TECNICAS CITOPATOLOGICAS

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ROPHET, E. B.; MILLS, B.; ARRINGTON, J.B. & SOBIN, L.H., eds.- Armed Forces Institute of Pathology. Laboratory Methods 
in Histotechnology. Washington, D.C., American Registry of Pathology, 1994. 
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TÉCNICAS CITOPATOLÓGICAS 
 
Tracy L. Raber & Leigh Buckner, III 
 
INTRODUÇÃO 
 Desde as últimas décadas a citologia vem se tornado amplamente aceita, sendo hoje um 
componente integral da Patologia. É rotineiramente praticada, mesmo nos pequenos laboratórios, onde 
o citotecnologista e, ou citopatologista podem contar com o auxílio do laboratório de histologia. Este 
capítulo pretende ser um guia introdutório de técnicas em citopatologia para histotecnologistas, e 
outros técnicos, que atuam como auxiliares num laboratório de citologia. Assim, apresentamos uma 
versão abreviada dos métodos em citologia, não voltada diretamente para os citotecnologistas. 
 A citologia compreende o estudo da estrutura, função, multiplicação, história da vida, e 
alterações patológicas das células. A citopatologia estuda as alterações celulares na doença, sendo as 
amostras citológicas examinadas quanto aos detalhes nucleares e citoplasmáticos celulares. As 
alterações nos padrões celulares auxiliam na separação entre as células normais e anormais. Os 
preparados citológicos podem, contudo, ser diagnósticos finais ou auxiliar no diagnóstico das doenças. 
 As amostras celulares podem ser coletadas de várias maneiras. A pessoa que manipula os 
espécimens citológicos deve estar ciente de que o espécimen citológico varia, dependendo do tipo do 
mesmo e do método de coleta. O material ginecológico (esfregaços de Papanicolaou) e as aspirações 
por agulha fina são distendidos em lâminas e fixados antes de chegarem no laboratório de citologia. 
São fixados com fixador de base alcoólica, em spray, ou com etanol a 95%. Os espécimens aquosos, 
ou com células esparsamente distribuidas, tais como a urina, o fluido cérebroespinhal, e os líquidos das 
cavidades corporais, devem ser colocados em filtros ou concentrados para se ter uma ótima 
amostragem celular. A citocentrifugação concentra as células em um sedimento (pellet) a partir do 
qual esfregaços ou blocos celulares podem ser feitos. A citocentrifugação também pode concentrar as 
células numa pequena área da lâmina de vidro na preparações cytospin. 
 A rápida fixação e a ótima preservação das células são de grande importância para a 
interpretação diagnóstica do material. O fixador líquido mais comum, para os espécimens citológicos, 
é o etanol a 95%. Os materiais fixados em etanol a 95% são corados pela técnica de Papanicolaou 
modificada. Os espécimens podem também ser fixados a seco (ao ar) e corados pelos métodos Diff-
Quik ou de Romanovsky. Se fluidos forem coletados após as horas de funcionamento do laboratório, 
eles devem ser colocados no refrigerador. Para auxiliar na preservação destes espécimens, etanol a 
50% pode ser adicionado. Para evitar-se a formação de coágulo, a heparina deve ser acrescentada nos 
espécimens hemorrágicos. 
 
MIKEL, U.V., ed. - Armed Forces Institute of Pathology. Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology. 
Washington, D.C., American Registry of Pathology, 1994. 
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FIXAÇÃO DOS ESFREGAÇOS 
 
 
 Os principais propósitos de um fixador citológico são penetrar rapidamente nas células e a 
manutenção da integridade morfológica das mesmas. Hoje, o fixador usado mais comum é o etanol a 
95%, o qual pode ser substituido por outros álcoois que dão resultados equivalentes, como o metanol a 
100%, álcool desnaturado a 95%, isopropanol a 80%, e vários fixadores em spray disponíveis 
comercialmente. A fixação imediata, enquanto o espécimen ainda está úmido, é essencial para uma 
ótima preservação, pois mesmo uma mínima dessecação ao ar, de uma amostra, irá alterar os aspectos 
celulares. O tempo de fixação mínimo é de 15 minutos, porém uma fixação prolongada, de vários dias, 
não alterará a aparência do esfregaço. 
 Os fixadores em spray consistem de uma base alcoólica e de uma substância cerácea que cobre 
a lâmina. Uma pequena quantidade de cêra, tal como Carbowax (polietilenoglicol) é acrescentada ao 
fixador alcoólico para prover uma cobertura protetora e evitar artefato por dessecação ao ar. Este deve 
ser removido antes da coloração. Dois banhos em etanol a 95%, de 10 a 15 minutos cada, são, 
usualmente, o suficiente para remover a substância cerácea. O carbowax é acrescentado ao fixador de 
Saccomanno, de modo que as preparações de Saccomanno também devem passar pelo etanol a 95%, 
por 10 a 20 minutos, antes do processamento através das colorações. 
 Os espécimens não-fixados, para serem processados mais tarde, podem ter etanol a 50% 
adicionado à amostra, como preservativo, ou este pode ser usado como um fluido de coleta. Os 
espécimens deixados para o processamento no dia seguinte devem ser coletados em etanol a 50% e 
mantidos no refrigerador durante a noite. Concentrações maiores que 50% da solução “pré-
fixadora”endurecem a amostra e dificultam a realização de esfregaços. A heparina deve ser adicionada 
às amostras sanguinolentas para prevenir a formação de coágulo. 
 As amostras citológicas fixadas, como é de regra, são coradas pelo método de Papanicolaou. 
Os blocos celulares são fixados em formalina, e as secções coradas pelo método da hematoxilina e 
eosina, ou outras colorações especiais, que possam auxiliar no diagnóstico. Algumas preparações 
citológicas são, por escolha, deixadas secar ao ar e não fixadas. Tais preparações são, a seguir, coradas 
pelo método de Romanovsky, que contém metanol. A coloração, em si, age como um fixador. 
 
