PCR tempo real

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Prof. Vinicius Campos
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PCR convencional – géis agarose
Pobre precisão
Baixa sensibilidade
Colorações não são muito quantitativas
Resultados não são expressos em números
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PCR em tempo real
(método quantitativo) 
Sistema baseado na detecção e quantificação de um sinal fluorescente
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Vantagens
Não utiliza gel 
Amplificação monitorada em tempo real
Requer 1000 vezes menos DNA
Detecção de alteração menor que 2x
Mais específico, sensível e reproduzível
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E aí?
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É o nível de fluorescência que as amostras podem ser comparadas 
É o ciclo onde a amostra encontra o threshold 
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SERIES OF 10-FOLD DILUTIONS
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Threshold
Ct
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Como detectar fluorescência na PCR?
SYBR Green Detection
 - corante que se intercala na dupla fita
 
 - mais barato
 - mais utilizado
 - ótimos resultados
 - não específico
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SYBR Green detection
Desnaturação
Anelamento
Extensão
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CURVA DE DISSOCIAÇÃO
Fragmento de interesse
Fragmento contaminante
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CURVA DE DISSOCIAÇÃO
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TaqMan probe detection
Baseado na quebra de sondas marcadas e liberação de fluorescência
 - Altamente específico
 - Ótimos resultados
 - Mais caro
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Análise dos dados
Depende da aplicação da qPCR 
 - Expressão gênica (RNA)
 - Diagnóstico (Vírus, OGMs)
 - Genotipagem por SNP 
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2°) RT-PCR 
(Transcriptase Reversa)
1°) Extração de RNA
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Real-Time PCR
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