Aula Padrões microbiológicos

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Métodos de análise e padrões microbiológicos. 
Jammily Moreira
Universidade Federal de Alagoas
Faculdade de Nutrição 
Mestrado em Nutrição
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Por que analisar quais e quantos microorganismos estão nos alimentos?
Condições de higiene do preparo.
Riscos à saúde do consumidor.
Esse alimento terá vida útil pretendida?
Verificar conformidade com os padrões.
Por que analisar quais e quantos microorganismos estão nos alimentos?
Métodos de análise
 Métodos “convencionais” X Métodos “rápidos”.
Convencionais desenvolvidos há muitos anos, descritos em publicações de referências e oficiais na maioria dos laboratórios .
Rápidos Desenvolvidos a partir de 1970, simplificam o trabalho e reduzem os custos, são mais sensíveis e específicos.
Amostragem
Amostragem
Amostragem
Amostragem
Amostragem
Amostragem
Amostragem
Obtenção correta das amostras 
 Representativa, íntegra e identificada.
Transporte para o laboratório Análise em até 36 horas e perecíveis e refrigerados mantidos entre 0° e 4,4°C
Mínimo de 200g /ml (25g, 50g ou 100g);
Técnicas assépticas;
Homogeneização com diluente apropriado.
Preparação da amostra para análise
Vantagens do Stomacher:
Não forma aerossóis;
Não gera calor;
Saco descartável (incubação)
Desvantagem:
Sacos não resistentes;
Meio ambiente.
Preparação da amostra para análise
Métodos diretos:
Baseados na multiplicação bacteriana, visualização de colônias em meios sólidos ou turvação de meio em meios líquidos.
Métodos indiretos:
Estima o número de microorganismos em parâmetros diferentes da multiplicação.
Métodos de contagem de Microorganismos
Métodos diretos:
Contagem por plaqueamento;
Determinação do Número mais provável.
Métodos de contagem de Microorganismos
Método convencional
Plaquea-se alíquotas do alimento homogeneizado e suas diluições em diferentes meios de cultura e emprega-se diferentes condições (“Spar”).
Contagem por plaqueamento
Contagem por plaqueamento
Contagem por plaqueamento
Contagem por plaqueamento
Pour plate
Em superfície
Plaqueamento em espiral:
Sistema automatizado;
Succiona a amostra;
Faz a semeadura da amostra sobre uma placa giratória;
Contagem manual ou automática à laser
Conta de 1 a 1000 colônias em uma única placa! 
Contagem por plaqueamento
Técnica de membrana filtrante:
Contagem por plaqueamento
Contagem por plaqueamento
Placas de Petrifilm:
Método mais avançado;
Cartões de papel revestidos de meio, corantes e gelificastes desidratados;
Prontas para uso;
Inocular 1 ml da amostra diluída e incubar;
Contagem feita visualmente na placa;
Usada também no monitoramento de ambientes.
Contagem por plaqueamento
 Placas de Petrifilm:
Contagem por plaqueamento
Técnica dos tubos múltiplos
Muito utilizada para estimar quantidade de coliformes totais, coliformes fecais, E. coli e S. aureus;
Diluições decimais seriadas;
Alíquotas transferidas para grupos de 3 ou 5 tubos, com meio escolhido e tubo Durhan para coleta de gás;
Incubados e positivos identificados.
Determinação do Número Mais Provável
Desvantagens
Resultados imprecisos (estimativa);
Uso de dois ou três meios diferentes;
Análise longa (vários dias).
Determinação do Número Mais Provável
Métodos indiretos:
Técnica de impedância;
Técnicas de bioluminescência;
Microcalorimetria;
Radiometria.
Métodos de contagem de Microorganismos
 
Baseia-se na propriedade que os microorganismos tem de alterar a transmissão da corrente elétrica através de um meio de cultura, muito utilizado para detectar Salmonella, Listeria e E. coli.