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PREPARO DE LÂMINAS COM AMOSTRAS CITOLÓGICAS 
 
 
 As amostras ginecológicas (esfregaços de Papanicolaou), e as obtidas por aspiração com 
agulha fina, chegam ao laboratório já fixadas e prontas para serem coradas. Outras amostras, algumas 
das quais coletadas em fluido preservativo, usualmente o etanol a 50%, são preparadas no laboratório. 
O método de preparação depende do tipo e da quantidade da amostra. As amostras esparsamente 
celulares podem ser processadas em filtros ou colocadas na lâmina com uma citocentrífuga, a qual 
concentra as células numa área muito pequena (cytospins). O método de preparação celular preferido, 
entretanto, é o esfregaço direto da amostra sobre uma lâmina de vidro. As amostras escassas podem ser 
concentradas por centrifugação e, a seguir, serem feitos os esfregaços nas lâminas. O material de sobra 
pode fornecer blocos celulares. As secções dos blocos celulares podem ser coradas por técnicas 
especiais, importantes auxiliares no diagnóstico. 
 
☞ BIOSSEGURANÇA: É importante ter ciência de que os espécimens frescos, não-fixados, 
podem ser infecciosos. Sempre use um jaleco e luvas, e manipule as amostras com cuidado, 
preferencialmente em uma capela com fluxo laminar. Esfregue, no lado de fora do frasco do 
espécimen, solução de isopropanol a 70% ou de Clorox a 10% [solução aquosa de hipoclorito de 
sódio a 10%]. Descontamine todos os equipamentos usados no preparo das amostras, tais como 
microscópio, centrífuga, misturadores Vortex, esfregando neles álcool ou solução de Clorox. 
 
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FILTROS DE MEMBRANA 
 
PRINCÍPIOS 
 As preparações com filtro são usadas no processamento de espécimens esparsamente celulares, 
e servem como substitutos da citocentrifugação (cytospin). Os fluidos cérebroespinhais, a urina, os 
lavadosbrônquicos e os transudatos são espécimens que se encaixam bem neste tipo de 
processamento. Para se determinar a celularidade de uma amostra executa-se o teste com o azul de 
toluidina. Para os espécimens esparsamente celulares ou de pequeno volume, os filtros oferecem a 
potencialidade de se recuperar todas as células. O processamento com filtros é o mesmo para todos os 
espécimens, devendo as suas diretrizes serem seguidas fielmente, ou as preparações resultantes serão 
insatisfatórias. Três tipos de filtros (discutidos abaixo) podem ser usados nas preparações citológicas. 
 
MATERIAIS E SOLUÇÕES 
 Filtro 
 Suporte do filtro 
 Grampos para filtro 
 Pinças para filtro 
 Seringas descartáveis de 10 mililitros 
 Lâminas de vidro 
 Etanol a 95% 
 Método de coloração de Papanicolaou 
 
PROCEDIMENTO 
 Figuras 1 e 2, no final do capítulo de técnicas citopatológicas. 
 1. Remova o filtro da caixa usando uma pinça e coloque-o no suporte. 
 2. Expanda o filtro injetando no suporte várias gotas de etanol a 95%. 
 3. Injete o espécimen dentro do suporte usando uma seringa de 10 mililitros. 
 4. Adicione 1 mililitro de etanol a 95% usando a seringa de 10 mililitros. 
 5. Remova o filtro do suporte, utilizando uma pinça, e corte-o para caber na lâmina. (Se 
utilizar um filtro grande corte-o em duas metades e use duas lâminas). 
 6. Prenda, com um grampo, cada metade do filtro em uma lâmina, e mergulhe as lâminas 
em uma jarra de coloração contendo etanol a 95%. 
 7. Core pelo método de Papanicolaou (veja adiante). 
 8. Monte em lâminas de vidro, com meio resinoso, mantendo as células voltadas para cima, 
e tomando o cuidado de não deixar bolhas entre a lâmina, o filtro e a lamínula. 
 
OBSERVAÇÕES: 
 Há três tipos de filtro que podem ser usados na preparação de espécimens citológicos, a saber, 
Millipore, Gelman, e Nucleopore. A principal diferença entre eles é o tipo de material de que são feitos 
e o tamanho dos seus poros. Todos os três requerem um método de coloração de Papanicolaou 
modificado. 
 Os filtros Millipore são filtros plásticos, contendo ésteres mistos de celulose, e poros grandes. Tais 
filtros devem ser expandidos com etanol a 95%, para que não se retraiam, quando expostos aos 
espécimens citológicos. Durante a coloração, os tempos suficientes nas soluções corantes, associados 
com os enxágues em etanol, permitem que os corantes sejam absorvidos pelas células e não pelo filtro 
em si. Precauções especiais devem ser tomadas durante a montagem da lâmina com os filtros 
Millipore. Eles se tornam transparentes somente quando montados em um meio com índice de 
refração semelhante ao dos filtros. Um meio de montagem usual é o Permount (Fisher Scientific). 
Uma quantidade apropriada de meio de montagem deve ser usada, pois o xileno não se mantém nos 
poros do filtro e, ao evaporar-se após alguns dias, levará à dessecação do filtro, apesar deste estar 
 
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coberto com a lamínula. Entretanto, muito meio de montagem pode dificultar o exame microscópico 
em grande aumento, a seco. 
 Os filtros Gelman têm propriedades físicas e ópticas semelhantes às dos filtros Millipore, e são 
feitos de triacetato de celulose, um polímero mais resistente ao etanol. Em comparação com os filtros 
Millipore, expandem-se menos quando expostos ao etanol. A captura de corante por este filtro é 
marcantemente reduzida, o que permite as células coradas sobressaírem-se em relação com o fundo da 
lâmina. Os filtros Gelman têm um índice de refração de 1,47 a 1,48 e, para uma boa imagem 
microscópica, eles precisam ser montados em um meio com índice de refração igual ou semelhante ao 
deles. O meio Permount (Fisher Scientific) pode ser usado. 
 Os filtros Nucleopore são feitos de policarbonato, o qual não é afetado pela maioria dos solventes. 
Por isso, não é necessário pré-expandi-los com etanol a 95%. Eles não se coram e, desse modo, dão 
um fundo claro à lâmina; entretanto, eles têm dois índices de refração e são birrefringentes, tornando 
impossível eliminar a imagem dos poros com o meio de montagem. Deve-se também chamar a atenção 
que se eles forem expostos ao xileno por mais de 15 minutos, eles ficarão ondulados. Isto tornará 
difícil a montagem com lamínula e o exame ao microscópio. Os filtros Nucleopore, entretanto, podem 
ser dissolvidos em clorofórmio ou em cloreto de etileno, o que elimina a ondulação e a imagem 
distorcida dos poros. Contudo, a eliminação do filtro quimicamente pode produzir vários artefatos, que 
podem causar problemas na avaliação do espécimen. 
 
