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REPLICAÇÃO DE DNA Universidade Federal de Pelotas Centro de Biotecnologia Graduação em Biotecnologia Conteúdo... - Replicação do DNA e ciclo celular; -Origem de Replicação; -Mecanismos básicos de replicação - Fases da replicação *Início *Alongamento *Término GENÉTICA BACTERIANA - O DNA bacteriano é circular; - O cromossomo de E. coli, por exemplo, contém cerca de 4 milhões de pares de bases e é aproximadamente 1000 vezes mais longo que a célula. Escherichia coli1 2 3 4 Replicação do DNA x Ciclo Celular TEMPO DE GERAÇÃO: 20 MINUTOS Replicação do DNA x Ciclo Celular “O ciclo de replicação e início da formação do septo ocorrem bem antes do processo de divisão” Origem de Replicação em bactérias: Somente origens completamente metiladas podem iniciar a replicação - Metilação – DNA hemi-metilado - Ligação física com a membrana - Garante que a origem será ativada uma vez por ciclo Replicação do DNA x Ciclo Celular Replicação do DNA x Ciclo Celular Região do DNA onde a replicação começa Origens de procariotos e eucariotos – ricas em AT Procariotos, plasmídeos e vírus - uma origem Eucariotos – várias origens E. coli – região de 245 pb essencial à replicação 4 seqüências de 9 pb - TTAT(C/A)CA(C/A)A 3 seqüências de 13 pb ricas em AT INÍCIO DA REPLICAÇÃO - ORIGEM Processo de início da replicação 1- Complexo inicial 52 kDa autocooperação 2- Complexo aberto 3- Complexo pré- priming HU e IHF DnaB - helicase Proteínas presentes na origem de replicação de E. coli DnaA Reconhece a origem e abre a dupla fita em sítios específicos DnaB (helicase) Desenrola o DNA DnaC Auxilia a ligação de DnaB na origem HU Proteína do tipo histona que estimula a iniciação Primase (DnaG) Sintetiza os primers de RNA Single strand binding (SSB) Liga a fita simples de DNA DNA polimerase Facilita a ação da DnaA DNA girase Alivia a tensão torsional gerada pela abertura da dupla-fita Dam Metilase Metila as sequências GATC na OriC • Processo semiconservativo • Início da replicação - Origem • Movimento da forquilha de replicação – Unidirecional ou bidirecional • Direção da replicação – 5’ 3’ • Semi-descontinuidade da replicação • O processo pode ser dividida em: - Inicio da replicação - Forquilha de replicação - Terminação Regras básicas do processo de replicação A replicação do DNA é semi-conservativa? A replicação do DNA é semi- conservativa Experimento realizado por Meselson & Stahl em 1958 Cultivo em meio 14NH4Cl Cultivo em meio 15NH4Cl Purificação do DNA seguida de centrifugação em gradiente de CsCl Replicação do DNA Semi-conservativa Replicon: Unidade do DNA onde está ocorrendo um evento de replicação 1. Origem + Término 2. Durante um ciclo celular, a origem de replicação pode ser ativada mais de uma vez em procariotos e uma vez em eucariotos 3. O cromossomo de uma célula procariótica constituem um único replicon 4. Cada cromossomo eucariótico constitue vários replicons INÍCIO DA REPLICAÇÃO A replicação é vista como um “olho” flanqueado por DNA não replicado O genoma bacteriano circular constitue um único replicon A velocidade da forquillha de replicação bacteriana é 50000pb/min Um única origem de replicação em E.coli (OriC, 245 pb) O genoma eucariótico constitue vários replicons A velocidade da forquillha de replicação eucariótica é 2000 pb/min Os replicons eucarióticos tem 40-100 kb