Ex: Rabit, Malthus e Bactometer.
Técnica de impedância
Baseada no número de ATP (trifosfato de adenosina), que está relacionado ao número de células metabolicamente ativas.
O ATP reage com o sistema luciferina-luciferase e emite luz medida por luminômetro.
Venda de kits.
Atenção !!!
Alimentos cárneos e leite tem ATP extra celular e precisam ser hidrolisados com aspirase.
Técnicas de bioluminescência
Aparelhos muito sensíveis medem o calor gerado pela multiplicação dos organismos;
Técnica rápida, mas que ainda precisa de maiores estudos na área de alimentos.
Microcalorimetria
 Técnica muito sensível que consiste em monitorar a produção de CO2 radioativo após suplementação do caldo com substrato radioativo (glicose, glutamato e etc.);
A quantidade de CO2 radioativo liberado é proporcional ao número de microorganismos presentes.
Atenção!!! As dificuldades de trabalho com isótopos radioativos têm limitado sua utilização.
Radiometria
Semeadura em meio próprio para isolamento e testes complementares (bioquímicos) para identificação.
Novos métodos:
 • Técnicas bioquímicas miniaturizadas;
 • Técnicas imunológicas;
 •Técnicas genéticas.
Isolamento e identificação de microorganismos patogênicos
Isolamento e identificação de microorganismos patogênicos
Isolamento e identificação de microorganismos patogênicos
 kits comerciais que fazem as reações bioquímicas de maneira rápida e eficiente, alguns com interpretação baseada em combinação de números ou com softwares que facilitam a identificação.
Técnicas bioquímicas miniaturizadas
Baseados em reação antígeno-anticorpo;
Podem ser :
Imunocaptura, imunoenzimática e imunoimobilização.
Técnicas imunológicas
 Reação de Polimerase em Cadeia (PCR)
 Multiplica-se um único fragmento de DNA milhares de vezes em poucas horas (exponencial);
Usa-se a enzima DNA polimerase;
O início da cópia se dá através de dois nucleotídeos iniciadores (primers);
Técnicas genéticas
Ciclo 
Desnaturação do DNA – separação em fita simples;
Anelamento – Ligamento dos primers;
Polimerização – formação de fita complementar
Reação de Polimerase em Cadeia 
Reação de Polimerase em Cadeia 
Visualização em gel de agarose
Precisão;
Custo;
Tempo da análise;
Recursos;
Aceitabilidade do método pelos órgãos oficiais.
Atenção!!! Controle de qualidade laboratorial.
Considerações na escolha do método
Visando a proteção à saúde da população
Considerando a definição de critérios e padrões microbiológicos para alimentos, indispensáveis para a avaliação das Boas Práticas de Produção de Alimentos e Prestação de Serviços;
Importância de compatibilizar a legislação nacional com regulamentos harmonizados no Mercosul;
RESOLUÇÃO-RDC Nº 12, DE 02 DE JANEIRO DE 2001 
 ALCANCE 
 OBJETIVO : Estabelecer os Padrões Microbiológicos Sanitários para Alimentos e determinar os critérios para a Conclusão e Interpretação dos Resultados das Análises Microbiológicas de Alimentos.
ÂMBITO DE APLICAÇÃO : Aplica aos alimentos destinados ao consumo humano. Excluem-se os produtos alimentícios e as toxinas de origem microbiana, definidos em legislação especifica. Excluem-se também matérias-primas alimentares e os produtos semi-elaborados.
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CRITÉRIOS PARA O ESTABELECIMENTO DE PADRÕES 
 Caracterização dos microrganismos de interesse sanitário. 
Classificação dos alimentos segundo o risco epidemiológico. 
Métodos de análise que determinem os microrganismos .
Plano de Amostragem.
Normas e padrões de organismos internacionalmente reconhecidos, Codex Alimentarius e outros organismos.