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TESTE COM O AZUL DE TOLUIDINA 
 
 
PRINCÍPIOS 
 Os espécimens celulares, não-ginecológicos, (i.é., fluidos de cavidades corporais) têm um alto 
potencial de contaminação cruzada e devem ser corados separadamente (regulação CLIA - 88). Para 
determinar a celularidade de uma amostra o teste do azul de toluidina deve ser feito. As amostras 
celulares coradas pelo azul de toluidina mostram claramente se o espécimen contém grande número de 
células e de grupamentos celulares. Os grupamentos celulares indicam que o fluido é anormal e que 
deve ser processado separadamente. 
 
MATERIAIS E SOLUÇÕES 
 Azul de toluidina (C.I. 52040).....................................0,5 grama. 
 Etanol a 95% ............................................................20 mililitros. 
 Água destilada .........................................................80 mililitros. 
 
Dissolva o azul de toluidina no etanol. Acrescente água destilada até o volume final de 
100 mililitros. Filtre antes de usar. 
 
PROCEDIMENTO 
 1. Coloque uma gota de azul de toluidina sobre uma lâmina limpa. 
 2. Coloque uma gota do fluido da amostra próximo ao corante, e deixe o contato se fazer. 
 3. Coloque uma pequena lamínula sobre o espécimen. 
 4. Avalie a celularidade da amostra sob o microscópio. 
 5. Processe, separadamente, as amostras com elevada celularidade e muitos grupamentos de 
células. A figura 3, ao final do capítulo de técnicas citopatológicas, ilustra uma amostra 
com grupamentos de células. 
 
 
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ESFREGAÇOS DIRETOS 
 
PRINCÍPIOS 
 O esfregaço direto da amostra de células sobre a lâmina é o método preferido no 
processamento citológico. Os espécimens ricos em células são usados diretamente e os espécimens 
menos celulares são concentrados através de centrifugação. Os escarros, preparados de acordo com o 
método de Saccomanno, são pré-fixados, misturados por meio de um misturador, e concentrados por 
centrifugação, antes de serem feitos os esfregaços sobre as lâminas. Os esfregaços diretos são 
preparados usando-se o método “da tração de duas lâminas.” Duas gotas da amostra são colocados 
sobre uma lâmina e, sobre esta, é colocada uma segunda lâmina, sendo as duas gentilmente 
tracionadas em sentido opostos de modo que, ao final, haverá dois esfregaços. 
 
MATERIAIS E SOLUÇÕES 
 Centrífuga 
 Tubos de 50 mililitros para centrífuga 
 Misturador Vortex 
 Pipetas de vidro 
 Etanol a 50% 
 Lâminas de vidro cobertas com poli-L-lisina.
✥
 
 
PROCEDIMENTO 
 Figuras 4 e 5, ao final do capítulo de técnicas citopatológicas. 
 1. Concentre o espécime através de centrifugação, se necessário.2. Decante a maior parte do sobrenadante e redissolva o sedimento misturando-o com o 
Vortex, por poucos segundos. 
 3. Transfira, com uma pipeta de vidro, uma pequena quantidade do sedimento para o 
centro de uma lâmina de vidro, coberta previamente com poli-L-lisina. Coloque uma 
outra lâmina sobre o sedimento e, gentilmente, movimente as lâminas para frente e para 
trás, de modo a dispersar as células em uma fina camada. A seguir, separe as lâminas, 
uma da outra, rapidamente. 
 4. Imerja as lâminas em etanol a 95% para a coloração pelo método de Papanicolaou, ou 
deixe-as secar ao ar para serem coradas pelo método Diff-Quik. 
 
OBSERVAÇÕES: 
Os escarros, os fluidos cavitários corporais, e os aspirados por agulha fina são os tipos de 
espécimens, a partir dos quais, podem ser feitos esfregaços diretos. 
 
✥ Faça uma solução de 50 microgramas/mililitro de poli-L-lisina em água desionizada, 
autoclavada (esta solução pode ser utilizada por até 1 mês, se mantida a 4
o
C). Sobre cada lâmina 
coloque, aproximadamente, 1 mililitro de solução de poli-L-lisina, e distribua uniformemente em 
cada uma das superfícies. Deixe as lâminas em repouso, à temperatura ambiente, por 30 minutos. 
Escorra o excesso da solução de poli-L-lisina e enxágue as lâminas, 3 vezes, em água desionizada. 
Deixe as lâminas secarem (as lâminas secas podem ser armazenadas por 1 semana à temperatura 
ambiente). 
 
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MÉTODO DE SACCOMANNO PARA O PREPARO DE ESCARRO 
 
PRINCÍPIOS 
 A técnica de Saccomanno é um método alternativo para o processamento de escarro. Esta 
técnica remove os restos celulares (debris) e o material mucóide, que podem esconder as células 
diagnósticas. 
 
MATERIAIS E SOLUÇÕES 
 Misturador pequeno 
 Centrífuga 
 Tubos de 50 mililitros para centrífuga 
 Misturador Vortex 
 Pipetas 
 Lâminas de vidro cobertas com poli-L-lisina (veja acima). 
 
