permanganato de potássio, peróxido de zinco. Usados como anti-sépticos. 
- Redutores: reduzem compostos celulares levando à morte das células. 
Þ Aldeídos e derivados: 
- Formaldeído/ formalina: muito irritante, São usados para desinfetar paredes e pisos. 
-Glutaraldeído: mais ativo e menos tóxico que o formaldeído. Esporocida após 6 horas de 
contato. 
Þ Óxido de Etileno (gás): 
 É um agente alquilante, inativando proteínas e ácido nucléico. Usado em um recipiente 
fechado que recebe todo material a ser utilizado (contém algumas ampolas de óxido de etileno – 
líquido), à temperatura de 52o C, este líquido torna-se gasoso, assim, seus vapores são esterilizantes. 
Usado para esterilização de materiais de borracha ou plástico. 
 
o Antimicrobianos 
 Ao contrário dos anteriores possuem ação seletiva contra microrganismos por isso não serão 
discutidos neste assunto. 
 
MATERIAL 
 
- Placas de Petri com Agar simples ou caldo simples 
- Culturas de E. coli e Bacillus sp 
- Soluções antissépticas 
- Gaze 
- Tripé, tela de amianto e panela. 
 
Prática para executar 
 
a. Definição de alguns termos utilizados no controle da população microbiana: 
- Agente antimicrobiano, assepsia, asséptico, antissepsia, bactericida, bacteriostático, 
desinfecção, esterilização, germicida, saneador, sanitização. 
- Agentes físicos: radiações, calor, filtração. 
- Agentes químicos 
 
b. Atividade antisséptica do sabão, álcool e álcool iodado: 
 
- Observação de existência de bactérias na superfície do dedo: 
 
1. Pegar uma placa de Agar simples e fazer a semeadura utilizando a ponta do polegar (fazer a 
impressão digital suavemente para não ferir a camada do meio de cultura). 
2. Em seguida, lavar o dedo com sabão. 
3. Após 1 minuto, fazer a impressão digital no 2º quadrante da placa. 
4. Repita a operação com os demais antissépticos (álcool e álcool iodado) 
5. Incubar a placa a 37º C por 24 horas. 
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c. Atividade do agente físico: calor 
 
1. Cultura de E. coli em caldo. Para o primeiro inóculo, marcar t = zero, colocar o tubo em 
água fervente por 5, 10 e 20 minutos. 
2. Após cada intervalo de tempo retirar um inóculo marcando t5, t10,e t20. Incubar a 37º C 
por 24 horas. 
3. Repetir a técnica com a cultura de Bacillus sp. 
 
 
 
d. Atividade de diferentes agentes químicos: 
 
1.Semear uma cultura bacteriana com swab (para crescimento confluente) em uma placa de 
Petri com Agar simples. 
2.Assepticamente, com pinça, embeber discos de papel de filtro com diferentes agentes 
químicos. 
3. Colocar os discos eqüidistantes na placa semeada. 
4. Incubar a 37º C por 24 horas. 
5. Leitura e interpretação dos dados obtidos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
B A 
C D 
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RESULTADOS E OBSERVAÇÕES 
 
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ASSUNTO 
- Diluição 
- Contagem de u.f.c.viáveis 
- Obtenção de Cultura Pura 
 
OBJETIVOS 
 
1. Metodologia de Diluições 
2. Plaqueamento para contagem de u.f.c. viáveis 
3. Contagem de u.f.c. viáveis 
4. Obtenção de cultura pura 
 
MATERIAL 
 
- Tubos com 9mL de salina 
- Placas de Petri com Agar simples 
- Alças de Drigalski 
- Cubas com álcool 70º 
- Agar inclinado 
- Caldo simples 
- Cultura bacteriana em caldo 
- Pipetas de 1mL 
 
PRÁTICA PARA EXECUTAR 
 
a. Diluição (É necessária para diminuir o número de bactérias no inóculo, facilitando a contagem) 
 A partir da cultura bacteriana, inocular 1mL do caldo em 9mL de salina (que deve estar morna), 
homogeneizar, retirar 1mL e transferir para outro tubo com 9mL de salina... 
 Obtendo assim, as diluições 1/10, 1/100, 1/1000... 
 
b. De cada diluição inocular 0,1mL na superfície do meio de Agar simples. Semear por distensão 
com alça de Drigalski. Incubar a 37ºC por 24 horas. 
 
c. Contagem da u.f.c. com diluição nº placa 1 + nº placa 2 aplicar na fórmula: 
 2 
 
 u.f.c. = nº encontrado x inverso da diluição x inverso do inoculod. Repicar u.f.c. para Agar inclinado e caldo simples. 
 
 25
RESULTADOS E OBSERVAÇÕES 
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 26
ASSUNTO 
- Coloração de Gram 
 
OBJETIVOS 
 
1. Observar e interpretar o mecanismo de reação de Gram como um método de coloração 
diferencial. 
2. Discutir as várias etapas da metodologia e a importância taxonômica do método na Bacteriologia. 
 