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PROCEDIMENTOS E INSTRUÇÕES GERAIS 
As metodologias devem obedecer ao disposto pelo Codex Alimentarius.
Caso sejam utilizados outros métodos laboratoriais, ou modificações, os mesmos devem ser validados por estudos comparativos intra e inter laboratoriais que certifiquem os resultados e sejam equivalentes aos das metodologias citadas. 
 Colheita de amostra em suas embalagens originais não violadas e quantidade mínima de 200gou 200mL por unidade amostral.
Amostras deterioradas ?
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PROCEDIMENTOS E INSTRUÇÕES GERAIS 
A amostra deve ser enviada ao laboratório devidamente identificada e em condições adequadas para análise e ser avaliada quanto a possibilidade de ser utilizada.
Amostra implicada em casos de DTA deve vir acompanhada de relatório adicional com informações que permitam direcionar a determinação analítica pertinente. 
Planos de amostragem ?
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PROCEDIMENTOS E INSTRUÇÕES GERAIS 
Considerações sobre os grupos de microrganismos pesquisados :
"coliformes a 45ºC" é equivalente à denominação de "coliformes de origem fecal" e de "coliformes termotolerantes".
Determinação de clostrídio sulfito redutor a 460C tem por objetivo a indicação de Clostridium perfringens. 
A enumeração de estafilococos coagulase positiva tem por objetivo substituir a determinação de Staphylococcus aureus. 
Resultados por contagem em placa devem ser expressos em UFC/ g e indicar NMP/ g ou mL , quando forem obtidos por esta metodologia. 
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PROCEDIMENTOS E INSTRUÇÕES GERAIS 
O resultado da determinação de Salmonella sp, Listeria monocytogenes deve ser expresso como Presença ou Ausência na alíquota analisada.
Na elucidação de DTA, os resultados devem especificar o número de células viáveis do microrganismo. Os valores padrões não se aplicam para o diagnostico de caso/surto de DTA. 
Em situações de risco epidemiológico que justifique um ALERTA SANITÁRIO, podem ser realizadas outras determinações não incluídas nos padrões estabelecidos.
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A tolerância é máxima e os padrões são mínimos para os diferentes grupos de produtos alimentícios.
No caso de análise de produtos não caracterizados nas tabelas, considera-se a similaridade da natureza e do processamento do produto, como base para seu enquadramento nos padrões estabelecidos para um produto similar
Padrões Microbiológicos Sanitários para Alimentos 
RESOLUÇÃO-RDC Nº 12, DE 02 DE JANEIRO DE 2001 
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Interpretação dos resultados: Para interpretação dos resultados, compara-se os valores encontrados nas análises realizadas com os valores estabelecidos.
Produtos em condições sanitárias satisfatórias são aqueles cujos resultados analíticos estão abaixo ou igual aos estabelecidos . 
Produtos em condições sanitárias insatisfatórias:
 são aqueles cujos resultados analíticos estão acima dos limites estabelecidos para amostra indicativa ou amostra representativa ou demonstram a presença ou a quantificação de outros microrganismos patogênicos ou toxinas que representem risco à saúde do consumidor.
CONCLUSÃO E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
"PRODUTO OU LOTE DE ACORDO COM OS PADRÕES LEGAIS VIGENTES" para as situações... 
2.2."PRODUTO OU LOTE IMPRÓPRIO PARA O CONSUMO HUMANO POR APRESENTAR ..." (citar o(s) resultado(s) analítico(s) e o(s) parâmetro(s) não atendido(s) para as situações ...
2.3."PRODUTO OU LOTE IMPRÓPRIO PARA O CONSUMO HUMANO POR APRESENTAR ....(microrganismo patogênico ou toxina que representa perigo severo a saúde do consumidor).
Laudos 
Padrões microbiológicos e métodos de análise. 
Jammily Moreira
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Faculdade de Nutrição 
Mestrado em Nutrição
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