 Fixador de Saccomanno 
 Etanol a 95% ..............................................1.900 mililitros. 
 Água destilada ............................................2.100 mililitros. 
 Carbowax (1540) (DuPont)
✥
...............................92 gramas. 
 ✥ [N. do T.: Carbowax = poli(glicol etilênico) ou polietilenoglicol] 
 
Misture a água destilada e o etanol em um recipiente de 4 litros. Derreta o Carbowax 
em banho-maria a 37
o
C. Adicione o Carbowax derretido à solução no recipiente e agite 
por 30 segundos. 
 
PROCEDIMENTO 
 1. Adicione o fixador de Saccomanno ao escarro, e despeje num recipiente de 250 
mililitros de um misturador semi-micro. O volume total do fixador com o 
espécimen deve ser em torno de 100 mililitros. (Se o espécimen for escasso 
acrescente fixador até o volume de 30 mililitros). 
 2. Misture tudo em baixa velocidade por 2 segundos e em alta velocidade por 5 a 30 
segundos. Macroscopicamente os filamentos finos do material não devem ser 
visíveis. Se forem visíveis, misture novamente por mais 15 a 20 segundos ou até 
que os filamentos desapareçam. 
 3. Divida a suspensão entre dois tubos de centrífuga, de modo equilibrado. 
 4. Centrifugue o espécimen, por 5 minutos, a 1.500 rotações por minuto (rpm). 
 5. Decante o sobrenadante até que 2 a 3 mililitros cubram o concentrado celular. 
 6. Redissolva o concentrado de células por agitação em um misturador Vortex. 
 7. Aspire com uma pipeta cerca de 1 mililitro da suspensão. Adicione duas gotas sobre 
uma lâmina previamente coberta com poli-L-lisina. Para os espécimens pouco 
celulares adicione 3 a 4 gotas ou mais, se necessário. 
 8. Faça os esfregaços segundo o método de esfregaços diretos. 
 9. Deixe as lâminas, com a superfície com o material voltada para cima, secar ao ar. 
 10. Imerja as lâminas, secas ao ar, em etanol a 95%, e deixe por 10 minutos para 
remover o Carbowax precipitado. 
NOTA: 
O esfregaço direto de escarro é feito com o espécimen fresco, enquanto o método de Saccomanno 
permite que a amostra fique no refrigerador para ser processada no dia seguinte. O fixador de 
Saccomanno contém Carbowax, o qual deve ser removido antes da coloração. 
 
 
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Washington, D.C., American Registry of Pathology, 1994. 
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REFERÊNCIA 
GILL, G. & PLOWDEN, K.- Laboratory Cytopathology: Techniques for Specimen Preparation. 
Baltimore, Md, Johns Hopkins University Press, 1984. 
 
 
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PREPARO DE BLOCO CELULAR 
 
PRINCÍPIOS 
 O bloco celular é um procedimento auxiliar na avaliação diagnóstica citológica. Pode ser 
preparado a partir de fluidos, lavados, escovados, ou aspirados por agulha. A vantagem do bloco 
celular é a captura de qualquer tecido que possa estar presente no espécimen, permitindo, assim, a 
observação de alguma arquitetura tecidual. O bloco celular permite também a realização de cortes 
adicionais, para estudo com colorações especiais, úteis no auxílio diagnóstico de um caso. 
 
MATERIAIS E SOLUÇÕES 
 Centrífuga 
 Tubos de 10 mililitros para centrífuga 
Solução aquosa de gelatina a 2% derretida, dentro de um tubo de ensaio de vidro, mantido em 
água fervendo. 
 Pipeta de vidro aquecida para transferência da gelatina. 
 Formalina a 10%, neutra, tamponada. 
 Etanol 
 Xileno 
 Parafina 
 
PROCEDIMENTO 
 1. Centrifugue o espécimen até formar o sedimento. 
 2. Decante o sobrenadante. 
 3. Acrescente cerca de 0,25 mililitros de solução aquosa de gelatina a 2%, quente, 
cuidadosamente, e com o auxílio de um bastão ou espátula levante o sedimento de modo 
que a gelatina flua sob o mesmo. 
 4. Coloque o tubo de ensaio no gelo para solidificar rapidamente a gelatina. 
 5. Remova o botão de gelatina com o bastão ou a espátula e coloque-o na formalina. 
 6. Deixe fixar por pelo menos 1 hora. 
 7. Processe como um tecido, emblocando em parafina. 
 
OBSERVAÇÕES: 
 Alguns espécimens celulares, e.g., fluidos de cavidades corporais, contêm sangue e poderão 
coagular na ausência de heparina. Assim, o material diagnóstico ficará entremeado na rede de fibrina e 
não disponível para a avaliação. Entretanto, tais coágulos podem ser envolvidos em papel de filtro, 
fixados em formalina, e processados como tecido. Nestes casos, não é necessário concentrar a amostra, 
por meio de centrifugação, e emblocá-la em gelatina. 
 
 
 
REFERÊNCIA 
GILL, G. & PLOWDEN, K.- Laboratory Cytopathology: Techniques for Specimen Preparation. 
Baltimore, Md, Johns Hopkins University Press, 1984. 
 
 
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PREPARAÇÃO DE CITOCENTRIFUGADO (CYTOSPIN) 
 
PRINCÍPIOS 
 Para os espécimens paucicelulares ou em pequeno volume, tais como o líquido céfalor-
raquidiano ou os transudatos, a centrifugação das amostras para uma lâmina de vidro (cytospins), 
através de uma citocentrífuga, permite a captura de uma concentração maior de células para uma 
pequena área circular da lâmina. O cytospin elimina a maior parte dos restos proteináceos (debris), 
deixando um fundo limpo na lâmina. Os fabricantes deste tipo de equipamento fornecem as 
informações, quanto aos materiais e as soluções necessárias, e de como operar o equipamento. 
 