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 
 
O método de coloração de Gram é o mais utilizado em Bacteriologia e permite a 
diferenciação da maioria das bactérias em 2 grupos pelas diferenças marcantes na parede celular 
que apresentam. Com base nessas diferenças de parede celular os corantes utilizados coram as 
bactérias Gram-positivas em roxo e as Gram-negativas em vermelho. 
O método de Gram é utilizado na maioria das infecções bacterianas, permitindo o 
diagnóstico de algumas delas com bastante segurança. Porém não se aplica para micoplasmas, 
bactérias desprovidas de parede, micobactérias pela presença de muitos lipídios insolúveis na 
parede e espiroquetas pela estrutura muito delgada e pouco permeável aos corantes. 
A coloração pelo método de Gram é chamada de coloração diferencial porque são utilizados 
dois corantes e as bactérias ficam coradas em tonalidades diferentes. Isso é possível devido à 
composição da parede celular das mesmas. 
Bactérias Gram-negativas possuem uma parede composta de várias camadas que diferem na 
sua composição química e, conseqüentemente, são mais complexas. O arranjo dessa parede é dado 
por uma fina camada de peptidoglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta por 
lipoproteínas, fosfolipídeos, proteínas e lipopolissacarídeos (membrana externa). 
As bactérias Gram-positivas possuem parede celular mais espessa em comparação às Gram-
negativas, apesar disso, apresenta predominantemente um único tipo de macromolécula, uma 
espessa camada de peptidoglicano (representando aproximadamente 90%) e ácido tecóico. 
Essas bactérias podem ser aeróbias, anaeróbias facultativas e anaeróbias. Possuem a forma 
de cocos, bacilos ou víbrios (bacilos encurvados). Muitas são patogênicas e outras, membros da 
microbiota normal. 
A maioria dos cocos é Gram-positiva, com exceção dos gêneros Neisseria e Veillonella que 
são os únicos Gram-negativos; entre os bacilos Gram-positivos incluem-se aqueles pertencentes aos 
gêneros Corynebacterium, Listeria, Bacillus, Lactobacillus e Clostridium; os demais bacilos são 
Gram-negativos (a maioria); os víbrios são Gram-negativos. 
A investigação das características morfológicas e de coloração (morfo-tintoriais) das 
bactérias é a etapa inicial de grande importância no isolamento e identificação de bactérias de 
material clínico. No entanto, a identificação completa de uma bactéria sempre necessitará de dados 
fisiológicos ou genéticos da mesma. 
O mecanismo da coloração de Gram se refere à composição da parede celular. Durante o 
processo de coloração, o tratamento com álcool (ou álcool-acetona) extrai os lipídeos, daí 
resultando uma porosidade ou permeabilidade aumentada da parede celular das Gram negativas 
Assim, o complexo cristal violeta-iodo (CV-I) pode ser retirado e as Gram negativas são 
descoradas. A parede celular das bactérias Gram positivas, em virtude de sua composição diferente, 
torna-se desidratada durante o tratamento com álcool, a porosidade diminui, a permeabilidade é 
reduzida e o complexo CV-I não pode ser extraído. 
Outra explicação baseia-se também em diferenças de permeabilidade entre os dois grupos 
de bactérias. Nas bactérias G+, o complexo CV-I é retido na parede após o tratamento pelo álcool, o 
que causa, provavelmente, uma diminuição do diâmetro dos poros da camada de glicopeptídeo ou 
 27
peptideoglicano da parede celular. Os poros da parede das bactérias G- permanecem suficientemente 
grandes, mesmo depois do tratamento pelo álcool, possibilitando a extração do complexo CV-I. 
Segundo o autor Trabulsi, na etapa diferencial com álcool, as bactérias G- devido à pequena 
espessura da camada basal e às descontinuidades existentes nesta camada, em pontos de aderência 
entre a membrana externa e a membrana celular, têm o complexo corado extraído pelo álcool que 
deixa as células descoradas. 
 
O preparo e a fixação do esfregaço 
 
 a) Preparo das lâminas 
 
As lâminas novas oferecem maior garantia para a confecção de boas preparações coradas, 
não obstante as mesmas possam ser recuperadas depois de usadas. O processo de limpeza e 
esterilização dessas lâminas implica numa série de medidas que passaremos a enumerar: lavar com 
água e sabão, mergulhar em solução detergente e deixar em ebulição por cerca de 1 a 2 horas, lavar 
novamente em água corrente, escorrer e rinsar com água destilada, escorrer e secar. As lâminas 
devem ser colocadas em frascos fechados contendo álcool. 
 
As preparações coradas são feitas em 3 etapas: 
1º esfregaço 
2º fixação 
3º coloração 
 
b) Esfregaço 
 
- Tirar do frasco uma lâmina esterilizada e enxugar bem 
- Flambar, rapidamente, nos dois lados da lâmina 
- Flambar a alça de platina ao rubro e deixá-la esfriar próximo à chama 
- Tomar o tubo de cultura (em caldo) com a mão esquerda e com os dedos médio e anular da mão 
direita remover o tampão de algodão da boca do tubo 
-Flambar a boca do tubo de cultura 
- A alça de platina, segura entre o polegar e o indicador da mão direita, será introduzida no interior 
do tubo até tocar no meio de cultura 
- Flambar novamente a boca do tubo 
- Fechar o tubo com o tampão de algodão e colocá-lo na estante 
- Tomar a lâmina com a mão esquerda e depositar no centro da mesma uma gotícula (uma alçada) 
da suspensão bacteriana 
- Com movimentos de rotação da alça de platina, o material deve ser bem espalhado a fim de se 
obter um esfregaço de forma oval, bem fino e uniforme 
- Deixar secar ao ar e marcar com lápis dermatográfico do lado oposto onde se situa a preparação 
 
Em se tratando de material de cultura em meio sólido, deve ser observado o seguinte: 
- Depositar uma pequena gota de água destilada ou solução fisiológica estéril no centro da lâmina 
- Tocar a colônia com uma agulha de platina esterilizada e suspender a mesma na gotícula d’água, 
de forma a obter um esfregaço fino e uniforme 
 
c) Fixação do material 
 
A fixação evita que o material se desprenda no decurso das manipulações posteriores. Pode ser feita 
por: 
 
 28
# Agentes Físicos (calor) – consiste em passar a lâmina, com a face onde se acha o esfregaço para 
cima, na chama do bico de Bunsen 2 a 3 vezes rapidamente 
 
# Agentes Químicos – utiliza-se uma substância química como álcool metílico, álcool etílico, 
álcool-acetona, éter-acetona, formol etc., deixando-se em contato com os esfregaços dessecados 
durante alguns minutos (2 a 10 minutos). O fixadorpode ser posto sobre o esfregaço 
convenientemente protegido contra a evaporação rápida, ou então o preparado será mergulhado no 
fixador contido em recipientes apropriados. 
 
 
MATERIAL 
 
- Lâminas 
- Culturas em meios líquido e sólido 
- Alça e agulha de platina 
- Cristal violeta 
- Lugol 
- Álcool etílico 
- Fucsina de Ziehl. 
 
Soluções reagentes 
 
1. Cristal violeta: 
- Cristal violeta 1,0g 
- Álcool a 95° 10mL 
- Água 100mL 
 
2. Lugol: 
- Iodo 1,0g 
- Iodeto de potássio 10mL 
- Água 300mL 
 
3. Fucsina: 
- Fucsina básica 0,3g 
- Fenol 5,0g 
- Álcool a 95° 10mL 
- Água 100mL 
 
4. Álcool-acetona proporção 1:1. 
 