e são iniciados em tempos diferentes Fase S demora ~ 6 h em uma célula somática A replicação é bidirecional em procariotos MOVIMENTO DA FORQUILHA DE REPLICAÇÃO Unidirecional ou bidirecional A replicação é unidirecional em eucariotos DIREÇÃO DA REPLICAÇÃO A adição dos nucleotídeos para o alongamento da cadeia é SEMPRE no sentido 5’-3’ SEMI-DESCONTINUIDADE DA REPLICAÇÃO A replicação ocorre de maneira contínua em uma das fitas e descontínua na outra fita Replicação do DNA • Procariotos - Genes menores - Cromossomo circular - Bidirecional - UMA ORIGEM • Eucariotos - Genes e cromossomos maiores - Unidirecional - VÁRIAS ORIGENS ENZIMAS QUE PARTICIPAM DA REPLICAÇÃO DO DNA • Helicases (DnaB) • DNA Polimerase • Primase • SSB (Single Strand Binding Protein) • Topoisomerases • DNA ligase PROTEÍNAS PRESENTES NA FORQUILHA DE REPLICAÇÃO DE E. COLI SSB Liga a fita simples de DNA DnaB (helicase) Desenrola o DNA Primase (DnaG) Sintetiza os primers de RNA DNA Polimerase III Sintese da fita nova DNA Polimerase I Preenche as lacunas e remove os primers DNA Ligase Liga os fragmentos DNA girase Superenrolamento DNA POLIMERASES E PRIMASES As DNA-polimerases sempre requerem um iniciador previamente pareado ao molde que será copiado Atividade revisora 3’ 5’ garante a fidelidade da replicação DNA POLIMERASES E. coli - DNA Polimerase I # polipeptídeo de 928 aa, replicação e reparo de DNA Propriedades das DNA-polimerases Bacterianas Pol I PolII PolIII Polimerização 5’ 3’ + + + Exonuclease 3’ 5’ + + + Exonuclease 5’ 3’ + - - Número de subunidades 1 4 10 Tamanho em kDa 103 90 ~900 Velocidade de Polimerização(nt/seg) 16-20 40 250-1000 Eucariotos - DNA polimerases - primase e - reparo do DNA - replicação do genoma nuclear - replicação do DNA mitocondrial Bacteriófagos - T4 DNA Polimerase Outras - Taq DNA polimerase (Thermus aquaticus) Pfu DNA polimerase (Pyrococcus furiosus) DNA POLIMERASES Forquilha de Replicação A síntese do DNA é semi-descontínua e requer um iniciador (primer) de RNA Fita contínua Fita descontínua Síntese da Fita descontínua Síntese da Fita Contínua REPLICAÇÃO DO DNA Fita contínua (líder) Fita descontínua Fragmentos de Okazaki: 1000 a 2000 nt (PROCARIOTOS) 100 a 200 nt (EUCARIOTOS) REPLICAÇÃO DO DNA Fragmentos de Okasaki ocorrem na fita descontínua A DNA polimerase III é responsável pela síntese da maior parte do DNA A DNA polimerase I remove o primer de RNA e preenche as lacunas A DNA ligase sela as quebras Síntese das fitas contínua e descontínua é independente A DNA ligase sela as quebras REPLICAÇÃO DO DNA O complexo de replicação A proteína DNA B (helicase) é responsável pelo movimento para frente da forquilha Cada core catalítico da DNA PolIII sintetiza uma das fitas-filhas O primossomo afasta uma das fitas molde Proteínas SSB mantem as fitas parentais separadas REPLICAÇÃO DO DNA Da origem ao término da replicação REPLICAÇÃO DO DNA PROVA 09/09 - Estrutura dos Ácidos Nucléicos - Organização Gênica de Procariotos - Organização Gênica de Eucariotos - Replicação do DNA - PCR Problema!!! Término da replicação- genomas lineares REPLICAÇÃO DE DNA LINEAR: o modelo demonstra o surgimento de extremidades não pareadas após a remoção dos primers no final da replicação Término da Replicação • Formação de Concatâmeros Término da replicação • Telômeros Retrovírus
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