MATERIAIS E SOLUÇÕES 
 HemacitômetroCentrífuga Cytospin (Shandon Cytospin 2, Shandon Inc., Pittsburgh, PA) 
 Câmaras Cytospin (citofunis para a colocação das amostras) 
 Citoclipes Cytospin (prendedores de aço para lâminas) 
 Filtros-almofadas Cytospin (cartões de filtro) 
Lâminas de vidro cobertas com poli-L-lisina (veja anteriormente), ou lâmina comuns se a poli-
L-lisina não estiver disponível. 
 Fixador Cytospin ou fixador de Saccomanno 
 Etanol a 95% 
 Pipetas 
 
PROCEDIMENTO 
 1. Conte as células do espécimen com o hemacitômetro, no microscópio, ou use uma 
quantidade aproximada (veja as observações abaixo). 
 2. Dilua as amostras, ricas em células, até 2 x 10
6
 células/mililitro, e concentre as amostras 
paucicelulares, por meio de centrifugação, até o número de células citado, se possível. 
 3. Coloque um filtro-almofada (cartão de filtro) entre uma das lâminas (cobertas com poli-
L-lisina) e cada uma das câmaras Cytospin (citofunis), mantendo o lado espesso do filtro 
não-justaposto à lâmina, e o conjunto preso com um citoclipe. O orifício no filtro-
almofada (cartão de filtro) deve ficar na porção mais baixa da câmara (citofunil). 
 4. Coloque as câmaras (citofunis) dentro da centrífuga Cytospin. 
 5. Coloque algumas gotas de etanol a 95%, no poço da câmara (citofunil), para expandir o 
filtro. 
 6. Coloque 3 gotas da amostra (ou mais se a amostra for paucicelular) na porção horizontal 
do reservatório (citofunil) e, a seguir, várias gotas do fixador Cytospin. 
 7. Cubra o reservatório (citofunil) de modo que nenhum espécimen se perca. 
 8. Coloque a tampa sobre o cytospin (cabeçote com 12 posições) e feche a centrífuga. 
 9. Programe a velocidade (1.500 rpm) e o tempo (2 minutos). 
 10. Centrifugue. 
 11. Deixe a centrífuga parar antes de abri-la. 
 
OBSERVAÇÕES: 
 Este procedimento é o recomendado para a Shandon Cytospin 2, Shandon Inc., Pittsburgh, PA, 
e pode ter que ser modificado no uso de outras citocentrífugas. 
 O número de gotas de células, a ser usado, pode também ser determinado colocando-se uma 
gota da suspensão celular sobre uma lâmina de vidro e coberta com uma lamínula. A lâmina é, então, 
observada ao microscópio, de modo a se ter uma avaliação aproximada do número de células por 
campo, com a objetiva de 40x. O número aproximado de células contadas é, então, dividido por 60, 
cujo resultado inteiro será o número de gotas a ser usado em cada lâmina. Por exemplo, se a contagem 
celular for 20, o número de gotas será 3. Quando a observação com a objetiva de 10x revelar quase 
 
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nenhuma célula, use 20 gotas. Poucas gotas de saponina podem ser adicionadas, antes de se colocar o 
fixador Cytospin, se o espécimen for sanguinolento. A saponina lisa as hemácias, pois as mesmas são 
como um artefato que dificulta a observação das células diagnósticas. 
 Deve-se lembrar que já existem equipamentos disponíveis para o preparo citológico, em 
monocamadas finas, sobre lâminas de vidro. Tais equipamentos variam desde simples e baratos até os 
mais complexos e caros. 
 
 
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PROCEDIMENTOS DE COLORAÇÃO 
 
 O método de coloração mais comumente usado nos preparados citológicos é o de 
Papanicolaou. Modificações desta técnica variam de um laboratório para outro. É aconselhável a 
padronização deste método, de modo que sejam obtidos resultados satisfatórios. As preparações secas 
ao ar são coradas pelo método de Romanovsky e, usualmente, pelos métodos Diff-Quick ou de Giemsa. 
O uso de outros métodos de coloração, na rotina do diagnóstico citológico, tem sido limitado. As 
colorações especiais, rotineiramente utilizadas na maioria dos laboratórios histológicos, são algumas 
vezes aplicadas. Nós utilizamos como referência, para tais técnicas, o AFIP`s Laboratory Methods in 
Histotechnology. 
 
COLORAÇÃO DE PAPANICOLAOU 
 
PRINCÍPIOS 
 O procedimento de coloração de Papanicolaou foi desenvolvido para uma ótima visualização 
das células cancerosas esfoliadas das superfícies epiteliais do corpo. É uma reação de coloração 
policromática, consistindo de um corante nuclear de base aquosa e de dois contracorantes 
citoplasmáticos de base alcoólica, cujo objetivo é mostrar as muitas variações na morfologia celular e 
os graus de maturidade e de atividade metabólica celular. Este método não é específico para qualquer 
substância encontrada no câncer. 
 
SOLUÇÕES 
 Hematoxilina 
 Água destilada .............................................................730 mililitros. 
 Etileno glicol ...............................................................250 mililitros. 
 Hematoxilina de Gill II (Lerner, Pittsburgh, PA)
✣
 ............2 gramas. 
 Iodato de sódio .................................................................0,2 grama. 
 Sulfato de alumínio .......................................................17,6 gramas. 
 Ácido acético glacial .....................................................20 mililitros. 
✣ 
[N. do T.: A hematoxilina de Gill II pode ser substituida pela hematoxilina, cristais (C.I.: 75290)] 
Misture os ingredientes, na sequência, utilizando uma barra magnética, por 1 hora à 
temperatura ambiente. O corante pode ser usado imediatamente, porém filtre antes de 
cada uso. A hematoxilina empregada nesta fórmula é a anidra. Se for utilizada a forma 
da hematoxilina em cristais, use 2,36 gramas. Um grama de ácido cítrico pode ser 
substituido por 20 mililitros de ácido acético glacial. 
 Banho de ácido clorídrico (usado somente para os filtros) 
 Água destilada........................................................1.000 mililitros. 
 Ácido clorídrico, concentrado ......................................2 mililitros. 
 (Prepare fresco em cada dia) 
 