PRÁTICA PARA EXECUTAR 
 
COLORAÇÃO DE GRAM (MÉTODO CLÁSSICO) 
 
a. Preparar um esfregaço fino, secar a temperatura ambiente e fixar pelo calor. 
b. Cobrir o esfregaço seco e fixado com a solução de cristal violeta (corante) durante 1 minuto. 
c. Esgotar a lâmina e cobrir com lugol (mordente) durante 1 minuto. O Lugol fixa as moléculas do 
corante às proteínas citoplasmáticas, formando compostos estáveis. 
d. Inclinar a lâmina 45° e lavar em água corrente. 
e. Mantendo-a inclinada, diferenciar (lavar) com álcool 95° GL (diferenciador). 
 29
f. Lavar e depois cobrir a preparação com solução diluída de fucsina de Ziehl (contra-corante) (15 a 
30 segundos). 
g. Lavar e secar entre duas fitas de papel de filtro, delicadamente. 
h. Colocar uma gota de óleo de cedro no centro do esfregaço. 
i. Observar com a objetiva de imersão. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Vi Lulu Ali A Fumar Algo 
 Cristal Lugol Álcool Água Fucsina Água 
 Violeta 
 
 30
 
 
 
Mudanças de coloração que ocorrem em cada passo do Método de Gram. 
 
NOTAS 
 
1. O etanol poderá ser usado como agente descorante fraco. 
2. O material dos corantes empregados na técnica, principalmente sedimento do cristal violeta 
poderá aparecer como artefato. 
3. O descoramento para mais ou para menos é resultante de incorreta diferenciação pelo álcool. 
4. A idade da cultura bacteriana tem importância fundamental na coloração de Gram. Em culturas 
envelhecidas, células Gram-positivas freqüentemente se tornam Gram-negativas. Enzimas líticas 
excretadas normalmente por culturas envelhecidas podem causar danos à membrana da célula, 
como, por exemplo, alterando a permeabilidade dos solventes. Conseqüentemente, o complexo 
iodo-cristal violeta poderá ser retirado da célula. 
5. Se houver um questionamento acerca da Gram-positividade ou Gram-negatividade da cultura, 
uma coloração de Gram paralela é aconselhável. Para isto, deve-se usar culturas bacterianas 
conhecidas como G+ (Staphylococcus aureus) e G- (Escherichia coli) como controle. 
 
 INTERPRETAÇÃO 
 
Bactérias G+ coradas em roxo. 
Bactérias G- coradas em vermelho. 
 
 31
 
 
RESULTADOS E OBSERVAÇÕES 
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 32
ASSUNTO 
- Cocos Gram-positivos 
 
OBJETIVOS: 
 
1. Isolamento de bactérias das vias aéreas superiores. 
2. Identificação bioquímica através da interpretação do metabolismo microbiano. 
 
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 
 
Identificação das bactérias de importância médica 
 
Þ Material de colheita: secreções, líquidos biológicos e outros. 
 
Cocos Gram positivos aeróbios 
 
I. Staphylococcus 
 
 
http://de.wikipedia.org/wiki/Staphylokokken 
 
Este gênero, membro da família Micrococcaceae, é constituído de várias espécies, sendo 5 as 
de maior interesse em Veterinária (S. aureus, S. intermedius, S. epidermidis, S. hycius e S. 
schleiferi) . São microorganismos esféricos, imóveis, gram positivos, que crescem em 
agrupamentos semelhantes a cachos de uva, devido aos seus arranjos irregulares. São membros 
normais da microbiota anfibiôntica da pele e membranas mucosas de mamíferos e aves, sendo 
encontrados principalmente na mucosa da nasofaringe. 
Causam diferentes doenças supurativas tais como: furúnculo, impetigo, osteomielite, abcessos 
de tecidos, pneumonia, meningite, artrite purulenta, etc. Algumas amostras (S. aureus) produzem 
uma “enterotoxina” que provoca um quadro agudo de intoxicação alimentar, enquanto outros (S. 
aureus e S. saprophyticcus) causam infecções do trato urinário. 
 
Espécies de importância veterinária 
 
Þ S. aureus (coagulase +) – Agente piogênico comum em diferentes espécies animais. 
Recebe esse nome, pois pigmentos carotenóides na membrana celular podem conferir 
coloração “áurea” (latim – aureus) às colônias. 
 33
OBS: Coagulase + são os Staphylococcus com potencial patogênico. Estes crescem melhor em 
condições de restrição de ferro, se comparados aos coagulase -, com menor potencial patogênico. 
Þ S. intermedius (coagulase +) – Mais freqüente em cães, estando envolvida na piodermite 
canina (inflamação cutânea piogênica). Pode causar também urolitíase de cães (pela urease) 
Þ S. epidermidis (coagulase -) – Encontrado na pele e em algumas membranas mucosas. 
Raramente é patogênico. 
Þ S. hycius – Causa epidermite exsudativa em suínos. É a chamada Doença do porco gordo, 
que acomete suínos jovens, é sistêmica e rapidamente fatal. As lesões cutâneas 
caracterizam-se pela presença de um exsudato espesso, cinza acastanhado, especialmente ao 
redor das faces e das orelhas. 
Þ S. schleiferi subespécie coagulans – Está associado a otite externa em cães. 
 
 Grande parte das infecções de animais é provavelmente endógena, isto é, provocada por uma 
cepa residente. 
Supuração e formação de abcesso (lesão típica) são um modelo predominante da patogenia. 
A estafilococose em perus é uma bacteremia que se localiza em articulações e bainhas 
tendinosas. 
Piemia em cordeiros decorre de inoculação cutânea de S. aureus por picada de carrapato. 
 
A colheita do material deve ser realizada com o máximo de assepsia: swab de nasofaringe, 
fezes, urina. Em se tratando de sangue, este deverá ser colhido com heparina, ou ser desfibrinado, 
nunca utilizar citrato de sódio, pois o sódio inibe G+, principalmente em pH próximo a 6. 
 
Características do crescimento 
 
São bactérias anaeróbias facultativas, de fácil crescimento. Crescem dentro de 12hs em meio 
de Agar Simples, Agar Sangue e Chapman. Suas colônias são redondas, lisas, elevadas, opacas, de 
coloração amarelo-dourado a branco e com mais de 1mm de diâmetro no Agar. Crescem em 
presença de altas concentrações de NaCl, sendo este um fator de estimulação da produção da 
enzima coagulase. São inibidos pela presença de corantes dos tipos Azul de Metilenoe Violeta de 
Genciana. 
O meio Chapman é seletivo, porque contém 7,5% de NaCl; é indicador porque possui manitol 
e o indicador Vermelho de Fenol, as UFCs fermentadoras do manitol apresentam-se com coloração 
amarelas após 24 – 48 horas de incubação a 37ºC. Após o crescimento de colônias típicas fazemos a 
coloração de Gram para observarmos a presença de cocos Gram + dispostos em grupos (cachos) ou 
isolados. 
 
Diferenciamos o gênero Staphylococcus do gênero Streptococcus através da prova da 
catalase. A diferenciação das espécies do gênero se dá através das provas de fermentação do 
manitol, da coagulase, da DNAse, da sensibilidade a novobiocina e da redução de nitratos. 
 
Provas bioquímicas 
 
- Prova da Catalase: 
 
A catalase é uma enzima responsável pela neutralização de formas tóxicas do oxigênio ao 
microorganismo (peróxidos e superóxidos). 
Na prova, é utilizado o peróxido de hidrogênio (H2O2 a 30%). Se o microorganismo produzir 
catalase, o H2O2 (água oxigenada) será degradado em H2O e ½ O2 (oxigênio molecular). A reação é 
observada através do desprendimento de bolhas gasosas (O2) da cultura. Na ausência da catalase, 
não há decomposição do peróxido. 
 34
A prova pode ser realizada com o microorganismo obtido em qualquer meio de cultura, 
exceto meios com sangue, pois este possui catalase, levando a resultados falso-positivos. 
 
 
http://medinfo.ufl.edu/year2/mmid/bms5300/bugs/stapaure.html 
 
- Fermentação do Manitol: 
 
O manitol é um açúcar que alguns microorganismos são capazes de utilizar como fonte de 
energia, a través da fermentação. A prova se baseia na alteração do pH do meio, graças à produção 
de ácidos durante o processo de fermentação. Essa mudança de pH pode ser observada pela viragem 
de cor do meio devido à presença do indicador de pH Vermelho de Fenol. A prova pode ser 
realizada em meios de cultura líquidos ou sólidos. Após a semeadura, o meio deve ser incubado a 
37ºC por 18 – 24 horas. 
 
Interpretação: 
Positivo: meio amarelo 
Negativo: não há alteração da cor do meio. 
 35
 
pathmicro.med.sc.edu/fox/Mannitol.jpg 
 
- Prova da coagulase: 
 
 A coagulase estafilocócica se apresenta em duas formas: coagulase ligada e coagulase livre. 
A coagulase ligada, presente na parede da célula bacteriana, converte o fibrinogênio em 
fibrina diretamente, sem o envolvimento dos fatores de coagulação, e pode ser detectado em teste 
direto em lâmina, utilizando-se da suspensão de Staphylococcus acrescida de 2 gotas de plasma 
citratado, fazendo movimentos circulares e observando-se a formação de coágulo no tempo de 1-2 
minutos. Pode-se tornar mais sensível o teste em tubo, por este detectar tanto a coagulase livre 
quanto a ligada, sendo a prova de escolha. 
A coagulase livre é produzida e liberada pelo microorganismo, reagindo com o fator de 
coagulação do plasma, o CRF, formando uma substância semelhante, mas não idêntica, à trombina, 
que converte fibrinogênio em fibrina. Para o teste, utiliza-se plasma citratado humano ou de coelho, 
estéril, diluído em solução salina na proporção de 1:5. A reação ocorre volume a volume a 37ºC. 
Estudos recentes demonstraram que a produção da enzima coagulase se intensifica quando o 
microorganismo é crescido em meio contendo alta concentração de NaCl. Desta forma, aconselha-
se a utilização de colônias para a prova, crescidas em Agar Manitol Salgado contendo NaCl e 
Vermelho de Fenol. Este procedimento aumentaria a sensibilidade do teste. 
A prova consiste da semeadura de uma alçada do microorganismo em estudo em tubo 
contendo o plasma diluído e incubação a 37ºC. A menor coagulação é considerada positiva. Devem 
ser feitas leituras periódicas a cada 2 horas, por até 24 horas, pois algumas espécies produzem 
fibrinogênio, que dissolve o coágulo formado. 
Aconselha-se também utilizar sempre um teste positivo com uma amostra de S. aureus. 
 36
 
http://www.aic.cuhk.edu.hk/web8/staphylococci.htm 
 
- Prova da DNAse: 
 
Alguns microorganismos são capazes de utilizar o DNA presente no meio como fonte de 
energia, através da produção da enzima DNAse. 
No meio com DNA deve ser feita uma estria simples (reta) ou um spot (ponto de semeadura) 
central com o microorganismo em estudo. Incubar a 37ºC por 24 horas e adicionar ao meio HCl 1N 
e aguardar a turvação do meio. 
Lembrando que o DNA é material protéico e que o HCl, como ácido, tem poder desnaturante 
sobre as proteínas, a turvação do meio é apenas a precipitação do DNA desnaturado. Se a bactéria 
produzir DNAse, todo o DNA ao seu redor terá sido degradado, então ao adicionar o HCL não 
haverá turvação nesta área. Portanto, se houver um halo claro ao redor do crescimento bacteriano, o 
resultado é positivo. 
 
- Sensibilidade a Novobiocina: 
 
Semear o microorganismo suspeito em placa de Agar simples ou Mueller Hinton com swab, 
para obtenção de crescimento confluente, e adicionar o disco de novobiocina (5g/ml). Incubar a 
37ºC por 24 horas. As bactérias resistentes não apresentarão halo de inibição, enquanto as sensíveis 
sim. 
 
 
 
 
 
 37
Interpretação das provas bioquímicas 
 
Provas bioquímicas S. aureus S. epidermidis S. sapophyticus 
Catalase + + + 
Fermentação do manitol + - - 
Coagulase +/- - - 
DNAse + - - 
Sensibilidade a novobicina R S R 
Redução de nitratos + - 
 