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Washington, D.C., American Registry of Pathology, 1994. 
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 Hidróxido de amônio (banho azulador) 
 Água destilada..........................................................1.000 mililitros. 
 NH4OH, concentrado .......................................................1 mililitro. 
 (Prepare fresco em cada dia) 
 Corante Orange G 
 • Solução-estoque: Orange G a 10% 
Orange G (Lerner) (C.I.16230).......................................10 gramas. 
Água destilada.....................................até completar 100 mililitros. 
(Quando estiver preparando a solução-estoque leve em consideração a pureza do 
corante. Exemplo: Se a pureza for de 80%, use 12,5 gramas). 
 • Solução de trabalho: 
Solução estoque ..........................................................20 mililitros. 
Ácido fosfotúngstico ....................................................0,15 grama. 
Etanol a 95% ............................................................980 mililitros. 
 Corante Eosina-65 
 • Soluções-estoque: 
Eosina Y a 20% 
Eosina Y, aquosa (Lerner) (C.I. 45380)........................20 gramas. 
Água destilada, 70
o
 a 80
o
C................até completar 100 mililitros. 
 
 Verde Claro (Light-Green SF) a 3% 
Light-Green SF (Lerner) (C.I. 42095)............................3 gramas. 
Água destilada, 70
o
 a 80
o
C...............até completar 100 mililitros. 
☞ As soluções podem ser usadas imediatamente, porém filtre-as antes de cada uso. 
Leve em consideração a concentração (pureza) do corante, quando for preparar as 
soluções-estoques.• Solução de trabalho: EA-65 
 Solução-estoque de eosina Y..................................20 mililitros. 
 Solução-estoque de Light-Green SF......................10 mililitros. 
 Ácido fosfotúngstico...................................................2 gramas. 
 Etanol a 95%.......................................................700 mililitros. 
 Metanol absoluto................................................250 mililitros. 
 Ácido acético glacial............................................20 mililitros. 
 
 
 
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 Etanol: 95%, 100% 
 Xileno (xilol) 
 Meio de montagem 
 
PROCEDIMENTO 
 1. Etanol a 95%...........................................10 gotas (veja as notas abaixo). 
 2. Etanol a 95%..............................................................................10 gotas. 
 3. Água destilada/desionizada....................10 gotas (veja as notas abaixo). 
 4. Água destilada/desionizada........................................................10 gotas. 
 5. Hematoxilina...........................................................................3 minutos. 
 6. Água destilada/desionizada .......................................................20 gotas. 
 7. Banho azulador ..........................................................................20 gotas. 
 8. Água destilada/desionizada........................................................20 gotas. 
 9. Etanol a 95%..............................................................................10 gotas. 
 10. Etanol a 95%..............................................................................10 gotas. 
 11. Orange G, solução de trabalho..................................................1 minuto. 
 12. Etanol a 95%..............................................................................10 gotas. 
 13. Etanol a 95%..............................................................................10 gotas. 
 14. Etanol a 95%..............................................................................10 gotas. 
 15. Eosina-EA65, solução de trabalho..........................................5 minutos. 
 16. Etanol a 95%.............................................................................10 gotas. 
 17. Etanol a 95%.............................................................................10 gotas. 
 18. Etanol a 95%.............................................................................10 gotas. 
 19. Etanol a 100%...........................................................................10 gotas. 
 20. Etanol a 100%...........................................................................10 gotas. 
 21. Etanol a 100%...........................................................................10 gotas. 
 22. Xileno.......................................................................................10 gotas. 
 23. Xileno.......................................................................................10 gotas. 
 24. Monte em meio resinoso. 
 
 
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MÉTODO DE COLORAÇÃO DE PAPANICOLAOU PARA FILTROS 
 
 1. Etanol a 95%.............................................................................10 gotas. 
 2. Água destilada/desionizada.......................................................10 gotas. 
 3. Água destilada/desionizada.......................................................10 gotas. 
 4. Hematoxilina..........................................................................2 minutos. 
 5. Água corrente de torneira..........................................................20 gotas. 
 6. Banho ácido, 1 gota/segundo por ............................................1 minuto. 
(ou até que os filtros fiquem amarelo-pálidos) 
 7. Água destilada/desionizada......................................................20 gotas. 
 8. Banho azulador......................................................................2 minutos. 
 9. Etanol a 95%............................................................................10 gotas. 
 10. Etanol a 95%............................................................................10 gotas. 
 11. Orange G, solução de trabalho..........................................10 segundos. 
(não goteje nos filtros a partir deste ponto, deixe-os nas soluções) 
 12. Etanol a 95%..........................................................................1 minuto. 
 13. Etanol a 95%..........................................................................1 minuto. 
 14. Etanol a 95%..........................................................................1 minuto. 
 15. Eosina-EA 65, solução de trabalho......................................8 minutos. 
 16. Etanol a 95%........................................................................4 minutos. 
 17. Etanol a 95%........................................................................2 minutos. 
 18. Etanol a 95%.........................................................................1 minuto. 
 19. Etanol a 100%.......................................................................1 minuto. 
 20. Etanol a 100%.......................................................................1 minuto. 
 21. Etanol a 100%.......................................................................1 minuto. 
 22. Xileno....................................................................................1 minuto. 
 23. Xileno....................................................................................1 minuto. 
 24. Monte em lâmina de vidro com meio resinoso. 
 