II. Streptococcus 
 
 
textbookofbacteriology.net/nfStreptococcus 
 
Animais de sangue quente albergam uma flora de Streptococcus nas mucosas dos tratos 
respiratório superior, genital inferior e quase todo o trato digestivo (enterococcus). 
Apresentam-se em forma de cadeia ou em pares, e são Gram positivos. 
Em 1903, Schottmuller propôs que os estreptococos fossem classificados conforme a 
capacidade de lisar hemácias “in vitro”. Em 1919, Brown chamou de alfa, beta e gama as lises 
observadas nas hemácias em placas de Agar sangue. 
Os estreptococos alfa hemolíticos apresentam zonas de hemólise parciais, com hemácias 
integras na parte mais interna (junto à colônia) e hemólise maior na parte mais externa. 
Frequentemente aparece uma coloração esverdeada na área de hemólise (devido a alteração da 
hemoglobina pelo sistema oxi-redutor da célula bacteriana – libera biliverdina e bilirrubina), que 
originou a qualificação “estreptococos do grupo esverdecente” ou Streptococcus viridans. O 
Streptococcus pneumoniae apresenta hemólise alfa e colônia puntiforme com aprofundamento no 
ápice da colônia (parecendo um pequeno vulcão). A maior parte dos Streptococcus comensais de 
animais é alfa hemolítico. 
Os estreptococos beta hemolíticos produzem uma zona de hemólise total, não se observando 
hemácias íntegras (microscópio óptico com objetiva de 10x), ou seja, produzem zonas de 
transparência ao redor de suas colônias. O Streptococcus pyogenes apresenta dois tipos de 
hemolisinas: O e S. A hemolisina O é destruída pela ação do oxigênio atmosférico e, portanto, só 
demonstrada em colônias crescidas em profundidade no Agar Sangue. A hemolisina S é estável ao 
oxigênio do ar e produz hemólise mesmo nas colônias crescidas na superfície do meio de cultura. 
Como cerca de 15% dos Streptococcus apresentam hemolisina O, se torna necessária a semeadura 
do microorganismo pela técnica do pour-plate. A maioria dos tipos patogênicos é beta-hemolítica. 
Os estreptococos gama são anemolíticos, ou seja, não produzem hemólise no meio. A maior 
parte não é patogênica. 
 
 38
Espécies de importância veterinária 
 
 Principais espécies acometidas Principais doenças 
S. pyogenes Roedores, bovinos e humanos. Piodermites, erisipelas, febre 
puerperal, febre reumática, 
glomerulonefrite 
S. agalactie Bovinos de raças leiteiras Mastite* e infecções neonatais 
S. equi Equinos Garrotilha ** 
S. equismilis Suínos, equinos Condições supurativas mistas 
S. zooepidemicus Equinos Problemasgenitais (metrite) e 
neonatais (infecções umbilicais 
disseminadas pela corrente 
sanguínea). Pneumonias 
secundárias. 
S. canis Carnívoros Linfadenite felina, condições 
supurativas mistas em cães e 
gatos. 
S. suis Suínos Infecções neonatais, 
septicemias, pneumonia. 
S. pneumoniae Primatas Pneumonia***, septicemia e 
meningite. 
S. uberis Bovinos Mastite (geralmente mais 
suave). 
 
* A mastite é transmitida por ordenha sem condições higiênicas adequadas. A infecção instala-se na 
glândula mamária pelo canal da teta e a proliferação causa uma inflamação aguda e por fim a 
glândula inteira pode ser perdida. 
 
** Rinofaringite eqüina contagiosa, que se caracteriza por secreção nasal serosa ou purulenta, dor 
local, tosse e anorexia. Desenvolvem-se abscessos nos linfonodos regionais, que tipicamente se 
drenam e rompem em 2 semanas. 
 
*** A evolução é muito aguda em macacos, levando a altas taxas de mortalidade. 
 
 Um Streptococcus beta-hemolítico é responsável por uma forma de septicemia em peixes de 
água doce em aquários. 
 Infecções neonatais comumente originam-se de infecção no trato genital materno. 
 
Características do crescimento 
 
 As exigências de crescimento são mais bem supridas por meios contendo sangue. Produzem 
colônias claras após 12 horas de incubação. São anaeróbios facultativos, catalase negativos. 
Suportam a azida sódica a 0,02%, que é empregada nos meios utilizados para isolá-los. 
 
Cultura (“pour plate”) 
 
Fazer uma suspensão do material colhido em um tubo contendo 1 ml de solução fisiológica 
estéril e adicionar a uma placa de Petri estéril. Juntar o Agar Sangue fundido e resfriado e promover 
a difusão do inóculo no meio através de movimentos circulares. Incubar a 37ºC por 18 horas em 
atmosfera de microaerofilia para melhor rendimento, ou jarra com vela. 
 39
 
Leitura: 
 
Observação do tipo de hemólise em Agar Sangue. 
 
 
 
 
Provas bioquímicas 
 
- Prova da optoquina: 
 
Colocar um disco de optoquina na superfície do Agar Sangue (pode-se incluir no 
antibiograma). Havendo impedimento do crescimento das colônias ao redor do disco de optoquina 
(2 cm de diâmetro), trata-se de teste positivo. 
 
- Bile solubilidade: 
 
A prova é realizada conforme esquema que se segue: 
1. A 1,0 ml de cultura em caldo, adicionar uma gota de vermelho de fenol. 
2. Acertar o pH em aproximadamente 7,5 com NaOH 0,1N (cor rósea) 
3. Adicionar aproximadamente 4 gotas de desoxicolato de sódio ou bílis 
4. Incubar juntamente com o tubo sem bílis a 37ºC por 3 horas 
 
* clareamento: positivo 
* inalterado: negativo 
 
- Bacitracina: 
 
Utilizar discos impregnados com bacitracina (0,04 U) colocados na superfície do meio de 
cultura semeado com o microorganismo em estudo (pode-se incluir no antibiograma) e incubar a 
37ºC por 24 horas em microaerofilia. 
 
* Grupo A: sensível a bacitracina 
* demais grupos: resistentes 
 
 40
- Crescimento a 56ºC: 
 
Para evitar dúvidas entre estreptococos e enterococos (Streptococcus faecalis), submeter a 
cultura a um aquecimento a 56ºC por 30 minutos. Somente os enterococos resistem a este 
tratamento. 
 
- Crescimento em Agar Chapman: 
 
Os enterococos toleram altas concentrações de NaCl, como acontece com Staphylococcus. 
 
- Crescimento em Agar EMB: 
 
Os enterococos suportam a presença de corantes, como o azul de metileno 
 
MATERIAL: 
 
- cultura de Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis 
- Placas de Chapman 
- Tubos de caldo simples 
- Tubos com plasma citratado 
- Tubos com Agar simples 
- Tubos com água destilada estéril 
- Placas DNAse 
 
- Bateria de Gram 
- Água oxigenada a 30% 
- Swabs 
- Solução salina estéril 
- Lâminas, alças... 
- Microscópio 
 
PRÁTICA PARA EXECUTAR 
 
1º DIA: 
 
a. Inocular swab de orofaringe em Caldo Hitchens-Pike (para observação de Streptococcus) 
b. Inocular swab de nasofaringe em Agar Chapman pela técnica de esgotamento (para observação de 
Staphylococcus) 
 
2º DIA: 
 
a. Semear material do crescimento em Hitchens Pike em placa de Agar Sangue, pela técnica de 
esgotamento. 
b. Inocular a UFC típica de Staphylococcus nas provas bioquímicas (catalase, coagulase e 
DNAse) 
c. Realizar a coloração de Gram 
 
3º DIA: 
 
a. Leitura e interpretação da placa de Agar Sangue 
b. Leitura e interpretação das provas bioquímicas 
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RESULTADOS E OBSERVAÇÕES 
 
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ASSUNTO 
- Provas Bioquímicas para a Identificação de Bacilos Gram-negativos 
 
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 
 
 Bacilos gram negativos causam doenças em animais de produção (como a diarréia neonatal e 
salmonelose) e de companhia (infecções no trato urinário, abscessos, etc). 
 Quanto à morfologia, são bastonetes pleomórficos, anaeróbios facultativos. É muito difícil 
distinguir os gêneros entre si por microscopia (observação visual). 
 
Características de crescimento 
 
 Em condições anaeróbicas, são dependentes da presença de carboidratos fermentáveis. Os 
produtos finais da fermentação de açúcares são úteis para a identificação do microorganismo. Uma 
importante característica bioquímica de todas as espécies da família útil para o diagnóstico é a 
ausência de citocromo C, tornando-as oxidase negativas. 
 
Resistência 
 
 Não resistem à luz solar, dessecação, pasteurização e desinfetantes comuns. Em ambientes 
sombreados, como pastos, estercos e cama de palha podem sobreviver por vários meses. 
 
Características de cultura 
 
 Microorganismos entéricos (E.coli, Klebsiella, Enterobacter) crescem muito bem em Agar 
MacConkey. 
 Os métodos utilizados para isolamento de patógenos entéricos dependem da fonte da amostra 
ser intestinal ou extra-intestinal. Quando a fonte é extra-intestinal e a amostra colhida de locais 
normalmente estéreis, o isolamento de qualquer microorganismo da família é significativo. Quando 
a fonte é intestinal, dois gêneros patogênicos são freqüentemente isolados de amostras de fezes: 
Salmonella e Shigella. 
 Os princípios dos meios de cultura para isolamento de bactérias entéricas são: 
- Uma substância inibidora (normalmente um sal biliar ou um corante), que inibe o crescimento de 
bactérias gram positivas; 
- Um substrato utilizado ou não por Salmonella, Shigella e alguns outros microorganismos; 
- Um indicador de pH para revelar mudanças de cor do meio de cultura. 
 O enriquecimento seletivo é feito em meios líquidos seletivos, visando aumentar a proporção 
de Salmonella em relação ao restante da microbiota e facilitar seu posterior isolamento: Os meios 
usados são o caldo tetrationato e o caldo selenito. 
 
Espécies de importância veterináriaAs espécies que mais freqüentemente acometem animais são: Enterobacter, E.coli, Klebsiella, 
Proteus, Salmonella, Shigella, Yersinia, Providencia. Dentre elas, as mais importantes são: 
 
Þ E. coli – 
 A principal espécie que compõe a flora normal do TGI inferior pode ser causa de doença 
septicêmica em potros, bezerros, leitões, filhotes de cães e cordeiros; de diarréia enterotoxigênica 
em neonatos de animais de produção e de doença edematosa em suínos (uma enterotoxemia aguda) 
e também causa a colibacilose dos pintinhos (Cepas potencialmente patogênicas que contaminam a 
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superfície do ovo, por ocasião da postura, podendo penetrar a casca e infectar o saco vitelínico) ou o 
pintinho é infectado pelo trato respiratório. 
 Pode também ser oportunista em quase todas as espécies animais. 
 
Þ Salmonella – 
 Tem o TGI como reservatório. Fontes de infecção incluem: solo contaminado, vegetação, 
água e componentes de rações animais (farinhas de peixe, carne e osso) e fezes de animais 
contaminados. Lagartos e cobras (geralmente assintomáticos) estão comumente infectados. 
 A salmonelose é caracterizada por diarréia e resposta inflamatória no tecido linfóide e 
submucosa, podendo ou não ocorrer septicemia. É uma doença significativa em ruminantes, 
especialmente bovinos, afetando principalmente animais em confinamento. 
 Pode ocorrer aborto após a septicemia e pneumonia adquirida por via hematógena em 
bezerros com S. dublin (que junto com S. typhimurium e S. newport são os sorotipos mais comuns 
em bovinos.) 
 Em suínos apresenta-se como septicemia aguda e fulminante ou como doença crônica 
debilitante e é mais freqüentemente vista em suínos submetidos a stress, em regime de engorda, 
uma faixa etária em que a salmonelose é muito comum, sendo a S. typhimurium e S. cholerae suis 
os sorotipos predominantes. 
 Em cavalos, cólica, cirurgia gastrointestinal e agentes antimicrobianos predispõem o animal 
ao desenvolvimento de sinais clínicos e S. typhimurium e S. anatum são os sorotipos comumente 
isolados. 
 É incomum em cães e gatos. 
 S. pullorum é específico de aves domésticas, causando a chamada pulorose. A bactéria infecta 
o óvulo de perus e galinhas e uma vez posto o ovo infectado, o ambiente de incubação é 
contaminado, infectando outras aves. A morte resulta de septicemia. 
 Os animais e seus subprodutos também são importantes fontes de infecção para o homem, 
sendo o S. typhimurium o mais comum, produzindo gastroenterite. 
 S. gallinarum causa o tifo aviário, uma doença septicêmica aguda ou grave que acomete aves 
adultas, principalmente galinhas. 
 S. arizonae é o agente da arizonose aviária, freqüentemente isolada de perus. A bactéria se 
mantém nas granjas por meio de ovos incubados infectados após a ingestão do microorganismo 
pelas aves e também se dissemina pelas fezes. 
 
Þ Shigella – 
 
 Causa disenteria bacilar em primatas, principalmente em cativeiro. A doença parece estar 
relacionada a situações de stress ou disfunções imunológicas. O reservatório é o intestino grosso de 
animais clinicamente doentes, assintomáticos ou convalescentes. Drogas antimicrobianas e 
mudanças dietéticas aumentam o risco de infecção. 
 S. flexneri 4 é isolada em doença periodontal de macacos. 
 A Shigella é não fermentadora de lactose. 
 