RESULTADOS 
 Veja as figuras 7 a 10, ao final do capítulo de técnicas citopatológicas. 
NOTAS: 
 Quando estiver seguindo o procedimento de Papanicolaou, observe que todos os esfregaços 
que tenham sido fixados com spray e todas as preparações de Saccomanno devem permanecer no 
 
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etanol a 95%, por pelo menos 10 minutos, antes de se proceder a coloração. Pode-se usar água 
destilada ou desionizada. 
 Durante a coloração, um número substancial de células se solta das lâminas ou dos filtros. Não 
é incomum que tais células flutuantes se fixem em outro espécimen. Para evitar a ocorrência de 
contaminação cruzada, certas regras devem ser seguidas: Todas as soluções devem ser filtradas 
diariamente. Os casos menos propensos a soltar células devem ser corados primeiro, e aqueles que 
mais facilmente soltam células devem ser corados por último. A ordem de coloração das amostras não-
ginecológicas deve ser a seguinte: (1
o
) fluidos espinhais; (2
o
) esfregaços e citocentrifugados 
(cytospins); e (3
o
) todos os filtros. Deve-se ter em mente, entretanto, que o problema do 
desprendimento de células não pode ser totalmente eliminado. 
 Algumas ocorrências que precedem a aplicação do meio de montagem na lâmina podem 
influenciar os resultados. Tais ocorrências incluem a espessura do esfregaço celular e a presença de 
água no etanol absoluto e no xileno. Para os esfregaços celulares espessos, ou para os filtros, uma 
quantidade maior de meio de montagem deve ser utilizada. Áreas densas, como borrões, das 
preparações, cobertas pelo meio de montagem, favorecem a produção de bolhas de ar e o aparecimento 
de focos secos pelo ar, causando o artefato conhecido com “flocos de milho” (Figura 11). Se istoocorrer, retire a lamínula imergindo a lâmina no xileno, e, a seguir, recoloque a lamínula. Outro 
problema é a transferência de água para o etanol absoluto e deste para o xileno, tornando-os 
enevoados, esbranquiçados. O resultado será a má-desidratação e imagens pouco nítidas (Figura 12). 
Se água for notada no xileno, IMEDIATAMENTE, troque o xileno, assim como o etanol absoluto. 
 Acima de tudo, um preparado citológico satisfatório depende não somente da coloração, mas 
também da coleta do espécimen, da sua preparação, e da sua fixação. Uma coloração perfeita não 
melhorará as amostras paucicelulares, ou as amostras mal-fixadas com células degeneradas, ou as 
amostras cujas células ficam obscurecidas por “lagos”de leucócitos polimorfonucleares (neutrófilos). 
Tais preparações podem ser consideradas insatisfatórias. 
 
 
 
REFERÊNCIAS 
GILL, G. & PLOWDEN, K.- Laboratory Cytopathology: Techniques for Specimen Preparation. 
Baltimore, Md, Johns Hopkins University Press, 1984. 
PROPHET, E. B.; MILLS, B.; ARRINGTON, J.B. & SOBIN, L.H., eds.-Armed Forces Institute of 
Pathology. Laboratory Methods in Histotechnology. Washington, D.C., American Registry of 
Pathology, 1992. 
 
MIKEL, U.V., ed. - Armed Forces Institute of Pathology. Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology. 
Washington, D.C., American Registry of Pathology, 1994. 
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CONTROLE DE QUALIDADE DO MÉTODO DE 
COLORAÇÃO DE PAPANICOLAOU 
 
 
 A apreciação técnica das lâminas coradas é feita para se determinar a ótima qualidade da 
coloração na avaliação citológica. Um registro diário da qualidade dos métodos de coloração celular 
deve ser mantido. Neste registro deve-se incluir a data e as observações quanto a qualidade da 
coloração ser ou não-aceitável. As ações corretivas devem ser documentadas quando as colorações 
estiverem não-aceitáveis. 
 As ótimas colorações dependem da quantidade, da qualidade, e da tonalidade verdadeira dos 
corantes. A hematoxilina, um corante nuclear, deve ser avermelhada, azul, azul-escura, ou púrpura-
escura. Uma cor castanha significa excessiva oxidação da hematoxilina o que, geralmente, dá 
resultados de coloração insatisfatórios. A hematoxilina não deve bloquear a captura ou adulterar a cor 
dos contracorantes aplicados subsequentemente. Para a avaliação da qualidade da coloração nuclear, o 
núcleo das células intermediárias deve ser observado. A cromatina dos mesmos deve ser granular, 
nítida, distinta, e de cor púrpura-clara. O núcleo dos neutrófilos deve também ser utilizado para a 
avaliação da qualidade tintorial nuclear. Eles devem corar-se intensamente em azul-escuro a púrpura-
escuro e ter a cromatina com imagem bem nítida e distinta. 
 Os contracorantes Orange G e a Eosina-EA65 podem dar cores vívidas, transparência 
citoplasmática e contracoloração diferenciada. Nas células preservadas de modo ideal, várias cores 
citoplasmáticas diferentes são identificadas. A eosina Y dá a cor rósea-avermelhada às células 
escamosas maduras e cora o nucléolo em vermelho; o Verde Claro (Light-Green SF) cora em verde-
azulado as células metabolicamente ativas; e o Orange G cora em laranja ou amarelo o citoplasma 
queratinizado. 
 Fragmentos espessos de tecido ou células acumuladas em múltiplas camadas, algumas vezes 
apresentam uma penetração irregular do corante, resultando em cores que não são normalmente 
esperadas. Sempre que for possível, camadas mais finas de células são o desejável. Deve-se ter 
cuidado na avaliação da morfologia das células, evitando-se a apreciação superficial da coloração que, 
eventualmente, pode levar a uma avaliação diagnóstica errônea. 
 
 
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DESCOLORAÇÃO DE LÂMINAS 
 
 
PRINCÍPIOS 
 Ocasionalmente pode ser necessário descorar uma lâmina de citologia, seja para recolorir pelo 
método de Papanicolaou, seja para requerer uma coloração especial, que pode auxiliar no diagnóstico. 
 
 
MATERIAIS E SOLUÇÕES 
 Jarras de coloração 
 Xileno 
 Etanol a 100% 
 Álcool-ácido (HCl a 1% em etanol a 70%) 
 Banho azulador 
 Etanol a 95% 
 
 
PROCEDIMENTO 
 1. Coloque a lâmina na jarra de coloração contendo xileno e deixe a lamínula se destacar 
espontaneamente; não a puxe. As lâminas que estão montadas há muito tempo podem 
necessitar de vários dias para que a lamínula se solte. 
 2. Remova todos os traços do meio de montagem mergulhando a lâmina em xileno, fazendo 
2 trocas de 1 minuto cada. 
 3. Coloque a lâmina em etanol a 100%, fazendo 2 trocas de 1 minuto cada. 
 4. Coloque a lâmina no álcool-ácido até que a descoloração se complete. O tempo variará 
nesta etapa. 
 5. Mergulhe a lâmina no banho azulador de deixe por 3 ou 4 minutos. 
 6. Enxágue em água de torneira, fazendo 2 trocas. 
 7. Coloque a lâmina na jarra de coloração contendo etanol a 95%. A lâmina está agora pronta 
para ser recolorida pelo método de Papanicolaou ou por uma coloração especial. 
 
 
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MÉTODO DO CORANTE DIFF-QUIK 
 
PRINCÍPIOS 
 Este corante é comprado comercialmente e é um corante de Wright-Giemsa modificado. Foi 
originalmente idealizado para ser um método de coloração rápido para os esfregaços sanguíneos, 
porém também tem sido um corante de grande valor na avaliação de material citológico seco ao ar. 
 
SOLUÇÕES 
 Fixador de Diff-Quik 
 Solução I de Diff-Quik 
 Solução II de Diff-Quik 
 
PROCEDIMENTO 
1. Fixador de Diff-Quik...................................................5 gotas. 
 2. Solução I de Diff-Quik.........................................8 a 10 gotas. 
 3. Solução II de Diff-Quik.......................................8 a 10 gotas. 
 4. Água corrente de torneira....................................8 a 10 gotas. 
 5. Seque ao ar a lâmina corada. 
 6. Xileno.........................................................................5 gotas. 
 7. Montar em meio resinoso. 
 
 Recolorir as lâminas coradas pelo método Diff-Quik pode ser feito com bons resultados, se 
necessário. 
 
PROCEDIMENTO DE RECOLORAÇÃO 
 1. Coloque a lâmina no xileno e gentilmente remova a lamínula, enquanto a mesma vai 
soltando. 
 2. Imerja a lâmina em xileno limpo para remover todo o meio de montagem. 
 3. Seque completamente a lâmina ao ar. 
 4. Coloque a lâmina no fixador de Diff-Quik e deixe por 45 minutos. 
 5. Recolore com as soluções I e II acima especificadas. 
 
RESULTADOS 
 Veja a Figura 13, ao final do capítulo de técnica citopatológica. 
 
OBSERVAÇÃO 
Filtre a solução II diariamente ou antes de cada uso. Complete ou troque os corantes 
frequentemente. As lâminas coradas no Diff-Quik NUNCA devem ser colocadas numa 
superfície quente para secar lâminas. As lâminas coradas pelo Diff-Quik podem ser recoradas 
se o espécimen ficar hipercorado ou pouco corado. 
 
 
 
REFERÊNCIA 
GILL, G. & PLOWDEN, K.- Laboratory Cytopathology: Techniques for Specimen Preparation. 
Baltimore, Md, Johns Hopkins University Press, 1984. 
 
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MÉTODO DE COLORAÇÃO DE GIEMSA 
 
PRINCÍPIO 
 Este método é uma coloração do tipo-Romanovsky em uma etapa, que requer fixação, com o 
metanol, de esfregaços citológicos secos ao ar. 
 
SOLUÇÃO 
 Tampão fosfato 1/15M, pH 6,8 
 Solução A: 
 Na2HPO4.2H2O........................................................5,93 gramas. 
 Água destilada até o volume de...............................500 mililitros. 
 Solução B: 
 KH2PO4.....................................................................4,53 gramas. 
 Água destilada até o volume de..............................500 mililitros. 
 Solução tampão de trabalho, pH 6,8 
 Solução A.................................................................50 mililitros. 
 Solução B.................................................................50 mililitros. 
 Água destilada........................................................400 mililitros. 
 Ajuste o pH para 6,8 com a solução A ou B. 
 
 Corante de Giemsa 
 Giemsa (Merck)........................................................10 mililitros. 
 Solução tampão de trabalho.....................................90 mililitros. 
 
 Metanol 
 
 Xileno 
 
 Meio de montagem 
 
PROCEDIMENTO 
 1. Fixe as lâmina em metanol por 15 minutos. 
 2. Enxágue na solução de trabalho de tampão, pH 6,8. 
 3. Core no corante de Giemsa por 20 minutos. 
 4. Enxágue em água corrente de torneira até que a água fique clara. 
 5. Deixe secar ao ar. 
 6. Clarifique no xileno por 5 minutos. 
 7. Monte em meio resinoso. 
 
RESULTADOS 
 Veja a Figura 14, ao final do capítulo de técnica citopatológica. 
 
OBSERVAÇÕES 
 Dependendo do tipo de espécimen, diferentes tempos de coloração são aplicados. A maioria 
dos tipos celulares é corada em 20 minutos, porém os fluidos cérebroespinhais levam apenas 5 
minutos. 
 Os esfregaços devem estar bem secos ao ar, antes de serem fixados em metanol, pois a fixação 
com o metanol de esfregações incompletamente secos gera artefatos azuis no núcleo, que podem 
mimetizar nucléolo aumentado. 
 
 
 
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REFERÊNCIA 
LOPES CARDOZO, P.- Atlas of Clinical Cytology. Netherlands, Publisher Targa, Hertogenbosch, 
1976. 
 
REFERÊNCIAS ADICIONAIS SELECIONADAS 
BALES, C.E. & DURFEE, G.R.- Cytologic Techniques. In: KOSS, L.G.- Diagnostic Cytology and its 
Histopathologic Basis. 4
th
 ed., Philadelphia, Pa, JB Lippincott Company, 1992. pp.1452-1514. 
KEEBLER, C.M.- Cytopreparatory Tecniques. In: BIBBO, M. ed.- Comprehensive Cytopathology. 
Philadelphia, Pa, W.B. Saunders, 1991. pp. 881-906. 
 
 
 
AGRADECIMENTOS: Os autores gostariam de agradecer ao Dr. James Ownbey pela tomada das 
fotografias para as ilustrações. 
 
 
 
 
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