OBJETIVO 
 
 Identificar enterobactérias em gêneros ou espécies, utilizando-se para isso vários meios de 
cultura especiais, de acordo com o esquema a seguir: 
 
 1. Plaqueamento Seletivo 
 
 Etapa de isolamento bacteriano a partir de espécies clínicos, utilizando meios seletivo-
indicadores como o Agar EMB. Neste meio as bactérias Gram positivas são inibidas pela presença 
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de eosina e azul de metileno. As bactérias Gram negativas fermentadoras de lactose (LAC +) 
apresentam-se como colônias rosa-avermelhadas com ou sem centro negro, enquanto as não-
fermentadoras (LAC -) formam colônias transparentes. 
 
 2. Triagem 
 
 Conjunto de provas bioquímicas realizadas simultaneamente em 1 ou 2 meios, permitindo 
uma diferenciação inicial dos isolamentos e direcionamento da contaminação bioquímica. Quando 
realizada em meio TSI, podemos observar: 
 - Fermentação de glicose e produção de gás 
 - Fermentação de lactose e/ou sacarose 
 - Produção de H2S 
 
 Bactérias que utilizam apenas glicose provocam acidificação (de coloração amarela) apenas 
na base, permanecendo o ápice alcalino (de cor avermelhada). Bactérias fermentadoras de lactose 
e/ou sacarose acidificam todo o meio. A formação de gás é evidenciada pelo rompimento ou 
descolamento do meio. A produção de H2S se manifesta pelo escurecimento do meio (devido a sua 
reação com o ferro). 
 
 3. Confirmação Bioquímica 
 
 Conjunto de provas necessárias para a identificação bioquímica das colônias suspeitas. 
Algumas dessas provas estão descritas abaixo: 
 
 a. Fermentação de Carboidratos: glicose, lactose, manitol, sacarose. 
 
 A utilização dos carboidratos leva à formação de ácidos, com viragem do indicador (vermelho 
de fenol) para cor amarela. A partir da glicose podemos observar também a produção ou não de gás 
(CO2, H2) no interior do tubo de Durhan. 
 A inoculação é realizada a partir de cultura bacteriana overnight (+/- 18h) em Agar. Incubar 
por 24 horas a 37ºC. 
 Leitura: cor amarelada = + (positivo) 
 sem alteração = - (negativo) 
 
 b. VM: Verifica a ocorrência de fermentação ácido-mista ( glicose→ ácidos estáveis). 
 
 Meio: Clark & Lubs. 
 Inoculação: idem ao item a. Após incubação ( 48 h ), adicionar 3 – 5 gotas do reativo de VM 
(vermelho de metila → alcalino = amarelo pálido / ácido = vermelho). 
 Leitura: Cor vermelha = + (Indica a produção de ácido estável) 
 Cor amarela = - (Não houve produção de ácido estável) 
 
c. VP ( Voges & Proskauer ): 
 
 Verifica a ocorrência de fermentação acetoínica (glicose→acetoína). 
 Meio: Clark & Lubs (meio glicosado e tamponado). 
 Inoculação: idem ao item a. Após inoculação (48 h), adicionar os reativos: 
 VP I (Barrit I): alfa-naftol (0, 6 mL) 
 VP II (Barrit II): KOH 40% (0, 2 mL) 
 Leitura (após 10 – 15 minutos): 
 45
 * observar o aparecimento de anel vermelho na superfície do tubo (resultado 
positivo) 
 * sem alteração: resultado negativo (forma-se um halo marrom) 
 
d. Citrato: 
 
 Verifica a utilização do citrato como única fonte de carbono. 
 Meio: Citrato de Simmon. 
 Inoculação: idem ao item a. 
 Leitura: 
* Meio azulado = + 
* Sem crescimento = - (O meio continua verde) 
 
e. Indol: 
 
 Verifica a produção de triptofanase, que quebra triptofano, liberando indol, este é revelado 
com o reativo de Kovacs, observa-se a formação de um anel escarlate na superfície do meio. 
 
 Meio: Caldo semi-sólido (SIM). 
 Inoculação: idem ao item a. após a inoculação, adicionar 5 gotas do Reativo de Kovacs. 
 Leitura: cor rosa = + 
 Sem alteração = - 
 
f. Mobilidade: 
 
 Verifica se a bactéria é móvel ou imóvel. 
 
 Meio: Agar semi-sólido (SIM). 
 Inoculação: utilizar agulha bacteriológica, fazendo uma picada central até ¾ da profundidade 
do tubo. 
 Leitura: Crescimento fora do local da picada = + (móvel) 
 Crescimento somente ao redor da picada = - (imóvel) 
 
 
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g. Nitrato: 
 
 Verifica a capacidade de redução do nitrato ( NO3) à nitrito (NO2). 
 
 Inoculação: idem ao item a. Após incubação, adicionar 3 a 5 gotas dos reativos: 
 Nitrato A: alfa naftilamina 
 Nitrato B: ácido sulfanílico 
 Leitura: Cor vermelha (violácea, escarlate) = + (liberação de NH3) 
 Sem alteração = - 
 
h. Uréia: 
 
 Meio contendo uréia para verificar a produção da enzima urease. 
 
 Inoculação: idem ao item a. 
 Leitura: cor vermelha (violácea, escarlate) = + (liberação de NH3) 
 sem alteração = - 
 
OBJETIVOS 
 
 Após a realização da atividade prática você deverá sercapaz de: 
 1- Compreender o papel das enterobactérias como agentes de toxinfecções alimentares; 
 2- Caracterizar e compreender o modo de ação dos meios de Teague (ou EMB) utilizado 
para o isolamento de bacilos gram negativos, diferenciando o crescimento de fermentadores e não 
fermentadores da lactose; 
 3- Citar outros meios utilizados no isolamento de enterobactérias; 
 4- Caracterizar as provas básicas de triagem e confirmação bioquímica para identificação e 
diferenciação de enterobactérias compreendendo seu mecanismo de ação. 
 
MATERIAL 
 
1a. aula: tubo de caldo triptcase soja (TSB) com crescimento de enterobactéria; placa de ágar 
EMB; 
2a. aula: ágar TSI, ágar Citrato de Simmons, ágar SIM, caldo (água) triptonada; caldo MR-VP 
(glicosado tamponado) [2 tubos]; caldo uréia, caldos de fermentação com glicose (e tubo 
de Durhan), lactose e manitol; 
3a. aula: Reativo para indol (Kovac’s= paradimetilaminobenzaldeído); reativo para VM (vermelho 
de metila), reativos para VP (VP1= a-naftol; VP2= KOH) 
 
PRÁTICA PARA EXECUTAR 
 
1o. dia - inocular o meio de EMB com a cultura de TSB ATENCÃO: técnica de esgotamento em 
estria !; 
2o. dia - observar o crescimento obtido: anotar as características das colônias e comparar com os 
dados da tabela abaixo: 
 
 
 
 
 
 
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Característica colonial Gêneros (ou espécies) 
- colônias transparentes ou de cor âmbar Salmonella, Shigella, Proteus, Providencia 
- colônias com brilho verde metálico à luz 
refletida e centro negro à luz transmitida 
Escherichia coli 
- colônias maiores que as de E. coli, mucosas, 
confluentes, com centro escuro à luz 
transmitida. 
Enterobacter, Klebsiella 
 
 - inocular os meios de triagem e confirmação bioquímica da seguinte forma: 
- TSI: picada central na coluna ou base e estria na superfície inclinada (agulha); 
- SIM: picada central até o meio do tubo (agulha); 
- citrato: estria reta na superfície (agulha); 
- caldo uréia, caldo triptonado, caldos MR-VP e caldos de fermentação: repique com 
alça (difusão). 
3o.dia - utilizando os reativos próprios, quando necessário, e segundo orientação do professor, 
fazer as leituras das provas bioquímicas e conferir de acordo com a tabela a seguir, 
procurando identificar a enterobactéria estudada: 
 
 
* exceto S. pullorum e S. gallinarum 
 
 
 
 
Gênero GLI LAC SAC MAN H2S MOT IND CIT VM VP URE TSI GÁS 
Salmonella + - - + + + * - + + - - Alc/á
c 
+ 
Escherichia + + +/- + - + + - + - - Ac/ác + 
Klebsiella + + + + - - - + - + +/- Ac/ác + 
Proteus + - +/- - + + +/- +/- + - + Alc/á
c ou 
ác/ác 
+ 
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RESULTADOS E OBSERVAÇÕES 
 
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ASSUNTO 
- Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos (TSA) 
 Método de Kirby-Bauer 
 
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 
 
O sucesso na terapêutica antimicrobiana de uma infecção bacteriana depende da 
sensibilidade do agente à droga utilizada. Algumas bactérias apresentam um perfil de sensibilidade 
previsível e constante, no entanto muitas outras são altamente suscetíveis ao desenvolvimento ou 
aquisição de resistência a diversos antimicrobianos. Atualmente, o uso adequado e criterioso de 
antimicrobianos é muito importante para prevenção da seleção de amostras bacterianas 
multirresistentes. O teste de sensibilidade a antimicrobianos ou antibiograma permite o 
esclarecimento objetivo do perfil de sensibilidade do patógeno e a utilização de drogas eficazes no 
tratamento. É feito principalmente para bactérias que realizam a conjugação. 
O antibiograma ou TSA é indicado para qualquer microrganismo relacionado ao processo 
infeccioso mas principalmente àqueles cuja sensibilidade a drogas normalmente empregadas na 
terapia não seja previsível como por exemplo: S. aureus, bacilos gram-negativos não fermentadores 
(Pseudomonas), bacilos Gram negativos fermentadores (enterobactérias) etc. 
Uma bactéria é considerada sensível a um antimicrobiano quando o seu crescimento é 
inibido, in vitro, por uma concentração três, ou mais vezes, inferior àquela que o antimicrobiano 
atinge no sangue, caso contrário ela é considerada resistente. O meio termo (bactérias 
moderadamente resistentes) é dado por aquelas cujo crescimento é inibido por concentrações 
intermediárias. 
A concentração inibitória do antimicrobiano pode ser determinada direta ou indiretamente. 
A determinação direta é feita pelos chamados métodos da diluição, e, a indireta, pelo método de 
difusão em placa com discos impregnados com as drogas. 
No método de diluição, concentrações variadas do antibiótico, obtidas pela diluição em 
caldo ou Agar, são inoculadas com o microrganismo. A concentração mais baixa do antibiótico que 
evita o crescimento após a incubação de 12 a 24 horas é a concentração inibitória mínima, é a 
medida da sensibilidade. 
Nos testes pelo método de difusão, discos de papel impregnados com o antibiótico são 
colocados uniformemente na superfície do Agar semeado com o microrganismo. Forma-se, então, 
um gradiente de concentração pela difusão do antibiótico a partir do disco para o Agar com 
conseqüente inibição do crescimento do microorganismo sensível ao (s) determinado (os) 
antibiótico (os). 
Devido à sua simplicidade e por poderem ser realizados rapidamente, os métodos de difusão 
com discos (de Bawer e Kirby) têm preferência sobre os de diluição para os testes de rotina, mas é 
indispensável que sejam rigorosamente padronizados, porque a presença de algumas substâncias 
nos meios podem influenciar o tamanho do halo de inibição. 
Então utilizamos o meio enriquecedor denominado Muller-Hinton, que é um meio 
padronizado, de pH neutro, lembrando que o teste de sensibilidade deve ser realizado com uma 
cultura pura, devendo-se fazer uma coloração de Gram antes de qualquer TSA para a confirmação 
da pureza da cultura. 
A base para o julgamento de sensibilidade é o tamanho real do halo de inibição (zona sem 
crescimento em volta dos discos de antibiótico), o tamanho do halo sozinho não é uma medida 
quantitativa da atividade do antibiótico, assim, é errôneo pensar que quanto maior o halo, mais 
potente seja o antibiótico. Por essa razão, comparações diretas dos diâmetros dos halos produzidos 
por antibióticos não relacionados são falsas e não devem ser realizadas. Deve-se interpretar a 
sensibilidade de acordo com os dados obtidos (diâmetro do halo) em comparação aos dados da 
tabela de interpretação do antibiograma, com antibacterianos de uso corrente na terapêutica clínica. 
 
 50
o Limites para Interpretação do Antibiograma com 32 Antimicrobianos 
de uso corrente na Terapêutica Clínica 
Antimicrobiano Símbolo CONC. DISCO. DIÂMETRO DO HALO DE INIBIÇÃO